基于多指標(biāo)成分含量測定的肺寧合劑與中藥配方顆粒比較

沈 申,嚴(yán)寶飛,陳亞運(yùn),戴仕林,劉圣金,朱星宇,劉 嘉,富瑩雪

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 制劑部,江蘇 南京 210009;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;3.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)院,江蘇 南京 211800)

肺寧合劑是江蘇省中醫(yī)院的特色醫(yī)院制劑,由麻黃、苦杏仁、甘草、前胡、桔梗、瓜蔞皮及枇杷葉合用,具有疏風(fēng)達(dá)邪、宣肺化痰和降逆止咳之功效。全方宣中有降、散中寓清,俾宣降有致及溫潤有度,頗合肺臟之性；并且不偏寒熱,適應(yīng)證較廣,主要用于急性支氣管炎、上呼吸道感染、慢性支氣管炎急性發(fā)作及感冒后咳嗽等[1-2]。自20世紀(jì)70年代投入使用以來,經(jīng)臨床數(shù)以萬計的病例驗(yàn)證,其治療效果滿意,每年可為數(shù)十萬病人解除病痛[3-5]。

中藥配方顆粒是一種新型的中藥飲片,主要由單味飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥及制粒加工而成,具有質(zhì)量穩(wěn)定、規(guī)范及攜帶方便和服用簡單等諸多優(yōu)點(diǎn),在中醫(yī)臨床上正逐漸成為傳統(tǒng)飲片的藥劑補(bǔ)充。但是,配方顆粒的服用方法為直接開水沖服,與傳統(tǒng)湯劑相比,缺少了組方藥物“共煎”的過程。因此,其與傳統(tǒng)飲片在化學(xué)成分、臨床功效方面的一致性等方面亟待深入研究[6-9]。

廣義的化學(xué)成分是中醫(yī)方劑發(fā)揮其功效的物質(zhì)基礎(chǔ)[10],中藥化學(xué)成分種類、含量與中藥功效多樣性聯(lián)系緊密,本研究選擇肺寧合劑中的君藥(麻黃、苦杏仁和甘草)以及臣藥(前胡)中的麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種與其臨床功效密切相關(guān)的指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定[11-14],從物質(zhì)基礎(chǔ)角度直觀比較傳統(tǒng)飲片與配方顆粒之間的異同。中藥及其組方中化學(xué)成分可通過多種途徑,作用于多個靶點(diǎn),影響多個生物學(xué)功能及通路參與疾病的治療[15],且中藥及其組方中化學(xué)成分的“量”與“效”關(guān)系密切[16],故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討二者含量差異顯著的指標(biāo)成分的作用途徑和通路,希望從分子機(jī)制水平闡述含量差異對肺寧合劑對相關(guān)疾病的治療影響,以期對中藥配方顆粒進(jìn)一步研究與應(yīng)用以及肺寧合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供一定的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜系統(tǒng),美國Waters公司;BT25S十萬分之一電子天平,德國Sartorius公司;As3120型超聲波清洗器,天津奧特賽恩斯儀器有限公司;Anke GL-16g2型離心機(jī),上海安亭儀器廠;RE-201d型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)系統(tǒng),上海保玲儀器設(shè)備廠。

1.2 藥材與試劑

1.2.1 藥材

對照品麻黃堿(批號:171237-201208)、偽麻黃堿(批號:171241-201007)，苦杏仁苷(批號:110820-201607)，甘草苷(批號:131704-201605)，甘草酸(批號:110731-201317)，白花前胡甲素(批號:112112-201203)，白花前胡乙素(批號:111904-201203),中國食品藥品檢定研究院,含量均大于98%,化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 7種指標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

炙麻黃飲片(批號:1706144)，安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片公司；甘草飲片(批號:1708142)、苦杏仁飲片(批號:1708146)、桔梗飲片(批號:1707136)、瓜蔞皮飲片(批號:1705089)、前胡飲片(批號:1706189)、炙枇杷葉飲片(批號:1701105)，安徽井泉中藥飲片有限公司;炙麻黃顆粒(批號:1707142)、甘草顆粒(批號:1710138)、苦杏仁顆粒(批號:1708145)、桔梗顆粒(批號:1801002)、瓜蔞皮顆粒(批號:18010371)、前胡顆粒(批號:1710145)、炙枇杷葉顆粒(批號:1707003),自制。以上7種中藥飲片均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉圣金教授鑒定,分別為草麻黃(EphedrasinicaStapf)的干燥草質(zhì)莖,甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根和根莖,山杏(Prunusarmeniaca(L.)Lam.)的干燥成熟種子,桔梗(Platycodongrandiflorus(Jacq.))A.DC.的干燥根,栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)的干燥成熟果皮,白花前胡(PeucedanumpraeruptorumDunn)的干燥根,枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.)的干燥葉。

1.2.2 試劑

乙腈(C2H3N),美國TEDIA公司；H3PO4,美國ACS公司;H2O為超純水,蘇州Milli-Q純水機(jī)自制。

1.3 方法

1.3.1 肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑的制備

將一定量的炙麻黃飲片、甘草飲片、苦杏仁飲片、桔梗飲片、瓜蔞皮飲片、前胡飲片和炙枇杷葉飲片置于密閉容器中,加入8倍量H2O,靜置30 min后煎煮40 min,過濾,濾渣繼續(xù)用6～8倍H2O煎煮40 min,合并濾液,濃縮至250 mL,即得。

1.3.2 中藥配方顆粒湯劑的制備

精密稱取相當(dāng)于肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑中各原藥材的中藥配方顆粒,適量混合后，加入一定量的沸水,攪拌溶解,冷卻至室溫,定容至250 mL,即得。

1.3.3 供試品溶液的制備

精密吸取肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑各4 mL至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,超聲30 min,冷卻,補(bǔ)足甲醇至刻度,搖勻,離心10 min(取上清,13 000 r/min)后,過0.45 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

1.3.4 對照品溶液的制備

分別精密稱取麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素對照品適量,加甲醇制成分別含上述對照品446.5、365.1、1 231.8、550.2、682.2、53.5和43.2 μg/mL的混合對照品溶液,分別稀釋2、4、8、16和32倍備用。

1.3.5 色譜條件

色譜柱為Thermo-C18endcapped(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)H3PO4-H2O-C2H3N(B),梯度洗脫(0～10 min,5%B;10～30 min,5% ～10%B;30～50 min,10% ～15%B;50～70 min,15% ～22%B;70～75 min,22% ～30%B;75～95 min,30%～60%B;95～105 min,60% ～80%B;105～115 min,80% ～95%B;115～120 min,95%～5%B),柱溫為30 ℃,檢測波長為210 nm,流速為0.8 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.6 線性關(guān)系的考察

準(zhǔn)確移取1.3.4節(jié)中7種對照品制成的混合對照品溶液,按照1.3.5節(jié)中的色譜條件進(jìn)樣,記錄7種指標(biāo)成分色譜峰的峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),得出線性關(guān)系。依據(jù)信噪比計算檢測限(LOD)、定量限(LOQ)。

1.3.7 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取1.3.4節(jié)中7種對照品制成的混合對照品溶液,按照1.3.5節(jié)中的色譜條件進(jìn)樣，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，在連續(xù)3 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄7種指標(biāo)成分色譜峰的峰面積,計算7種指標(biāo)成分的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑樣品6份,按照1.3.3節(jié)中的方法，制備供試品溶液,按照1.3.5節(jié)中的色譜條件，在0、3、6、9、12和24 h進(jìn)樣,記錄7種指標(biāo)成分色譜峰的峰面積,計算7種指標(biāo)成分的RSD。

1.3.9 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑樣品6份,按照1.3.3節(jié)中的方法制備供試品溶液,按照1.3.5節(jié)中的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣,記錄7種指標(biāo)成分色譜峰的峰面積,計算7種指標(biāo)成分峰面積的RSD。

1.3.10 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法(按體積比1∶1加入,下同),精密量取肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑2 mL,至10 mL量瓶中,精密加入各對照品適量,按照1.3.3節(jié)中的方法制備供試品溶液,平行制備6份。按照1.3.5節(jié)中的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣,計算7種成分的平均回收率和RSD。

1.3.11 樣品指標(biāo)成分含量的測定

準(zhǔn)確量取1.3.3節(jié)中制備的肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑供試品溶液,按照1.3.5節(jié)中的色譜條件進(jìn)樣,每份樣品進(jìn)樣3次，取平均值，記錄麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種指標(biāo)成分的含量。

1.3.12 差異成分作用靶點(diǎn)的獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php),以1.3.11節(jié)中得出的差異成分為關(guān)鍵詞檢索作用靶點(diǎn)。登錄蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt(http://www.uniprot.org/),設(shè)置物種為“人”的UniProt KB數(shù)據(jù),利用perl語言工具(http://www.perl.org/)校正預(yù)測的靶點(diǎn)名稱。

1.3.13 差異成分作用靶點(diǎn)的生物功能注釋及通路分析

將1.3.11節(jié)獲取的作用靶點(diǎn)的編碼基因?qū)隑ioconductor生物信息軟件包(http://www.bioconductor.org/),以P<0.05進(jìn)行基因本體論(GO)功能注釋及基因的基因組百科會書(KEGG)通路富集分析,得到差異成分作用靶點(diǎn)的主要生物功能和過程及其發(fā)揮中醫(yī)臨床功效可能性較大的通路。

2 結(jié)果與討論

為盡可能全面地反映肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑與中藥配方顆粒湯劑中的化學(xué)成分信息,本研究對流動相系統(tǒng)中H3PO4-C2H3N、甲酸水-C2H3N、H3PO4-甲醇和甲酸水-甲醇進(jìn)行了比較,結(jié)果以H3PO4-C2H3N為流動相系統(tǒng)干擾小、色譜峰分離效果較好。本研究亦對H3PO4-H2O的體積比(0.05%、0.1%和0.2%)進(jìn)行考察,結(jié)果表明：體積分?jǐn)?shù)0.1%H3PO4-H2O能較好地改善峰形。因此,本研究確定以體積分?jǐn)?shù)0.1%H3PO4-H2O-C2H3N為流動相系統(tǒng)。對洗脫程序進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)7種指標(biāo)成分可分為生物堿類、苷類、黃酮類、三萜類和香豆素類5類化合物,結(jié)構(gòu)和類型差異明顯,本研究確定的梯度洗脫程序色譜信息豐富且指標(biāo)成分均達(dá)到基線分離。對樣品進(jìn)行紫外-可見波長(190～400 nm)掃描。結(jié)果顯示：麻黃堿、偽麻黃堿僅在210 nm有紫外吸收,此時苦杏仁苷亦有最大紫外吸收,甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素紫外吸收也較強(qiáng)。因此,本研究確定的檢測波長為210 nm。對柱溫(20、25、30和35 ℃)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示：當(dāng)柱溫升高時,色譜峰的保留時間會發(fā)生前移,當(dāng)柱溫達(dá)到35 ℃時,基線不能完全分離。因此,綜合考慮保留時間及分離度等因素,本研究確定以30 ℃為柱溫。

2.1 高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)分析結(jié)果

混合對照品溶液、肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑、中藥配方顆粒湯劑的高效液相色譜圖見圖2。由圖2可知：麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種指標(biāo)成分的保留時間分別為16.2、18.3、33.6、57.9、87.1、103.7和109.4 min;肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑在相同保留時間基本均有共有峰,但共有峰峰面積存在差異,即肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑在化學(xué)組成上差異不大,但含量上存在差異。

圖2 混合對照品、肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑的HPLC-UV色譜

2.2 線性關(guān)系的考察結(jié)果

麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種指標(biāo)成分線性關(guān)系考察結(jié)果見表1。由表1可知：7種指標(biāo)成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,可用于準(zhǔn)確定量。

表1 7種指標(biāo)成分的線性關(guān)系

2.3 方法學(xué)的考察結(jié)果

麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種指標(biāo)成分的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率結(jié)果見表2。由表2可知：本研究建立的方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率。

表2 7種成分精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品指標(biāo)成分含量的測定結(jié)果

肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑中麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素成分含量見表3。由表3可知：肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑中均含有麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素，但含量存在差異。肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑中的麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷含量顯著性大于中藥配方顆粒湯劑,而苦杏仁苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量在兩者間無顯著性差異。

表3 肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑中7種成分含量的測定結(jié)果(n=3)

2.5 差異成分作用靶點(diǎn)的獲取結(jié)果

肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑中的差異成分麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷在TCMSP數(shù)據(jù)庫對應(yīng)的作用靶點(diǎn)為24個,結(jié)果見表4。由表4可知：差異成分麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷可能通過多種作用靶點(diǎn)造成肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑的臨床療效的差異。

表4 差異成分作用靶點(diǎn)

2.6 差異成分作用靶點(diǎn)的生物功能注釋及通路分析

本研究借助R語言,運(yùn)用“clusterProfiler”程序包,利用Bioconductor提供的GO注釋信息和KEGG通路數(shù)據(jù)庫獲取富集分析結(jié)果。由GO功能分析獲得63個條目,其中具有顯著意義的有48個條目(P<0.01),采用P值和基因富集數(shù)量綜合過濾,對其進(jìn)行排序,取排名前20的條目,結(jié)果見圖3。由圖3可知:差異成分作用靶點(diǎn)富集顯著的生物學(xué)功能主要為G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結(jié)合,提示差異成分麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷可能通過多種生物學(xué)途徑造成肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑的臨床療效差異。

圖3 差異成分作用靶點(diǎn)GO功能分析結(jié)果

KEGG通路富集分析共獲得9條通路,具有顯著意義的有2條通路(P<0.01),采用P值和基因富集數(shù)量綜合過濾,對其進(jìn)行排序,結(jié)果見表5。由表5可知:差異成分作用靶點(diǎn)基因顯著富集在信號通路為cGMP-PKG信號通路、鈣信號通路,提示差異成分麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷可能通過cGMP-PKG信號通路、鈣信號通路引起肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和中藥配方顆粒湯劑的臨床療效差異。

表5 差異成分作用靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果

3 結(jié)論

采用的中藥配方顆粒的生產(chǎn)原料來源與實(shí)驗(yàn)中采用的飲片藥材一致,可以消除不同批次、不同產(chǎn)地藥材之間的品質(zhì)差異帶來的影響,保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性。

本研究建立的HPLC-UV法精密度高、重復(fù)性好,系統(tǒng)分析了江蘇省中醫(yī)院特色制劑肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑與中藥配方顆粒湯劑化學(xué)成分的相似性,首次同時對其中與肺寧合劑臨床功效密切相關(guān)的麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7種指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析,從功效物質(zhì)基礎(chǔ)角度全面評價二者之間的異同,發(fā)現(xiàn)二者化學(xué)組成上差異不大,但含量存在差異,其中肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑中的麻黃堿、偽麻黃堿和甘草苷含量顯著性大于配方顆粒湯劑,3個差異成分可通過干預(yù)24個靶點(diǎn)、9條通路引起肺寧合劑傳統(tǒng)飲片湯劑和配方顆粒湯劑臨床療效的差異。說明用中藥配方顆粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)飲片生產(chǎn)的肺寧合劑的可行性還需要被進(jìn)一步論證,提示未來將在中藥配方顆粒的提取工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)上進(jìn)行進(jìn)一步的提升以及在傳統(tǒng)復(fù)方湯劑的化學(xué)成分、臨床功效方面的一致性上還需繼續(xù)進(jìn)行深入的研究。