桃主要過敏原蛋白Pru p 3的分離純化及質(zhì)譜鑒定

康文瀚，張九凱，邢冉冉，孫秀蘭，陳 穎,

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

近年來，食物引起的過敏現(xiàn)象受到越來越多的重視。迄今為止全球約有22%～25%的人對食物產(chǎn)生過敏反應(yīng)，其中兒童發(fā)病數(shù)量最多，并以每10年2～3 倍的速率不斷增加，一些原來不是過敏體質(zhì)的人也逐漸演變成過敏性體質(zhì)[1]。

桃（Prunus persica L. Batsch）是我國食物過敏中較常見的致敏食物之一。有研究表明，由進食蔬菜、水果導(dǎo)致的嚴重變態(tài)反應(yīng)中桃是最常見的致敏食物[2]。桃過敏原蛋白主要分為4 類蛋白家族：病程相關(guān)蛋白第10家族（Pru p 1）、類甜蛋白家族（Pru p 2）、非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白家族（Pru p 3）和抑制蛋白家族（Pru p 4）[3]。

國內(nèi)外已經(jīng)圍繞桃過敏原進行了不同程度的研究。在地中海地區(qū)，由桃引起的過敏現(xiàn)象在水果過敏中的比例最高。在中國，桃過敏在全部食物過敏中位居第二（依次是豆科植物、桃、葵花籽和花生等）[3-4]。桃過敏現(xiàn)象的發(fā)生存在明顯的地域分布差異，不同國家和地區(qū)引起桃過敏的主要過敏原蛋白不同，同時由過敏原蛋白激發(fā)的過敏癥狀也存在差異。比如，在歐洲中部地區(qū)，桃過敏主要是由過敏原蛋白Pru p 1和Pru p 2引起，其過敏癥狀比較輕微，一般僅表現(xiàn)為口腔過敏綜合癥；而在歐洲南部地中海地區(qū)，引起桃過敏的主要過敏原蛋白是 Pru p 3[4]，該過敏原蛋白能抵抗胃蛋白酶的消化，產(chǎn)生全身系統(tǒng)性過敏或接觸性蕁麻疹等嚴重癥狀。在中國桃過敏的發(fā)生往往伴隨著蒿屬花粉過敏，其主要過敏原蛋白同樣是Pru p 3[5]。

Pru p 3作為桃過敏原蛋白中的主要致敏蛋白，需要進行更深入的研究。而純化制備大量Pru p 3過敏原蛋白是深入研究的基礎(chǔ)，目前報道的蛋白純化方法主要包括鹽析法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀法、離子交換層析法等[6]。其中鹽析法、等電點沉淀法及有機溶劑沉淀法雖然操作簡單，節(jié)約成本，但是蛋白純化濃度較低，不能有效分離目標蛋白。離子交換層析法對目標蛋白分離效果較好，但實驗成本較高，操作復(fù)雜[7]。國內(nèi)外已經(jīng)圍繞著桃過敏原蛋白Pru p 3純化進行了不同程度的研究。Mori等[8]使用親和層析預(yù)裝色譜柱從桃蛋白粗提物中分離出了桃過敏原蛋白Pru p 3，該方法雖然得到的蛋白純度較高，但是需要大型儀器支撐，操作較為復(fù)雜。鄧珊等[9]利用多肽合成儀結(jié)合固相合成法合成8 條覆蓋Pru p 3全部氨基酸序列的肽段，之后將每條肽段之間重疊5 個氨基酸，利用重疊肽段法最后得到桃過敏原蛋白Pru p 3。該方法雖然得到的蛋白純度較高但是需要大量成本，且需要大量驗證實驗佐證。翟康樂等[10]利用AKTA avant柱層析對過敏原蛋白Pru p 3進行純化，以不同紫外吸收波長區(qū)分并純化收集桃過敏原蛋白Pru p 3。該方法雖然得到的目標蛋白純度較高，但是操作較為復(fù)雜，成本較高，且對純化的目標蛋白浪費較多。因此在節(jié)約成本、減少繁瑣操作的同時盡可能多地得到純度較高的目標蛋白是桃過敏原蛋白Pru p 3純化的關(guān)鍵。

本研究將水蜜桃、油桃、蟠桃及黃桃作為研究對象，以ZipTipC18微量層析柱作為純化工具一步純化桃過敏原蛋白Pru p 3，并在篩選出桃過敏原蛋白Pru p 3特征肽段的基礎(chǔ)上利用利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測特征肽段的方法對純化后的桃過敏原蛋白Pru p 3進行定性。旨在建立一種快速高效的過敏原蛋白Pru p 3純化方法，為開展桃過敏原后續(xù)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

李子、杏、櫻桃、草莓購自當?shù)爻?，貯存于 －80 ℃冰箱。

水蜜桃（浙江奉化玉露水蜜桃）、油桃（北京瑞光5號油桃）、黃桃（湖南錦繡黃桃）、蟠桃（新疆石河子143蟠桃），于2019年6—10月分別采收于浙江、北京、湖南、新疆，貯存于－80 ℃冰箱。

甲醇、水（均為質(zhì)譜級） 美國Honeywell公司；甲酸（質(zhì)譜級） 美國Sigma公司；碳酸氫銨、氯化鈉、尿素、硫脲、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、鹽酸、乙醇、冰乙酸、稀鹽酸、磷酸、異丙醇 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；98%牛血清蛋白、考馬斯亮藍R250、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris堿（pH 8.8）、Tris堿（pH 6.8）、10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、10%過硫酸銨、四甲基乙二胺、甘氨酸、甘油、Marker、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA） 美國 Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-Trap 5500質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；LC-20 XR高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；5920 R型冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；渦旋振蕩器 德國IKA公司；UM 5破碎機 德國Stephan公司；R3088旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機 上海申生科技有限公司；1083型恒溫振蕩水浴 德國GFL公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）儀 美國Bio-Rad公司；ZipTipC18微量層析柱 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將保存于－80 ℃冰箱中的桃樣品取出，去皮，將桃肉及桃皮分別用組織研磨機打磨成漿，平鋪于研缽中并加入液氮不斷研磨后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，之后在冷凍干燥機中凍干3 d。將桃凍干物研磨成粉，過80 目篩，裝袋密封保存于干燥器中。

1.3.2 桃過敏原蛋白提取

分別準確稱量1 g桃凍干粉粉末加入到4 種提取液中：碳酸氫銨（ammonium bicarbonate，ABC）溶液（50 mmol/L）、磷酸緩沖溶液（10 mmol/L）、低鹽（0.1 mol/L）溶液、2% SDS溶液各10 mL）。其中ABC溶液、磷酸緩沖溶液、低鹽溶液以0 ℃對桃蛋白進行冰浴提取，提取時間為1 h；SDS溶液以80 ℃對桃蛋白進行熱提取，提取時間為1 h。蛋白提取后渦旋振蕩，超聲30 min（溫度不高于37 ℃）后取出，于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液過0.22 μm聚四氯乙烯膜得到桃蛋白提取液，將過膜后的蛋白提取液以旋干復(fù)溶進行濃縮，通過Q-Bit方法測定蛋白質(zhì)量濃度，確保蛋白質(zhì)量濃度達到1 μg/μL以上，并于－80 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.3.3 Pru p 3蛋白純化

以ZipTipC18微量層析柱作為純化工具對過敏原蛋白Pru p 3進行一步純化，ZipTipC18微量層析柱首先在乙腈中平衡，然后在Milli-Q級水中與0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）平衡。吸取桃蛋白濃縮提取液，反復(fù)抽吸8 次。用0.1% TFA洗滌ZipTipC18微量層析柱，反復(fù)抽吸5 次，用4 μL 0.1% TFA-50%乙腈洗脫ZipTipC18微量層析柱吸附的蛋白，將收集的蛋白進行SDS-PAGE分析，進行比較對照，鑒定回收結(jié)果。其余于－80 ℃冰箱保存。

1.3.4 SDS-PAGE分析

采用15%分離膠與5%濃縮膠進行桃蛋白SDS-PAGE分析，上樣量為20 μL，恒壓80 V進行電泳120 min。電泳結(jié)束后，染色液染色90 min，脫色液脫色4 h后取膠塊進行凝膠成像。

1.3.5 Pru p 3特征肽段篩選

在過敏原網(wǎng)站Allergen Search Results搜索“Pru p 3”，獲得該蛋白肽段信息，運用PeptideCutter軟件對桃過敏原蛋白Pru p 3進行模擬酶切，將酶切肽段在UniProtkB網(wǎng)站上進行BLAST比對，通過打分獲得特征肽段，之后通過Skyline軟件獲得特征肽段離子對信息[12]。特征肽段篩選原則如下：以7～20 個氨基酸為宜；不含錯切或漏切的酶切位點；最好不含甲硫氨酸；具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)；進行定性定量分析時，具有較好的靈敏度和峰形。最終篩選出段響應(yīng)值較好、靈敏度較高的特征肽段[13]。

1.3.6 LC-MS/MS分析條件

色譜條件：色譜柱使用美國Phenomenex公司的Kinetex C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A為0.1%甲酸-2%乙腈-98%水，流動相B為0.1%甲酸-2%水-98%乙腈；梯度洗脫程序：0.1～0.5 min，98% A、2% B；0.5～25 min，92% A、8% B；25～31 min，78% A、22% B；31～33 min，65% A、35% B；33～36.5 min，20% A、80% B；36.5～39.9 min，98% A、2% B；柱溫40 ℃，進樣量2 μL，流速0.4 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離正離子模式；氣簾氣壓力30 psi；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力50 psi；碰撞氣壓力6 psi；噴霧電壓5 500 V；電噴霧離子源溫度550 ℃；掃描方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）[14]。

1.3.7 桃蛋白膜上酶切

將桃蛋白提取液從－80 ℃冰箱取出，置于4 ℃冰箱進行解凍。通過Q-Bit進行蛋白濃度測定后進行膜上酶切。加入10 μL IAA，室溫條件下避光放置15 min。將處理液全部轉(zhuǎn)移至5 kDa超濾離心管內(nèi)，12 000 r/min離心10 min后加入50 μL 50 mmol/L ABC溶液，12 000 r/min 離心10 min。之后加入100 μL 50 mmol/L的ABC溶液，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)3 次。倒掉收集管中的廢液，用100 μL 質(zhì)譜水清洗2 次。膜上各加入100 μL 50 mmol/L的ABC溶液及4 μL 胰蛋白酶溶液，渦旋混勻后用封口膜封住，37 ℃條件下水浴酶切4 h。將酶切后的樣品取出，12 000 r/min離心10 min后加入100 μL 25 mmol/L的ABC溶液，12 000 r/min離心5 min，重復(fù)2 次[15]，合并收集液。

1.3.8 Pru p 3切膠回收鑒定

將SDS-PAGE膠片用刀片割下Pru p 3的條帶后水洗膠塊2 次，吸走液體。之后對較快膠塊脫色處理：加入考染脫色液100 μL（溶液的量視膠塊具體大小而定），室溫脫色1 h左右，直至膠塊顏色完全褪去，吸走液體。水洗膠塊，將脫色后的染料洗去，吸走液體。加入50%乙腈溶液讓膠塊脫水，棄去ACN后再加入100% ACN溶液，直至膠塊變白完全脫水，分別吸走液體。加入50 μL 10 mmol/L DTT溶液（溶于25 mmol/L ABC溶液），56 ℃水浴50 min，離心，吸走液體。之后加入50 μL 55 mmol/L IAA溶液（溶于25 mmol/L ABC溶液），避光反應(yīng)15 min，吸走液體。以100 μL超純水水洗膠塊，將反應(yīng)剩余液體吸走。加入胰酶5～20 μL（具體視膠塊大小而定），讓膠塊充分吸脹，變透明20 min，再剩余1～3 μL的酶液。37 ℃水浴過夜酶切16 h。－20 ℃冰箱保存待測樣品，用于LC-MS/MS-MRM鑒定[16-17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

每組數(shù)據(jù)平行測定3 次。運用SPSS 25.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均值的多重比較采用Duncan法，并進行One-Way ANOVA檢驗，P＜0.05，差異顯著。表格由Excel軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃蛋白提取液SDS-PAGE分析

經(jīng)Q-bit法定量總蛋白質(zhì)濃度，上述4 種緩沖液的蛋白提取質(zhì)量濃度分別為0、0.251、0.485 mg/mL和0.845 mg/mL，可以看出，ABC提取液對桃蛋白的提取濃度幾乎為0，SDS熱提取效果最好，因此選取SDS熱提取法對不同樣本的桃皮及桃肉中蛋白進行提取，結(jié)果如圖1所示。桃過敏原蛋白Pru p 3的分子質(zhì)量為9 kDa，4 種桃類提取液中均含有桃過敏原蛋白Pru p 3，而桃皮中Pru p 3質(zhì)量濃度高于桃肉，與其他相關(guān)報道相符[18-20]。由圖1還可以看出，油桃的桃皮中Pru p 3含量較高，而蟠桃桃肉中Pru p 3含量較高。

圖1 SDS熱提取法對4 種桃蛋白提取SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE electrophoretograms of proteins extracted from four species of P. persica using hot SDS

2.2 桃過敏原蛋白Pru p 3純化

以ZipTipC18微量層析柱作為純化工具一步純化桃過敏原蛋白Pru p 3，將純化后的蛋白進行SDS-PAGE分析。由圖2可以看出，該純化方法對4 種桃類桃皮及桃肉中的過敏原蛋白Pru p 3的純化效果明顯，由于桃肉中仍然含有部分雜蛋白，因此該方法對桃皮的純化效果優(yōu)于桃肉。通過比較條帶灰度值，桃皮及桃肉中Pru p 3純度均在95%以上，因此該純化方法高效且得率高。

圖2 桃過敏原蛋白Pru p 3純化SDS-PAGE圖Fig. 2 SDS-PAGE profiles of purified peach Pru p 3

2.3 Pru p 3特征肽段篩選與驗證

圖3為Pru p 3的胰蛋白酶酶切肽段信息，由于胰蛋白酶酶切位點為K與R，因此將模擬酶切后的肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR、GGGAVPPACCNGIR、NVNNLAR、TTPDR、QAACNCLK、QLSASVPGVNPNNAAALPGK、CGVHIPYK、ISASTNCATVK在UniProtkB網(wǎng)站上進行BLAST比對打分，除ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK打分為100 分且只存在于桃中之外（100 分合格），其他肽段均不符合條件（肽段GGGAVPPACCNGIR、QAACNCLK、QLSASVPGVNPNNAAALPGK、ISASTNCATVK得分為100，但其不僅存在于桃中還分別存在于山荊子、豌豆、杏子、李子中，不具備特異性。肽段NVNNLAR、TTPDR得分未到100不合格），因此篩選出肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK作為桃過敏原蛋白Pru p 3的特征肽段[21]。表1為特征肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK的MRM參數(shù)。該參數(shù)所提供的母子離子對信息及保留時間等，有助于質(zhì)譜信號采集。圖4為桃過敏原蛋白Pru p 3特征肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK提取離子流圖。

圖3 桃過敏原蛋白Pru p 3胰蛋白酶酶切肽段信息Fig. 3 Trypsin cleavage of peach Pru p 3

表1 桃過敏原蛋白Pru p 3各肽段MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of peptides derived from peach Pru p 3

圖4 桃過敏原蛋白Pru p 3特征肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK提取離子流圖Fig. 4 Extracted ion current chromatograms of signature peptides ITCGQVSSALAPCIPYVR and CGVHIPYK from peach Pru p 3

由于桃屬于薔薇科水果，因此以篩選出的肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK為特征肽段，對李、杏、櫻桃、草莓4 種薔薇科陰性樣品的酶切肽段進行LC-MS/MS分析，提取特征肽段的特征離子對，未發(fā)現(xiàn)陰性樣品中產(chǎn)生離子流峰響應(yīng)。由圖5可以看出，在保留時間為10 min及12 min時，并沒有響應(yīng)峰出現(xiàn)，說明在李、杏、櫻桃、草莓4 種薔薇科水果中均不存在特征肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK，所篩選的肽段為特異性肽段[22-25]。

圖5 4 種陰性樣品薔薇科水果中Pru p 3特征肽段提取離子流圖Fig. 5 Extracted ion current chromatograms of signature peptides from Pru p 3 in negative samples of four Rosaceae fruits

熱殺菌是桃汁、桃果脯等桃制品最常用的殺菌方式之一，熱加工處理會對某些肽段產(chǎn)生降解作用，因此一條肽段是否具有熱穩(wěn)定性也是衡量其能否作為特征肽段的重要標準[26]。為此對篩選出的特征肽段進行熱穩(wěn)定性實驗的考察，將桃蛋白提取液進行煮沸處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過加熱煮沸后的桃蛋白提取液中特征肽段響應(yīng)值并沒有明顯變化（圖6），因此所篩選的特征肽段具有一定的熱穩(wěn)定性，經(jīng)過熱加工之后不會降解。

圖6 熱加工條件下桃過敏原蛋白Pru p 3特征肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK提取離子流圖Fig. 6 Extracted ion current chromatograms of signature peptides ITCGQVSSALAPCIPYVR and CGVHIPYK from boiled and unboiled peach Pru p 3

2.4 桃過敏原蛋白Pru p 3切膠回收鑒定

以之前篩選出的兩條肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK為特征肽段，通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Pru p 3進行切膠回收后的酶解液中均能提取出2 條特征肽段的離子對（圖7），因此可證明以ZipTipC18微量層析柱作為純化工具的一步純化法純化蛋白為桃過敏原蛋白Pru p 3。

圖7 桃過敏原蛋白Pru p 3切膠回收質(zhì)譜鑒定Fig. 7 Identification of peach Pru p 3 by mass spectrometry

3 討論與結(jié)論

目前桃過敏原蛋白Pru p 3的純化方法較多，但是不同的純化方法均存在其弊端，普遍存在著蛋白純化純度與操作難易程度呈反比的現(xiàn)狀[27]。相比較其他的純化方法而言，以ZipTipC18微量層析柱為純化工具一步純化出的桃過敏原蛋白Pru p 3不僅得率高，而且操作過程簡單、節(jié)約成本，可以作為一種新型的桃過敏原蛋白Pru p 3的純化方法。但是由于植物基質(zhì)中存在幾種非蛋白質(zhì)化合物，如酚、脂、色素和碳水化合物，它們可能干擾蛋白分析過程，因此在進行Pru p3蛋白純化之前，應(yīng)用乙醇有效分離脂質(zhì)和其他疏水物質(zhì)，防止污染ZipTipC18微量層析柱。Pru p 3屬于小分子蛋白，甚至分子質(zhì)量小于很多肽段，ZipTipC18微量層析柱不僅能對桃過敏原蛋白Pru p 3進行分離純化，同時同樣適用于其他小分子疏水性蛋白的純化。在Pru p 3純化過程中發(fā)現(xiàn)在雖然桃果皮中Pru p 3的含量遠高于果肉，但這種過敏原蛋白仍然存在于果肉當中，這與其他研究相符[28-30]。因此對桃進行去皮處理只能降低桃的致敏性，并不能達到脫敏的目的。

本研究描述了一種簡單、高效、經(jīng)濟的提取和純化方法對桃過敏原蛋白Pru p3進行純化，并且通過LC-MS/MS-MRM對該方法純化出的蛋白進行鑒定，結(jié)果證明該方法能夠有效純化桃過敏原蛋白Pru p 3，且純度高達95%以上。