萬壽菊莖葉醇提物的鎮(zhèn)痛抗炎活性研究

曾 益，李婧怡，周明康，曹棟才，婁琳琳，何 恒，何夢雪，鄒俊杰，殷中瓊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

萬壽菊（Tagetes erecta L.）為菊科萬壽菊屬一年生草本植物，又名臭芙蓉、里苦艾、萬壽燈等，夏秋季采收，其莖粗壯直立，葉緣具腺體，釋放異味，原產(chǎn)于墨西哥，因其抗性強、適應(yīng)性廣、花期長、花型豐富、花色純正且品種眾多，在我國被廣泛栽培且應(yīng)用范圍較廣，即可作為觀賞花卉，又可作為藥用植物和食品香料[1-2]。萬壽菊作為一種經(jīng)濟作物，其花常被用于葉黃素的提取，但是莖葉部分未得到充分利用[3-4]。研究表明萬壽菊莖葉中含有豐富的天然有效成分，主要包含黃酮、多糖、香豆素、皂苷、生物堿等[3，5]。黃酮類化合物具有多種藥理活性，研究表明其具有抗氧化、抗心血管疾病，鎮(zhèn)痛抗炎的作用[6-8]?；厝鹑A[9]等人使用超聲波提取法分別制備了萬壽菊花、莖、葉醇提物，發(fā)現(xiàn)萬壽菊莖葉具有良好的抗氧化活性，且與黃酮類化合物的含量呈正相關(guān)。甚至有報道稱，萬壽菊莖葉中提取得到的黃酮類化合物具有體外抗肝癌和抗胃癌活性[10]。目前，有關(guān)萬壽菊提取物的鎮(zhèn)痛抗炎活性國內(nèi)外均尚未有報道。本文前期利用正交試驗得到了以黃酮類化合物的含量為判斷標準的最佳萬壽菊莖葉醇提物，再通過建立疼痛模型和炎癥模型，初步研究其鎮(zhèn)痛抗炎活性，希望為深入研究其活性物質(zhì)和綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 受試動物

SPF級（20±2）g ICR小鼠，成都達碩生物科技有限公司。

1.2 藥材及試劑

試驗藥材：新鮮萬壽菊植株去除花和根，莖葉干燥后打成粉末。

試驗試劑：ELISA IL-1試劑盒、ELISA IL-1β試劑盒、ELISA IL-6試劑盒、ELISA IL-8試劑盒、ELISA IL-10試劑盒、ELISA PGE2試劑盒、ELISA iNOS試劑盒、ELISA NO試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；伊紅染液、蘇木素染液，南京建成生物研究所；脂多糖（LPS），北京索萊寶科技有限公司；穿心蓮片，廣州白云山和記黃埔中藥有限公司；無水乙醇、多聚甲醛、蒸餾水。

1.3 儀器

中草藥粉碎機；GZX-9070MBE型恒溫鼓風干燥箱；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；FA2204A電子天平；SHZ-D型循環(huán)水真空泵；TGL-16G高速臺式離心機；FA2204A電子天平；BIO-RAD酶標儀；YLS-6A智能熱板儀；HS-120D超聲波清洗機；ZS-B型三重純水蒸餾器；移液器；各種玻璃試管；三角玻璃瓶等。

1.4 萬壽菊莖葉醇提物的制備

將新鮮的萬壽菊莖葉干燥后打成粉末，準確稱取粉末500 g。采用超聲波提取法制備醇提物，以70%乙醇為提取液，料液比為1∶30，超聲溫度為70℃、一共提取2次，每次提取1 h。經(jīng)過抽濾、合并濾液，再將濾液減壓濃縮后，放于50℃烘箱干燥至恒重，得萬壽菊莖葉浸膏。

使用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法檢測萬壽菊莖葉醇提物的總黃酮含量[11]，具體步驟如下：

精密稱取0.05 g提取物至50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密吸取1 mL至25 mL容量瓶中，加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液10.0 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，采用紫外分光光度計在510 nm處測定吸光度值。繪制蘆丁標準曲線，根據(jù)標準曲線回歸方程和稀釋倍數(shù)計算浸膏中的總黃酮含量。

1.5 萬壽菊莖葉醇提物的鎮(zhèn)痛試驗研究[12-13]

1.5.1 醋酸扭體試驗

取50只小鼠，分為空白對照組（0.5%CMC-Na），陽性對照組（穿心蓮片250 mg/kg）以及萬壽菊莖葉醇提物低、中、高劑量組（分別按總黃酮含量125、250、500 mg/kg給藥），以上5組皆按0.2 mL/10 g連續(xù)灌胃7 d。各組小鼠末次灌胃1 h后，對每只小鼠腹腔注射0.7%的冰醋酸溶液0.1 mL/10 g，并觀察記錄小鼠注射后在5～20 min內(nèi)發(fā)生扭體反應(yīng)（伸展后肢、腹部內(nèi)凹、臀部抬高）的次數(shù)。

1.5.2 電熱板試驗

將小鼠置于（55.5±0.5）℃恒溫熱板上，以舔后足為指標，篩選痛閾值大于5 s小于30 s的合格小鼠50只。對物理性致痛的影響熱板法將痛閾值篩選合格的小鼠50只，將50只小鼠分成5組每組10只，分別為空白對照組（0.5%CMC-Na）、陽性對照組（穿心蓮片250 mg/kg）以及萬壽菊醇提物低、中、高劑量組（分別按總黃酮含量125、250、500 mg/kg給藥），以上5組皆按0.2 mL/10 g灌胃7 d。按上述方式分組灌胃，末次灌胃30 min后，分別在30、60、90和120 min時測定各小鼠灌胃后的痛閾值。在測定中，如60 s內(nèi)無痛反應(yīng)，應(yīng)立即取出，并以60 s計算。

鎮(zhèn)痛百分率=[（給藥組痛閾值-對照組痛閾值）/對照組痛閾值]×100%。

1.6 萬壽菊莖葉醇提物的抗炎試驗研究

1.6.1 小鼠的分組給藥及炎癥模型建立

取60只小鼠，隨機分為空白對照組（0.5% CMC-Na）、模型組、陽性藥物組（穿心蓮片250 mg/kg）以及萬壽菊莖葉醇提物低、中、高劑量組（分別按總黃酮含量125、250和500 mg/kg給藥），藥物組按0.2 mL/10 g連續(xù)灌胃7 d。末次給藥30 min后，除空白組外其余小鼠腹腔注射LPS溶液140 μg/kg致炎，該劑量參照課題組王光熙等[14]構(gòu)建大鼠炎癥模型的LPS使用劑量，再依據(jù)小鼠和大鼠的體表面積等效換算而得[15]。觀察各組小鼠的生長狀況，并于致炎8 h后頸椎脫臼處死。

1.6.2 臟器指數(shù)

采樣前稱取各組小鼠的體重，經(jīng)頸椎脫臼處死后立即對小鼠進行解剖。將采集好的心、肝、脾、肺和腎使用PBS清洗殘留血液，吸干表面水分后立即于電子分析天平上稱重。臟器指數(shù)=臟器重量（mg）/體重（g）。

1.6.3 組織病理學(xué)觀察

取心、肝、脾、肺和腎修剪成合適大小，放入事先配置好的4%多聚甲醛溶液中固定48 h，隨后開始石蠟切片的制作和HE染色。

1.6.4 血常規(guī)

小鼠眼球采血100 μL全血，置于含EDTA的采血管內(nèi)并做好標記，于室溫放置30 min后，將樣品送至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院進行血常規(guī)檢測。

1.6.5 血清炎性因子

用不含EDTA的采血管收集血液，于冰盒里放置適當時間，3 000 r/min離心10 min后收集血清。按照ELISA試劑盒說明書分別檢測血清中炎性因子 IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、PGE2、iNOS 和NO的吸光度（OD值）。將標準品的OD值繪制標準曲線，根據(jù)曲線方程計算各待測因子在小鼠血清樣品中的濃度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用student’stest檢驗顯著性分析，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01視為差異極顯著，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”（Mean±SD）來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬壽菊莖葉醇提物的總黃酮含量

蘆丁標準曲線如圖1所示，其回歸方程為y=10.656x，R2=0.999 3。經(jīng)3次重復(fù)試驗，萬壽菊莖葉浸膏得率約為11.25%，浸膏中總黃酮含量約為13.29%。

圖1 蘆丁標準曲線圖Figure 1 Standard curve of Rutin

2.2 萬壽菊莖葉醇提物的鎮(zhèn)痛試驗研究

2.2.1 醋酸扭體試驗

如表1所示，萬壽菊莖葉醇提物各劑量組與空白對照組相比，能顯著減少因腹腔注射冰醋酸引起的疼痛而產(chǎn)生扭體和舔足的次數(shù)（P＜0.01），從而證實萬壽菊莖葉醇提物有明顯的鎮(zhèn)痛效果，且高劑量組優(yōu)于中、低劑量組。

表1 萬壽菊莖葉醇提物的醋酸扭體結(jié)果（X±S）Table 1 The acetic acid torsion results of alcohol extracts from Tagetes erecta L.stems and leaves（X±S）

2.2.2 電熱板試驗

由表2可知，與空白對照組相比，萬壽菊莖葉醇提物高劑量組末次給藥60 min后，能明顯地提高小鼠的痛閾值，加強小鼠對熱板的耐受力，小鼠鎮(zhèn)痛率顯著增大（P＜0.05），而萬壽菊莖葉醇提物低中劑量組則無明顯差異（P＞0.05）。由此可見，萬壽菊莖葉醇提物高劑量組對熱板法動物模型具有鎮(zhèn)痛作用。

表2 萬壽菊莖葉醇提物的電熱板結(jié)果（X±S）Table 2 Electric heating plate results of alcohol extracts from Tagetes erecta L.stems and leaves（X±S）

2.3 萬壽菊莖葉醇提物的抗炎試驗研究

2.3.1 臟器指數(shù)

經(jīng)LPS致炎后，小鼠臟器指數(shù)的結(jié)果如表3所示。與空白對照組相比較，模型組小鼠的肝、脾和肺臟器指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；穿心蓮片組以及萬壽菊莖葉醇提物低、中和高各劑量組小鼠的脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05），萬壽菊莖葉醇提物高劑量組肺臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05），剩余各組劑的臟器指數(shù)均無明顯差異（P＞0.05）。

表3 萬壽菊莖葉醇提物對LPS致炎小鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of alcohol extracts from Tagetes erecta L.stem and leaves on organ index of LPS-induced inflammatory mice

與模型組相比較，除了穿心蓮片組小鼠的肝和肺、萬壽菊莖葉醇提物低、中、高各劑量組小鼠的肝以及萬壽菊莖葉醇提物低、中劑量組小鼠和的肺的臟器指數(shù)顯著降低（P＜0.05）外，剩余各組小鼠的臟器指數(shù)則無明顯差異（P＞0.05）。

與穿心蓮片組相比較，除了萬壽菊莖葉醇提物高劑量組小鼠的肺的臟器指數(shù)顯著增大（P＜0.05）外，剩余各組小鼠臟器指數(shù)均無明顯差異（P＞0.05）。

萬壽具莖葉醇提物各劑量組小鼠的心、肝、脾和腎的臟器指數(shù)均無明顯差異（P＞0.05）；萬壽菊莖葉醇提物高劑量組小鼠的肺的臟器指數(shù)顯著高于萬壽菊莖葉醇提物低、中劑量組（P＜0.05）。

2.3.2 組織病理學(xué)觀察

將各組小鼠心、肝、脾、肺和腎做組織病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，各小鼠間心、腎確無明顯病變，而肝、脾和肺組織有明顯的病變情況，如圖1～3所示。

圖2 萬壽菊醇提物對LPS致炎小鼠肝臟的影響Figure 2 Effect of Tagetes erecta L.alcohol extract on liver of LPS-induced inflammatory mice

圖3 萬壽菊醇提物對LPS致炎小鼠脾臟的影響Figure 3 Effect of Tagetes erecta L.alcohol extract on spleen of LPS-induced inflammatory mice

圖2中，空白組肝臟具有正常結(jié)構(gòu)，中央靜脈周圍肝索清晰可見；LPS組中央靜脈周圍肝細胞發(fā)生局灶性壞死，中性粒細胞浸潤，肝血竇充血；穿心蓮片組中央靜脈周圍肝細胞發(fā)生顆粒變性，肝血竇充血，但仍具有正常索狀結(jié)構(gòu)；萬壽菊低劑量組中央靜脈嚴重充血，部分肝細胞發(fā)生空泡變性；萬壽菊中劑量組肝細胞發(fā)生輕微顆粒變性，肝血竇充血，但肝索結(jié)構(gòu)清晰可見；萬壽菊高劑量組肝細胞發(fā)生空泡變性，肝血竇充血，但具有正常肝索結(jié)構(gòu)。

如圖3所示，空白組脾臟具有正常結(jié)構(gòu)；LPS組出現(xiàn)紅髓脾竇擴張淤血，紅髓白髓分界不清，可見多個朗漢斯巨細胞浸潤；穿心蓮片組和萬壽菊醇提物低、中、高劑量組紅髓脾竇同樣擴張充血，但相較LPS組有所減弱。

如圖4所示，空白組肺臟具有正常結(jié)構(gòu)；模型組肺泡毛細血管壁增厚，局部出現(xiàn)溶血，并有炎性細胞浸潤；而穿心蓮片組和萬壽菊醇提物低、中和高劑量組均未發(fā)現(xiàn)明顯病變。

圖4 萬壽菊醇提物對LPS致炎小鼠肺臟的影響Figure 4 Effect of Tagetes erecta L.alcohol extract on lung of LPS-induced inflammatory mice

2.3.3 血常規(guī)

經(jīng)LPS致炎后，小鼠血常規(guī)測定結(jié)果如表4所示。與空白對照組相比，模型組小鼠血液中的WBC、RBC、HGB、PLT 和 LYM 均有顯著降低（P＜0.01），GRA 和MON也顯著降低（P＜0.05）；萬壽菊莖葉醇提物低、高劑量組小鼠血液中的RBC、HGB、PLT與空白對照組相比均顯著降低（P＜0.01），LYM也顯著降低（P＜0.05）；除此之外，高劑量組小鼠血液中的WBC和GRA與空白對照組相比也顯著降低（P＜0.05）；萬壽菊莖葉醇提物中劑量組小鼠血液中的RBC、PLT與空白對照組相比顯著降低（P＜0.01），WBC也顯著降低（P＜0.05）；穿心蓮片組小鼠血液中除RBC和PLT與空白對照組相比顯著降低（P＜0.01）外，剩余各指標均無明顯差異（P＞0.05）。

表4 萬壽菊莖葉醇提物對LPS致炎小鼠血液常規(guī)的影響n=6（x±s）Table 4 Effect of alcohol extracts from Tagetes erecta L.stems and leaves on blood routine of LPS-induced inflammatory mice n=6 （x±s）

與模型組相比，萬壽菊莖葉醇提物低劑量組小鼠血液中WBC和HGB顯著升高（P＜0.01）；中劑量組小鼠血液中的 WBC、RBC、HGB、PLT 顯著升高（P＜0.01），GRA 和 MON 也顯著升高（P＜0.05）；高劑量組小鼠血液中的HGB、WBC和PLT葉顯著升高（P＜0.05）；穿心蓮片組小鼠血液中 WBC、RBC、HGB、PLT顯著升高（P＜0.01），LYM 和 MON 也顯著升高（P＜0.05）。

與穿心蓮片組相比，萬壽菊莖葉醇提物各劑量組小鼠血液中的WBC、PLT、HGB、LYM、GRA 和MON均無明顯差異（P＞0.05）；萬壽菊莖葉醇提物除中劑量組外，其余各組的RBC與穿心蓮片組相比顯著降低（P＜0.05）。

所有組間的HCT、MCV、MPV和MCH均無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.4 血清炎性因子

經(jīng)LPS致炎后，小鼠血清炎性因子檢測結(jié)果如圖5所示。與空白對照組相比，模型組、穿心蓮片組以及萬壽菊莖葉醇提物低、中、高劑量組小鼠血清中 IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、PGE2、iNOS 和 NO 的含量極顯著上升（P＜0.01），穿心蓮片組小鼠血清的IL-10含量顯著下降（P＜0.05），而模型組和萬壽菊莖葉醇提物低、中、高劑量組的IL-10含量極顯著下降（P＜0.01）。

圖5 萬壽菊莖葉醇提物對LPS致炎小鼠血清炎性因子的影響Figure 5 Effect of alcohol extracts from Tagetes erecta L.stems and leaves on serum inflammatory factors in LPS-induced mice

與模型組相比，穿心蓮片組的IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、PGE2、iNOS 和 NO 的含量顯著下降（P＜0.05），其中 IL-1、IL-1β、IL-8、PGE2和 NO 差異極顯著（P＜0.01），而 IL-10 的含量變化無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；萬壽菊莖葉醇提物低劑量組小鼠血清中IL-1β和NO的含量顯著下降（P＜0.05），其余炎性因子含量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；萬壽菊莖葉醇提物中劑量組小鼠血清中 IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、PGE2、iNOS 和NO的含量顯著下降（P＜0.05），其中IL-1β和NO差異極顯著（P＜0.01），而IL-10的含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；萬壽菊莖葉醇提物高劑量組小鼠血清中IL-1β、IL-8、PGE2和NO的含量顯著下降（P＜0.05），尤以 IL-1β 和 NO 差異極顯著（P＜0.01），其余炎性因子變化無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

與穿心蓮片組相比，萬壽菊莖葉醇提物低劑量組小鼠血清中的IL-1和PGE2的含量顯著上升（P＜0.05），其余炎性因子變化無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；萬壽菊莖葉醇提物中劑量組小鼠血清中的所有炎性因子含量均無顯著變化（P＞0.05）；萬壽菊莖葉醇提物高劑量組小鼠血清中IL-1的含量極顯著上升（P＜0.01），PGE2含量顯著上升（P＜0.05），其余炎性因子變化無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

萬壽菊莖葉醇提物低、中、高劑量組間的IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、PGE2、iNOS 和 NO 均無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

萬壽菊是一種常見的經(jīng)濟作物，具有抗氧化、抗腫瘤、治療心血管疾病等作用[5]。目前，關(guān)于萬壽菊莖葉醇提物的鎮(zhèn)痛抗炎作用還未見文獻報道。在本試驗中，給予不同劑量的萬壽菊莖葉醇提物的小鼠在醋酸扭體試驗中的扭體次數(shù)均顯著低于空白對照組，表明該藥有良好的外周鎮(zhèn)痛作用；而在電熱板試驗中，給予不同劑量的萬壽菊莖葉醇提物后，僅高劑量組小鼠的痛閾值和鎮(zhèn)痛率顯著提高，其余各組與空白對照組相比無明顯差異，表明該藥僅在高劑量下具有中樞鎮(zhèn)痛作用。與其他菊科植物相比，萬壽菊莖葉醇提物同樣對化學(xué)性刺激引起的疼痛具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，能夠延緩疼痛的發(fā)生；對于物理性刺激引起的疼痛，則是在高劑量下且需較長代謝時間才發(fā)揮明顯的鎮(zhèn)痛作用[16-18]。黃酮類化合物具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，因此我們推測萬壽菊莖葉醇提物中起著鎮(zhèn)痛作用的活性成分可能為黃酮類化合物[19-20]。

LPS可誘導(dǎo)全身性炎癥產(chǎn)生，其作用于小鼠能夠引起小鼠死亡、攝食改變、身體蜷縮弓背、活動減少以及體重和體溫下降，對多種臟器均有損害作用[21-25]。本試驗的研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠在受到LPS的刺激后能引起體內(nèi)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大鼠心、肝、脾、肺和腎各臟器的臟器指數(shù)出現(xiàn)不同程度的增大，其中肝、肺的臟器指數(shù)最為明顯，這一結(jié)果與王光熙等人的結(jié)果一致[14]。為了進一步確認機體組織器官或者細胞的病變情況，本試驗通過石蠟切片HE染色對小鼠各臟器進行了觀察。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS誘導(dǎo)了小鼠全身炎癥之后，各組小鼠心、腎無明顯病變，肝、肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，脾臟紅髓脾竇充血。使用萬壽菊莖葉醇提物預(yù)處理后，肝、肺組織的炎性病變明顯減少，脾臟紅髓脾竇充血有所緩解，說明萬壽菊醇提物具有較好的抗炎作用。

綜上所述，萬壽菊具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎活性，其中高劑量的萬壽菊醇提物具有最好的鎮(zhèn)痛作用，而中劑量的萬壽菊醇提物具有最好的抗炎活性。