基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析原料乳冷藏 過程中脂類代謝組學(xué)

李璞鈺，劇 檸，羅玉龍，王媛媛，茍 萌

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

原料乳富含多種天然成分，易被微生物分解利用。在多數(shù)國家中，原料乳擠出后并不立即加工，需進(jìn)行冷藏，整個(gè)過程可能長達(dá)6～7 d[1-2]。4 ℃冷藏可有效抑制微生物生長，降低生化反應(yīng)速率，減緩原料乳品質(zhì)劣變。但隨冷藏期的延長，原料乳仍會發(fā)生脂類氧化、蛋白質(zhì)變性等多種化學(xué)反應(yīng)，從而造成酸度、黏度的增加及絮狀物的出現(xiàn)，最終導(dǎo)致原料乳腐敗[3]。其原因與原料乳中微生物特別是嗜冷微生物的種類和數(shù)量密不可分[4-6]，課題組前期對4 ℃冷藏7 d的原料乳菌群數(shù)量及多樣性展開研究，發(fā)現(xiàn)冷藏3 d和6 d時(shí)微生物菌群構(gòu)成較之前發(fā)生了顯著改變。冷藏3 d優(yōu)勢菌群從不動桿菌、鏈球菌、梭菌屬向假單胞菌、黃桿菌屬演替，冷藏6 d優(yōu)勢菌群又轉(zhuǎn)變?yōu)椴粍訔U菌及乳球菌屬；而原料乳冷藏2 d和5 d菌群變化趨勢不顯著[7-8]。菌群多樣性的復(fù)雜變化決定了乳代謝物逐步改變直至原料乳宏觀的品質(zhì)劣變，無法用于加工。

非靶向代謝組學(xué)是檢測生物體整體水平代謝特征的組學(xué)技術(shù)應(yīng)用，通過使用大規(guī)模、高通量技術(shù)對涉及樣品的內(nèi)源性代謝物進(jìn)行全局性分析，盡可能多地定性和相對定量生物體系中的代謝物[9-10]。超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)相較于其他代謝組學(xué)檢測技術(shù)，在峰容量、靈敏度、分辨率、分析速度上具有絕對優(yōu)勢。其適合檢測含有極為復(fù)雜的小分子質(zhì)量代謝物體系的樣品，是目前國內(nèi)外使用較為普遍的分析檢測手段，被廣泛應(yīng)用于乳品質(zhì)量、安全及加工等方面研究。針對原料乳，多項(xiàng)研究依靠該技術(shù)剖析不同母體、飼養(yǎng)方式、貯藏條件下乳代謝物差異[11-12]，其結(jié)果為乳品質(zhì)改善提供了研究基礎(chǔ)。但隨冷藏時(shí)間的延長，原料乳中代謝物必定發(fā)生變化影響乳品質(zhì)，最終導(dǎo)致原料乳的腐敗變質(zhì)，但其變化情況卻鮮有報(bào)道。本研究基于該技術(shù)對4 ℃冷藏過程中原料乳復(fù)雜的代謝物體系進(jìn)行定性定量分析。通過正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）方法，將不同冷藏時(shí)間原料乳代謝產(chǎn)物的種類進(jìn)行歸納，總結(jié)冷藏階段乳代謝產(chǎn)物的分布變化情況。結(jié)合T檢驗(yàn)重點(diǎn)篩選脂類顯著性差異代謝物并分析其相關(guān)通路，探討冷藏階段乳脂類代謝的變化規(guī)律及相關(guān)機(jī)理，以期為原料乳保藏及乳制品加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳樣品（體細(xì)胞數(shù)小于2×105個(gè)/mL，菌落總數(shù)小于1×104CFU/mL，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度大于3.0 g/100 mL）來自于寧夏銀川當(dāng)?shù)厝槠窂S。采集過程嚴(yán)格遵循無菌操作，樣品采集后將采樣瓶迅速裝入含冰袋的隔熱包中放置，并于2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃冷藏。根據(jù)前期微生物多樣性分析及細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果，選取菌群變化顯著的時(shí)間點(diǎn)，即0、1、3、4、6 d進(jìn)行乳代謝分析。分組編號為B0、B1、B3、B4、B6，每組樣本做6 個(gè)平行。其中B1 vs B0、B3 vs B1、B4 vs B3、B6 vs B4表示不同冷藏時(shí)間原料乳樣品的對比組。

乙醇（純度95%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；乙酸銨、氨水（均為色譜純） 德國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290 Infinity LC UPLC儀 美國Agilent公司；Triple TOF 5600/6600質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；ACQUITY UPLC?BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；5430R型低溫高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)控樣本的制備

樣品等量混合制備質(zhì)控（quality control，QC）樣本。QC樣本用于測定進(jìn)樣前儀器狀態(tài)及平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，監(jiān)測和評價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

1.3.2 樣品預(yù)處理

在－80 ℃取出樣本，4 ℃緩慢溶解后分別取各組樣本100 μL，加入400 μL預(yù)冷的甲醇-乙腈（1∶1）溶液，渦旋60 s，－20 ℃放置1 h沉淀蛋白，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液冷凍干燥，－80 ℃保存樣本。

1.3.3 色譜條件

采用1290 Infinity LC UPLC系統(tǒng)，HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）對樣品進(jìn)行分離，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min，流動相A由水、25 mmol/L乙酸銨及25 mmol/L氨水組成，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，5% A，95% B；0.5～7 min，5%～35% A，95%～65% B；7～8 min，35%～60% A，65%～40% B；8～9 min，60% A，40% B；9～9.1 min，60%～5% A，40%～95% B，9.1～12 min，5% A，95% B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

分別采用電噴霧離子源，正負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。樣本采用AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀對代謝物進(jìn)行鑒定。霧化氣壓1為40 psi，輔助氣壓2為80 psi，氣簾氣壓力為30 psi，離子源溫度為650 ℃，噴霧電壓（ISV9F）為±5 000 V（正負(fù)2 種模式）；二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型掃描（information dependent acquisition，IDA）獲得，并且采用高靈敏模式，去簇電壓為±60 V（正負(fù)2 種模式），碰撞電壓為（35±15）eV，IDA設(shè)置如下：除排同位素4 Da，每周期要監(jiān)測的候選離子：10。

1.3.5 理化指標(biāo)測定

酸價(jià)的測定參照GB 5009.229—2016《食品中的酸價(jià)測定》[13]，過氧化值的測定參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[14]。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0對指標(biāo)進(jìn)行差異性分析，采用Origin 2018繪制折線圖。代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行完整性檢查，剔除極值，總峰面積歸一化，以確保各樣本間和代謝物間可平行性比較。導(dǎo)入SIMCA-P 16.2軟件，進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）、OPLS-DA，觀察各樣本間是否可靠、穩(wěn)定。隨后根據(jù)OPLS-DA結(jié)果篩選組間差異代謝物，結(jié)合T檢驗(yàn)篩選組間顯著性差異代謝物。通過http://www.genome.jp/kegg/pathway.html查找京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路。利用R語言繪制聚類熱圖，采用Excel 2010繪制通路占比圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏過程中原料乳酸價(jià)與過氧化值的變化

由圖1可知，冷藏0～6 d原料乳氧化過程持續(xù)進(jìn)行，表現(xiàn)為酸價(jià)、過氧化值不斷升高。酸價(jià)可以代表原料乳中游離脂肪酸的總量[15]。由圖1A可知，隨冷藏時(shí)間的延長，原料乳酸價(jià)不斷上升（0.95～1.90 mg/g），不同階段其上升速度均有所差異，其中冷藏0～1 d酸價(jià)上升明顯（0.95～1.33 mg/g），隨后上升速度降低。

圖1 冷藏過程中原料乳脂肪氧化變化Fig. 1 Evolution of lipid oxidation in raw milk during cold storage

過氧化物為脂肪氧化的初級氧化產(chǎn)物，其分解會產(chǎn)生難聞氣味的低分子質(zhì)量有害物質(zhì)如醛、酮、醇等氧化物及氫過氧化物[16]，故其值可判斷脂肪氧化程度[15]。由圖1B發(fā)現(xiàn)，原料乳過氧化值整體偏低（0.007 2～0.040 6 mg/100 g）。其中冷藏0～1 d過氧化值的增加在整個(gè)冷藏階段最為明顯，其變化趨勢與酸價(jià)相似，隨后過氧化值隨冷藏時(shí)間延長緩慢增加。

2.2 基于UPLC-Q-TOF-MS對冷藏過程中原料乳的多元變量分析

2.2.1 樣本QC分析

如圖2所示，各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊，表明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中儀器誤差引起的變異較小，信號較為穩(wěn)定。將所有實(shí)驗(yàn)樣本和QC樣本提取得到的峰，經(jīng)Pareto-scaling處理后進(jìn)行PCA，其得分圖見圖3。所有QC樣本在PCA空間緊密聚集，各實(shí)驗(yàn)樣本之間分離效果較好，說明代謝物數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。

圖2 QC樣品正負(fù)離子模式總離子流重疊圖譜Fig. 2 Overlapped total ion current chromatograms of QC samples in positive and negative ion modes

圖3 QC組和實(shí)驗(yàn)組樣本質(zhì)控PCA得分圖Fig. 3 PCA score plot of QC group and experimental sample quality control

2.2.2 OPLS-DA結(jié)果

為比較不同冷藏時(shí)間對比組間代謝物差異，采用多變量分析法分割有效區(qū)域，并進(jìn)行OPLS-DA。如圖4所示，4 組模型的R2、Q2值相對較高，且置換檢驗(yàn)圖回歸線在Y軸上截距小于0，Q2的斜率均大于R2，表明該模型的穩(wěn)健性可靠。在OPLS-DA得分圖中分析得出各個(gè)組間分散，組內(nèi)相互聚集，即不同冷藏時(shí)間對比組存在顯著代謝差異。

圖4 負(fù)離子模式下OPLS-DA得分圖及置換檢驗(yàn)圖Fig. 4 OPLS-DA score plots for differential metabolites identified in negative ion mode and permutation test plots

2.3 冷藏過程中原料乳顯著性差異代謝物篩選

變量投影重要性（variable importance projection，VIP）可反映變量對樣本分類判別的影響和解釋能力，當(dāng)VIP值大于1時(shí)，變量對組間分離有顯著貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)以VIP值大于1為條件，根據(jù)OPLS-DA模型的VIP值從原料乳的正離子（9 483 個(gè)）和負(fù)離子（8 682 個(gè)）代謝物中篩選潛在差異代謝物。結(jié)合T檢驗(yàn)，將P值小于0.05的物質(zhì)作為顯著性差異代謝物。由表1可知，整個(gè)冷藏過程中顯著性差異代謝物數(shù)量呈先增（0～3 d）后減（4 d）再增（6 d）的趨勢。各類代謝物變化較為復(fù)雜，無明顯規(guī)律。其中上調(diào)代謝物數(shù)量在冷藏0～3 d無較大變化，冷藏4 d時(shí)數(shù)量明顯增加，后隨時(shí)間的延長數(shù)量下降。下調(diào)代謝物數(shù)量波動趨勢與顯著性差異代謝物數(shù)量變化一致。

表1 顯著性差異代謝物的篩選結(jié)果Table 1 Results of screening for significantly differential metabolites

1 d與0 d相比，存在20 種顯著性差異代謝物 （表1），多為上調(diào)代謝物，且以脂類為主。3 d與1 d相比，篩選出44 種顯著性差異代謝物，上調(diào)數(shù)明顯低于下調(diào)數(shù)，其中氨基酸、碳水化合物、脂類及有機(jī)酸數(shù)量存在不同程度的增長。4 d與3 d相比，顯著性差異代謝物降至36 種，上調(diào)數(shù)高于下調(diào)數(shù)，氨基酸、維生素基本上調(diào)，脂類下調(diào)。6 d與4 d相比，顯著性差異代謝物有40 種，其中13 個(gè)代謝物上調(diào)，27 個(gè)代謝物下調(diào)，除脂類外，其余代謝物數(shù)量變化不大。在整個(gè)冷藏過程中脂類代謝物表現(xiàn)出高活躍性，相較于各類代謝物其數(shù)量始終占比最大，變化過程較為復(fù)雜。在冷藏3～4 d時(shí)脂類數(shù)量急劇下降，而冷藏6 d又恢復(fù)原有數(shù)量，可見脂類在冷藏中期會發(fā)生劇烈變化，這可能是由于原料乳本身成分復(fù)雜，脂肪氧化各階段變化不一所導(dǎo)致。

2.4 冷藏過程中原料乳脂類代謝物聚類、種類變化及其通路分析

代謝組學(xué)結(jié)果顯示冷藏過程中脂類物質(zhì)在乳體系最為活躍（表1）。脂肪是乳的重要成分，相較于其他組分占比大（3%～5%）、消化率高（95%）[17]。乳脂類物質(zhì)在冷藏過程極易被氧化分解，產(chǎn)生大量的自由基及過氧化物，同時(shí)在脂肪酸降解途徑中會產(chǎn)生有害醛酮等物質(zhì)，從而造成乳品風(fēng)味、色澤、質(zhì)地等發(fā)生改變，最終導(dǎo)致乳品質(zhì)變質(zhì)[18]。因此，探究原料乳脂類代謝物在冷藏過程中的變化情況尤為重要。

將冷藏各階段原料乳顯著性脂類差異代謝物進(jìn)行可視化聚類分析，具體劃分為I、II兩個(gè)區(qū)域。結(jié)果見圖5。I區(qū)中大部分代謝物在冷藏期內(nèi)變化復(fù)雜，無明顯規(guī)律，包括月桂酸、3-羥基十二酸、檸蘋酸、1-棕櫚酸-2-油酰磷酸甘油及二十碳五烯酸等。其中，代謝物2-乙基-2-羥基丁酸、2-甲基-3-羥基丁酸僅在冷藏6 d富集。II區(qū)顯著性差異代謝物數(shù)量居多，占總量的60.5%，在冷藏0～1 d顯著富集（26 種）。單亞油酸甘油酯、肉豆蔻油酸及亞油酸等代謝物在冷藏0～1 d含量最高，并隨冷藏時(shí)間的延長逐漸減少。二軟脂酸磷脂酰膽堿、N-棕櫚酰神經(jīng)鞘氨醇及鞘磷脂在冷藏3～6 d呈現(xiàn)大幅下降趨勢。由于乳脂代謝物的種類復(fù)雜、變化多樣，本研究將其分為甘油脂、游離脂肪酸及磷脂（表2）三大類進(jìn)一步分析。結(jié)合脂類差異代謝物平均表達(dá)量的變化在KEGG數(shù)據(jù)庫中尋找相關(guān)代謝通路。結(jié)果顯示脂類顯著性差異代謝物參與的代謝通路種類較多。歸類后共整理出9 條涉及脂類代謝的通路（圖6，KEGG第三層級）。結(jié)合代謝通路對甘油脂、游離脂肪酸及磷脂三類代謝物變化進(jìn)一步分析。

圖5 冷藏過程中原料乳顯著性差異脂類代謝物的聚類熱圖Fig. 5 Clustering heat map of significantly differential lipid metabolites in raw milk during refrigerated period

圖6 顯著性脂類差異代謝物在脂代謝通路中的占比Fig. 6 Percentage of significantly differential lipid metabolites in metabolic pathway

表2 冷藏階段脂類代謝物表達(dá)量Table 2 Expression patterns of significantly differential lipid metabolites during refrigerated storage

2.4.1 甘油酯的變化

乳腺上皮細(xì)胞分泌的乳脂由甘油酯組成，以乳脂球（milk fat globule，MFG）的形式存在，被乳脂球膜（milk fat globule membrane，MFGM）的復(fù)雜三層膜包圍[19]。由表2可知，參與脂類代謝的甘油酯代謝物整體上較少，共6 種。包括1-棕櫚酰-2-油酰磷酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、1-硬脂酰-2-花生酰-sn-甘油酯、單棕櫚酸甘油酯、單亞油酸甘油酯及肉豆蔻酸單甘油酯。其中， 1-棕櫚酰-2-油酰磷酸甘油酯表達(dá)量在冷藏0～3 d上調(diào)，而冷藏4 d開始下調(diào)，至冷藏6 d表達(dá)量變化不大；硬脂酸甘油酯在冷藏3～4 d呈現(xiàn)與前者相反的變化趨勢，而冷藏6 d表達(dá)量又轉(zhuǎn)為下調(diào)。冷藏整個(gè)階段，1-硬脂酰-2-花生酰-sn-甘油、單棕櫚酸甘油酯、單亞油酸甘油酯及單肉豆蔻酸甘油酯表達(dá)量均呈不斷下調(diào)趨勢。

2.4.2 游離脂肪酸的變化

乳脂中含有大量的游離脂肪酸（表2）。含量排前3位的游離脂肪酸依次為棕櫚酸（C16:0）、油酸（C18:1）、肉豆蔻酸（C14:0）。該結(jié)果與Liu Zhiqian[20]、李磊[21]等所得結(jié)論基本一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸占比分別約為50%、17%、33%。檢測到的飽和脂肪酸為月桂酸、正癸酸、棕櫚酸、16-羥基棕櫚酸、肉豆蔻酸、十七烷酸、3-羥基-十二烷酸、2-甲基-3-羥基丁酸及2-乙基-2-羥基丁酸；單不飽和脂肪酸為肉豆蔻油酸、棕櫚油酸及油酸；多不飽和脂肪酸為順-6,9,12,15-十八碳四烯酸、二十碳五烯酸、亞油酸、(±)-蘇式-9,10-二羥基-12(Z)-十八碳烯酸、全順式(6,9,12)-亞麻酸及2E-二十碳烯酸。參與脂質(zhì)代謝的游離脂肪酸表達(dá)量變化在各時(shí)間點(diǎn)均有所區(qū)別。冷藏階段，有7 種游離脂肪酸表達(dá)量下調(diào)，即飽和脂肪酸棕櫚酸、16-羥基棕櫚酸及十七烷酸，單不飽和脂肪酸油酸，多不飽和脂肪酸亞油酸、(±)-蘇式-9,10-二羥基-12(Z)-十八碳烯酸及2E-二十碳烯酸；5 種表達(dá)量上調(diào)，即飽和脂肪酸肉豆蔻酸、3-羥基十二烷酸、2-甲基-3-羥基丁酸及2-乙基-2-羥基丁酸，多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸。6 種游離脂肪酸在冷藏階段呈現(xiàn)較強(qiáng)的波動性，無明顯規(guī)律，即月桂酸、正癸酸、肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、順-6,9,12,15-十八碳四烯酸及全順式(6,9,12)-亞麻酸。整個(gè)冷藏過程中，各類游離脂肪酸變化過程多集中在冷藏3～4 d，且多數(shù)呈下調(diào)?？梢娎洳?～4 d這一階段是原料乳各類游離脂肪酸代謝物變化的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。

冷藏3 d時(shí)脂類代謝通路數(shù)量達(dá)到高峰（圖6），其原因是該階段各類游離脂肪酸數(shù)量及表達(dá)量的明顯變化所導(dǎo)致。其中脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成、亞油酸代謝通路均表達(dá)極顯著（P＜0.01），參與其通路的最活躍代謝物為棕櫚酸。冷藏4 d時(shí)棕櫚酸表達(dá)量無明顯變化，從而導(dǎo)致脂類代謝通路數(shù)量整體減少。

2.4.3 磷脂的變化

磷脂約占原料乳脂的1%，其作為MFGM的主要組成成分維持著乳脂的物理穩(wěn)定性[22]。一般將磷脂分為甘油磷脂（glycerophospholipid，GP）和鞘脂（sphingolipid，SP）兩大類[23-25]。由表2可知，GP有磷脂酰膽堿（glycerophosphatidylcholine，PC）及磷脂酰乙醇胺（glycerophosphatidylethanolamine，PE）2 種亞類，PC包含1-十六酰-sn-丙三醇-磷酸膽堿、1,2-二油?；蚜字?-oleoyl-1-stearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine、 1-軟脂基硫基-2-軟脂酰基氨基-1,2-二脫氧基-sn-甘油-3-膽堿磷酸、二軟脂酸磷脂酰膽堿、磷酰膽堿及1-十四酰-2-羥基卵磷脂8 種顯著性差異代謝物。PE含有1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1-棕櫚-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺2 種顯著性差異代謝物。SP有神經(jīng)酰胺和鞘磷脂2 種亞類。神經(jīng)酰胺含有N-棕櫚酰神經(jīng)鞘氨醇1 種代謝物。鞘磷脂含有鞘磷脂（d18:1/18:0）1 種代謝物。整個(gè)冷藏階段，4 種GP代謝物表達(dá)量變化并無明顯規(guī)律，1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine表達(dá)量上調(diào)，其余磷脂代謝物 （7 種）均呈現(xiàn)下調(diào)。整體觀察發(fā)現(xiàn)，近一半的磷脂代謝物在冷藏0～4 d表達(dá)量無明顯變化，而冷藏6 d開始大幅下調(diào)，其原因有待后續(xù)進(jìn)一步探究。

冷藏3～6 d均具有與磷脂相關(guān)的代謝通路（圖6），且冷藏3～4 d二軟脂酸磷脂酰膽堿表現(xiàn)活躍，參與多種脂質(zhì)代謝，如亞油酸代謝、不飽和脂肪酸代謝、甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝及α-亞麻酸代謝。冷藏6 d鞘磷脂（d18:1/18:0）表達(dá)量顯著上調(diào)，使鞘脂類代謝較活躍。

3 討 論

通常，原料乳擠出后會立即冷卻并進(jìn)行4 ℃冷藏。即便如此，低溫仍會損壞原料乳的結(jié)構(gòu)，無法完全避免脂肪氧化、酶促反應(yīng)及微生物降解等反應(yīng)。通過分泌上皮細(xì)胞、乳腺自身合成等途徑產(chǎn)生的內(nèi)源酶及貯存過程中嗜冷微生物產(chǎn)生的外源酶等在低溫下仍會分解、代謝原料乳中的營養(yǎng)物質(zhì)，使原料乳成分改變，導(dǎo)致其最終腐敗。

冷藏過程中，乳體系代謝復(fù)雜，無明顯規(guī)律。顯著性差異代謝物結(jié)果顯示，整個(gè)代謝過程中脂類代謝占主導(dǎo)地位，該結(jié)論與Tribst等[2]研究結(jié)果一致。大量報(bào)道顯示，微生物特別是嗜冷微生物冷藏過程中的生長是導(dǎo)致乳及乳制品品質(zhì)劣變的主要原因。假單胞菌、不動桿菌、黃桿菌及沙雷氏菌等[26-27]會產(chǎn)生穩(wěn)定性較高的蛋白酶，其作用于MFG的保護(hù)膜，導(dǎo)致MFGM破裂，從而釋放出膜內(nèi)包裹的脂肪。嗜冷微生物產(chǎn)生的脂肪酶及內(nèi)源性酯酶會共同分解MFG中釋放的脂類物質(zhì)，隨時(shí)間變化的脂類代謝物不斷改變，最終造成原料乳產(chǎn)生酸敗味、苦肽等異味，并導(dǎo)致乳中營養(yǎng)成分的劣變[28]。

聚類熱圖及脂類代謝物表達(dá)量分析顯示大部分脂類代謝物在冷藏0～1 d時(shí)表達(dá)量無明顯變化，而變化多集中在冷藏3～6 d，尤其是冷藏6 d。將脂肪氧化指標(biāo)與各類脂類代謝物表達(dá)量變化結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)雖然二者冷藏階段均具有較大的轉(zhuǎn)變，但是脂肪氧化速度降低時(shí)（冷藏1～3 d）大部分逐漸積累的脂類代謝物表達(dá)量卻下調(diào)，可見乳脂氧化并不是影響脂類代謝物變化的關(guān)鍵因素，受復(fù)雜乳成分及乳環(huán)境的影響，乳脂肪氧化反應(yīng)并不會同步推動脂類物質(zhì)變化，乳中脂類代謝物的變化是脂肪氧化分解與脂質(zhì)合成共同作用的結(jié)果。

在3 類顯著性脂類差異代謝物中，游離脂肪酸、磷脂變化尤為突出。其中大部分游離脂肪酸進(jìn)入冷藏中期（3 d）表達(dá)量下調(diào)，且隨冷藏時(shí)間的延長含量逐漸減少。KEGG通路分析顯示，該階段新增游離脂肪酸表現(xiàn)活躍且主要參與了脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成及亞油酸代謝。這種現(xiàn)象可能與3 d后假單胞菌成為原料乳優(yōu)勢菌屬相關(guān)[1]。研究表明，假單胞菌位于編碼lipA基因胞外脂肪酶的多順反子操縱子起始位置的 aprx基因[29-30]，其表達(dá)的脂肪酶可能作用于甘油三酯的α部位[31]，將乳中游離脂肪酸代謝水解為小分子物質(zhì)。然而游離脂肪酸中2-乙基-2-羥基丁酸、2-甲基-3-羥基丁酸含量變化較為特殊，即冷藏4～6 d上調(diào)且含量隨冷藏時(shí)間延長成倍增加，其變化可能與脂肪酶選擇性地釋放丁酸有關(guān)[32]。關(guān)于磷脂變化，本研究發(fā)現(xiàn)SP及部分GP在原料乳冷藏6 d下調(diào)。KEGG通路分析顯示冷藏6 d時(shí)新增了一條與磷脂代謝相關(guān)的通路。前期在乳內(nèi)源酶黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶及堿性磷酸酶的作用下MFGM被分解，此階段（冷藏6 d）作為MFGM的重要組成成分的磷脂類物質(zhì)與乳體系中其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)[33-34]，導(dǎo)致磷脂含量降低。同時(shí)此時(shí)的熒光假單胞菌所產(chǎn)生的磷脂酶C對磷脂的水解程度達(dá)到最大化[35-36]，且磷脂酶C與脂肪酶協(xié)同作用加快了磷脂的脂解速度[37]。

脂類代謝物的變化會使乳品質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，而導(dǎo)致脂類代謝物轉(zhuǎn)變的各類因素同樣影響乳組織及風(fēng)味。冷藏3 d假單胞菌與脂肪酶作用使乳黏度逐漸增強(qiáng)，蛋白酶溶解乳中部分酪蛋白，導(dǎo)致膠束穩(wěn)定性破壞、苦肽形成及氨基酸分解，最終乳組織出現(xiàn)乳清蛋白沉淀、凝塊等現(xiàn)象并產(chǎn)生苦味物質(zhì)[38-39]。同時(shí)各類嗜冷菌生成的脂酶會共同攻擊乳中MFG，使球狀甘油三酯暴露，導(dǎo)致乳表面出現(xiàn)絮狀物。而磷脂酶的水解產(chǎn)物會產(chǎn)生類油氣味的烷烴、烷-2-烯醛和烷-2,4-二烯醛[40]。綜上，內(nèi)源酶、嗜冷微生物及其酶類作用可能是冷藏3～6 d游離脂肪酸、磷脂表達(dá)量劇烈變化的主要因素，最終導(dǎo)致乳品風(fēng)味、質(zhì)地、組織趨于劣變狀態(tài)。因此冷藏3 d可作為原料乳冷藏品質(zhì)控制的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。