等高反坡階措施下玉米苗期根系分泌物特征及其對(duì)根際土壤酶活性的響應(yīng)

劉曉微， 王克勤*， 趙洋毅， 段 旭， 張 洋

（1.西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224）

坡耕地是我國(guó)山區(qū)的主要耕地類型，也是水土流失的主要發(fā)生地，由于人口的劇增，大量坡面林地被開墾成坡耕地，加之耕作管理方式的不合理，已經(jīng)引起耕作層變薄，土壤養(yǎng)分流失、保水保肥能力下降，作物產(chǎn)量大幅減少，農(nóng)業(yè)面源污染加劇[1-2]。因此，如何進(jìn)行坡耕地水土保持，減少其危害，是山區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵之舉[3]。目前國(guó)內(nèi)外常見的坡耕地水土保持措施主要包括坡改梯工程、壟作區(qū)田技術(shù)、保護(hù)性耕作和秸稈還田等，不同的措施可以增加土壤的肥力，提高作物的產(chǎn)量[3-4]。除此之外，等高反坡階作為一種水土保持措施，保水保土顯著，坡面徑流、泥沙攔截調(diào)控作用明顯，能降低土壤中氮、磷元素的減少速率，有效提高土壤酶活性[3，5-7]，研究已證明坡耕地布設(shè)等高反坡階措施尤其適用于降雨不均的云南山區(qū)[8]。

根系分泌物作為植物根系為適應(yīng)根際微環(huán)境和自身生長(zhǎng)需要而釋放出來的特殊物質(zhì)，對(duì)土壤結(jié)構(gòu)形成、改善土壤理化性質(zhì)、植物養(yǎng)分吸收和轉(zhuǎn)化利用、化感作用、土壤微生物分布和環(huán)境脅迫緩解等方面都具有重要的作用[9]。相關(guān)研究表明玉米根系分泌的化合物能加快大豆根瘤的形成，也可以改善花生對(duì)鐵的吸收，進(jìn)而提高玉米和花生的產(chǎn)量[10]。土壤酶是土壤新陳代謝的重要因素，其活性反映了各養(yǎng)分代謝的強(qiáng)度，在土壤肥力與土壤發(fā)育過程中作用顯著，但易受土壤理化性質(zhì)、根系分泌物和微生物的影響，是一個(gè)敏感的土壤生物學(xué)指標(biāo)[11]。當(dāng)前有關(guān)根系分泌物與土壤酶活性的研究主要集中在土壤結(jié)構(gòu)、陽離子交換量（CEC）、土壤理化性質(zhì)及微生物群落等方面[11-13]，或是大多集中在北方土石山區(qū)的溝壟種植[14]、秸稈還田[15-16]和覆膜壟播[17-18]等對(duì)土壤改良的影響方面，然而針對(duì)南方紅壤坡耕地水土保持措施下作物根系分泌物及與根際土壤酶活性關(guān)系的影響研究還鮮見開展。此外，玉米在中國(guó)的播種面積和總產(chǎn)量?jī)H次于水稻和小麥，在農(nóng)業(yè)中占有重要位置，特別在云南山區(qū)，其種植面積非常廣泛[19]。苗期是玉米生長(zhǎng)發(fā)育過程的關(guān)鍵時(shí)期，可直接影響后期的吸水吸肥效果，進(jìn)而影響玉米的產(chǎn)量[20]。因此，本研究以田間原位采集和室內(nèi)試驗(yàn)相結(jié)合的方法來分析坡耕地實(shí)施等高反坡階水土保持耕作措施后苗期玉米根系分泌物特征及與根際土壤酶活性的關(guān)系，從而揭示等高反坡階措施對(duì)玉米根系分泌物和根際土壤酶活性的影響，以期為區(qū)域坡耕地綜合治理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于云南省昆明市盤龍區(qū)松華壩水庫(kù)水源區(qū)的迤者小流域（24°14′43″～25°12′48″N，102°48′37″～102°44′51″E），屬于滇池水系盤龍江一級(jí)支流源頭區(qū)，地勢(shì)總體西北高東南低，全長(zhǎng)6.7 km，最高海拔2 589.5 m，最低海拔2 010 m，相對(duì)高度相差479.5 m，平均海拔2 220 m。該流域呈不規(guī)則紡錘形，是松華壩水源區(qū)典型農(nóng)業(yè)小流域，土地總面積21.56 km2，耕地面積約占25%，以坡耕地為主，林地約占66%，以灌木林和疏林地居多。該流域?qū)儆诒眮啛釒Ш团瘻貛Щ旌闲蜌夂?，夏秋溫?zé)?，冬春干涼，年平均氣?3.8℃，年平均降雨量785.1 mm，年蒸發(fā)量1 341 mm，雨季降雨量占全年的80%以上。該流域土壤主要是地帶性黏性紅壤，約占土地總面積的85%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)樣地布設(shè)

試驗(yàn)地位于松華壩水源區(qū)迤者小流域水土保持監(jiān)測(cè)站內(nèi)，選取2塊原狀坡耕地和2塊等高反坡階樣地，水平投影面積100 m2（20 m×5 m），坡度均為15°，南北坡向。等高反坡階沿等高線自上而下里切外墊，修成一個(gè)臺(tái)面，反坡5°，階長(zhǎng)5 m，階寬1.2 m，2條反坡臺(tái)階之間距離7.5 m（圖1）。每年雨季前會(huì)對(duì)樣地進(jìn)行重新整修，其特征和土壤理化性質(zhì)見表1。

圖1 樣地示意圖Figure 1 Schematic diagram of the experimental plot

表1 樣地基本情況Table 1 Basic of experimental plot

1.2.2 供試材料、作物與根際土壤采集

供試玉米為本地主栽品種“云瑞668”。2020年6月13日，在原狀坡耕地、等高反坡階上坡位、等高反坡階中坡位和等高反坡階下坡位（以下簡(jiǎn)稱上坡位、中坡位和下坡位）等行距打塘種植玉米，行距40cm，株距25 cm，穴內(nèi)施加基肥（尿素；氮磷鉀復(fù)合肥，總養(yǎng)分≥30%，N ∶P2O5∶K2O=1 ∶1 ∶1.2），每穴播種 2～3粒，后期除苗。2020年7月13日，于玉米苗期（3～4葉）在原狀坡耕地和等高反坡階上坡位、中坡位、下坡位用5點(diǎn)法分別選取5株長(zhǎng)勢(shì)均勻并具有代表性的玉米，挖出帶土體植株，盡量避免根系損壞，“抖土法”收集根際土壤，分別取每株玉米的根際土壤均勻混合后用四分法收集，去除土樣雜質(zhì)，取少量裝入鋁盒，測(cè)定土壤含水率[21]27-28；其余用冰袋保持土樣0～4℃，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，過2 mm篩后分兩部分，一部分放入4℃冰箱保存，用于土壤酶活性的測(cè)定[22]274-323，另一部分風(fēng)干研磨過0.25 mm篩后測(cè)定土壤化學(xué)性質(zhì)[21]33-135。

1.2.3 根系分泌物收集

將1.2.2收集完根際土壤的玉米植株帶回實(shí)驗(yàn)室，自來水少量多次反復(fù)清洗根部，去離子水沖洗2～3遍，根系分泌物收集液（H3BO35 μmol/L、CaCl2600 μmol/L、KCl 100 μmol/L、MgCl2200 μmol/L、pH 5.6）沖洗2～3次，將玉米植株移至裝有1 L根系分泌物收集液的容器中進(jìn)行培養(yǎng)收集，并及時(shí)加入微生物抑制劑2～3滴，用黑色塑料袋將容器包裹，對(duì)根部進(jìn)行遮光處理，持續(xù)向收集液中通入空氣，在室溫且光照良好的條件下培養(yǎng)4 h（9:00—13:00），將植株取出，立即用CH2Cl2萃取根系分泌物收集液，得到根系分泌物萃取液，在38℃、40 r/min條件下的真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，加入分析純CH2Cl2充分搖蕩溶解，注射器抽出，過0.45 μm有機(jī)相濾膜，裝入小棕瓶，4℃冷藏保存[23]。

1.3 試驗(yàn)測(cè)定分析

1.3.1 根系分泌物測(cè)定

檢測(cè)儀器為氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，安捷倫7890 B型）。色譜條件[24]：HP-5 MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；260 ℃進(jìn)樣口，載氣為 He（純度≥99.999%），流速 1 mL/min，進(jìn)樣量 1 μL，不分流進(jìn)樣；起始溫度的柱程序?yàn)?0℃，保持2 min；程序升溫至 150℃（20℃/min），220℃（5℃/min），250 ℃（6 ℃/min），依次保持 15 min。質(zhì)譜條件[23]：電子轟擊源轟擊，電壓70 eV，離子源溫度200℃，接口溫度280℃，四極桿溫度150℃，溶液延遲時(shí)間3.75 min，在 M/Z33～453AMU 的全掃描模式（SCAN）下掃描，主要調(diào)諧文件為標(biāo)準(zhǔn)模式。

1.3.2 土壤酶活性測(cè)定

脲酶活性測(cè)定用苯酚-次氯酸鈉比色法[22]294-297；蔗糖酶活性用3，5-二硝基水楊酸比色法[22]274-276；過氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法[22]320-323；酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定[22]309-312。

1.3.3 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

土壤的pH值用酸度計(jì)直接測(cè)定[21]135；土壤含水率采用鋁盒烘干法[21]27-28；土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化-油浴加熱法測(cè)定[21]33-36；土壤全氮測(cè)定采用自動(dòng)型定氮儀[21]41-44；土壤全磷用硫酸-高氯酸消煮法檢測(cè)[21]68-70；土壤速效磷采用比色法測(cè)定[21]74-76；土壤全鉀和速效鉀用火焰光度法進(jìn)行測(cè)定[21]85-90。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2010和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2018制圖。與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比進(jìn)行人工分析，全文各物質(zhì)的相對(duì)含量（%）均根據(jù)色譜圖檢出成分的峰面積計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 等高反坡階措施玉米苗期根系分泌物GC-MS的特征圖譜

由圖2知，特征峰明顯且密集分布，圖譜差異明顯，特征峰相差較大。在相同時(shí)間段，原狀坡耕地與等高反坡階玉米苗期根系分泌的物質(zhì)峰面積差異明顯，6.02～9.72 min，等高反坡階 1-十四碳烯、1-十四烷醇和環(huán)十四烷等物質(zhì)峰面積高于原狀坡耕地；12.36 min，1-十五碳烯和1-十九碳烯只在等高反坡階被檢測(cè)到；19.19 min，等高反坡階二十烷和二十二烷醇的峰面積低于原狀坡耕地；28.16 min，原狀坡耕地鄰苯二甲酸二異辛酯峰面積高于等高反坡階（圖2）。與原狀坡耕地相比，等高反坡階措施明顯改變了根系分泌物峰譜。

圖2 等高反坡階措施下玉米苗期根系分泌物掃描圖Figure 2 Scanning image of maize root exudates at the seedling stage under the measures of contour reverse-slope terrace

2.2 等高反坡階措施對(duì)玉米苗期根系分泌物的影響

2.2.1 玉米苗期根系分泌的共同成分

等高反坡階和原狀坡耕地玉米苗期相同根系分泌化合物共8類，包括烴類、酸類、醇類、醛類、酮類、酚類、酯類和其他類（圖3）。由圖3可知，不同化合物類別占比均有所差異，酸類物質(zhì)相對(duì)含量最高，其次是烴類物質(zhì)。酸類物質(zhì)在下坡位的相對(duì)含量與上坡位、中坡位和原狀坡耕地相比，增幅分別為9.83%、0.22%和8.53%；烴類物質(zhì)相對(duì)含量的變化趨勢(shì)為中坡位＞下坡位＞原狀坡耕地＞上坡位。

圖3 等高反坡階措施下玉米苗期根系分泌物化合物類別Figure 3 Types of root exudation compounds in maize seedling stage under the measures of contour reverseslope terrace

等高反坡階和原狀坡耕地鑒定出玉米苗期相同根系分泌物共88種（表2），其中，酸類物質(zhì)中的戊二酸、鄰苯二甲酸、三氯乙酸和苯甲酸等相對(duì)含量較高；烴類物質(zhì)多為簡(jiǎn)單的直鏈和支鏈烷烴，以1-十八碳烯和硅烷居多；醇類物質(zhì)主要是二十二烷醇和1-二十七烷醇；醛類物質(zhì)主要是E-14-十六烯醛；酮類物質(zhì)中苯乙酮的相對(duì)含量最高；酚類物質(zhì)相對(duì)含量較高的是2，4-雙（1，1-二甲基乙基）-苯酚；酯類物質(zhì)以鄰苯二甲酸二異辛酯為主。等高反坡階措施對(duì)玉米苗期根系分泌物的類別影響不大，但同種化合物的相對(duì)含量均有一定的差別。

表2 等高反坡階措施下玉米苗期根系分泌物共有成分Table2 Common components of root exudates of maize seedling under the measures of contour reverse-slope terrace

2.2.2 玉米苗期根系分泌的特有成分

由表3可知，六甲基-環(huán)三硅氧烷、苯丙酸和苯丁酸等物質(zhì)僅在原狀坡耕地被檢測(cè)到；十七醛只存在上坡位；癸酸、十八酸和1-（1，1-二甲基乙基）-3-甲基-苯等物質(zhì)在下坡位被檢測(cè)出。在原狀坡耕地與上坡位檢測(cè)出八甲基-環(huán)四硅氧烷、2-氯丙酸和硅酸等物質(zhì)，且這些物質(zhì)在原狀坡耕地相對(duì)含量均顯著大于上坡位（P＜0.05）。布設(shè)等高反坡階措施后，玉米根系分泌物增加了十三烷、Z-5-正癸烯和環(huán)十二烷醇等物質(zhì)，這些物質(zhì)的相對(duì)含量變化趨勢(shì)為下坡位＞中坡位＞上坡位，均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。說明等高反坡階措施改變了玉米根系分泌物質(zhì)的種類和含量。

表3 等高反坡階措施下玉米苗期根系分泌物特有成分Table 3 Peculiar components of root secretion of maize seedling under the measures of contour reverse-slope terrace

2.3 等高反坡階措施對(duì)玉米根際土壤酶活性的影響

等高反坡階措施對(duì)4種根際土壤酶活性提高均有一定的促進(jìn)作用，4種酶活性均表現(xiàn)為下坡位＞中坡位＞上坡位＞原狀坡耕地（圖4）。不同根際土壤酶活性之間呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，脲酶和蔗糖酶活性在等高反坡階措施下隨坡位的下移其活性逐漸增強(qiáng)，且均顯著高于原狀坡耕地（P＜0.05），增幅分別為14.28%～78.57%、9.58%～56.16%；過氧化氫酶活性的變化規(guī)律與蔗糖酶一致，增幅為23.11%～33.09%；等高反坡階不同坡位磷酸酶活性差異不明顯（P＞0.05），但與原狀坡耕地均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），增幅為44.94%～92.92%?？梢?，等高反坡階措施能明顯增強(qiáng)根際土壤酶活性。此外，玉米根際土壤4種酶活性相互之間均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）（表4），表明過氧化氫酶（還原酶）活性與其他3種酶（水解酶）活性之間存在密切關(guān)系。

圖4 等高反坡階措施下玉米根際土壤酶活性Figure 4 Soil enzyme activities in the maize rhizosphere under the measures of contour reverse-slope terrace

表4 玉米苗期根系分泌物與根際土壤酶活性間的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 4 Correlation coefficient matrix between maize seedling root exudates and rhizosphere soil enzyme activities

2.4 等高反坡階措施下玉米苗期根系分泌物與根際土壤酶活性的關(guān)系

由表4可知，脲酶活性與根系分泌化合物類別的酸類、苯酚類和酯類呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），與烴類、醇類呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。蔗糖酶活性與酸類、醇類呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；過氧化氫酶活性與酸類、醇類和酯類呈極顯著正相關(guān)性（P＜0.01）；磷酸酶活性與過氧化氫酶活性表現(xiàn)出大致相同的規(guī)律，但還與苯酚類呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。此外，根際土壤4種酶活性均與根系分泌物總量之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），說明玉米苗期根系分泌物與根際土壤酶活性間存在顯著的關(guān)系。

3 討論

3.1 等高反坡階措施對(duì)玉米苗期根系分泌物的影響

本研究通過CH2Cl2萃取和GC-MS檢測(cè)玉米苗期根系分泌物，鑒定出烴類、酸類、酮類、醇類、酚類和酯類等化合物，這與馬鳳鳴等[25]研究大致相同，但柴強(qiáng)等[26]檢測(cè)出酰胺類物質(zhì)，韓旭等[27]檢測(cè)出肟類和萘胺類物質(zhì)，與本研究有所差異，可能是不同植物引起，也可能是同一植物在不同生長(zhǎng)發(fā)育期根系分泌不同的化合物造成[28]。

根系分泌物是植株與根際微生態(tài)系統(tǒng)的重要樞紐，根際環(huán)境的變化使植物根系分泌物含量和種類差異明顯[9]，王婷等[12]研究表明玉米在不同種植模式下根系分泌物種類和含量存在差異；彭鈺潔等[29]在不同氮肥減施試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)玉米苗期根系分泌物種類和含量明顯不同。本研究結(jié)果表明，等高反坡階措施和原狀坡耕地玉米苗期根系分泌物化合物類別大致相同；布設(shè)等高反坡階措施后，玉米苗期根系分泌物的種類和相對(duì)含量發(fā)生改變。徐國(guó)偉等[15，17]研究表明不同整地措施影響根系分泌物的種類和相對(duì)含量，本研究與此大致相同，不同整地措施增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，促進(jìn)作物對(duì)土壤速效養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而改變作物根系分泌模式[14]。玉米在等高反坡階和原狀坡耕地共鑒定出相同根系分泌物88種，其中大部分物質(zhì)均與柴強(qiáng)等[26]研究相同，但本試驗(yàn)還檢測(cè)出三氯乙酸，這與前人有所差異，主要原因是他們大多采用實(shí)驗(yàn)室水培法收集根系分泌物[26，30]，而本試驗(yàn)的玉米是在自然環(huán)境下種植，栽種過程中人們會(huì)使用農(nóng)藥（農(nóng)藥中含有三氯乙酸）抑制病蟲害[31]。在該試驗(yàn)中，在布設(shè)等高反坡階措施后，玉米苗期根系分泌物增加十三烷、Z-5-正癸烯和環(huán)十二烷醇等物質(zhì)，引起這種差異的原因是等高反坡階措施可以改變土體結(jié)構(gòu)，減少土壤蒸散發(fā)，提高土壤水分，改善土壤理化性質(zhì)，改變玉米根際土壤微環(huán)境，進(jìn)而引起玉米根系分泌更多的化合物[3，5-6]。

3.2 等高反坡階措施對(duì)根際土壤酶活性的影響

土壤酶推動(dòng)著土壤的生化過程，影響著土壤肥力水平，其活性高低可以衡量土壤肥力[11]。土壤中廣泛存在脲酶，可直接參與有機(jī)氮轉(zhuǎn)化，為植物生長(zhǎng)提供可利用氮[18]。蔗糖酶活性多用來反映土壤肥力，提高土壤生物活性，增加土壤可溶性養(yǎng)分含量[32]。過氧化氫酶活性高低標(biāo)志著土壤氧化還原能力的大小，影響土壤有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化速度和有效性[18]。磷酸酶活性直接影響土壤有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化，影響土壤磷素有效性[16]。本研究得出，布設(shè)等高反坡階措施后，根際土壤脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶和磷酸酶活性均得到顯著提高，且隨著坡位的下移，酶活性呈增加趨勢(shì)。等高反坡階措施對(duì)根際土壤酶活性有一定的促進(jìn)作用，改善土壤肥力狀況，利于作物生長(zhǎng)，這與前人研究結(jié)果一致[7]。此外，在本研究中4種根際土壤酶活性彼此之間呈極顯著正相關(guān)，說明它們?cè)趨⑴c土壤物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化過程不是單獨(dú)發(fā)揮作用，而是存在共性關(guān)系，共同影響土壤養(yǎng)分狀況，彼此之間改善土壤環(huán)境[33]。

3.3 等高反坡階措施下玉米根系分泌物與根際土壤酶活性的關(guān)系

植物根系分泌物是根部長(zhǎng)期進(jìn)化產(chǎn)生的，而且是一種適應(yīng)環(huán)境的體現(xiàn)，所以植物能夠根據(jù)環(huán)境的改變不斷地調(diào)整自身的分泌模式[9]，根際土壤酶的種類和活性可以改變土壤養(yǎng)分的有效性，進(jìn)而影響作物的吸收利用[34]。本研究表明4種根際土壤酶活性與玉米苗期根系分泌物中某些類別的化合物之間呈顯著相關(guān)關(guān)系，與其總量呈極顯著的正相關(guān)。此外，布設(shè)等高反坡階措施后，玉米根系分泌物含量呈增加趨勢(shì)，4種根際土壤酶活性也表現(xiàn)出相同的規(guī)律。劉守偉等[35]研究表明分蘗洋蔥根系分泌物可以促進(jìn)黃瓜根際土壤酶活性的提高，張立芙等[36]研究提出黃瓜根系分泌物可以增加土壤酶活性，這說明根系分泌物與土壤酶活性之間確實(shí)存在著一種活化促進(jìn)作用，本研究與此大致相同。根系分泌物作為土壤酶的主要來源，利于土壤酶活性的提高，同時(shí)有助于微生物的生長(zhǎng)繁殖，而微生物分泌物又是土壤酶來源的重要渠道，進(jìn)而間接提高土壤酶活性，這可能也是本研究根際土壤酶活性增加的原因[37]。

4 結(jié)論

等高反坡階措施下玉米苗期根系分泌物檢測(cè)出的化合物主要以低分子有機(jī)酸和結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單的直鏈或支鏈烷烴為主，還包括酮類、醛類、醇類、酚類和酯類等化合物。布設(shè)等高反坡階措施后增加玉米苗期根系分泌物的種類，改變根系分泌物的相對(duì)含量，有效提高根系分泌物中酸類化合物的含量；該措施提高玉米根際土壤脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶和磷酸酶的活性，土壤酶相互之間呈極顯著正相關(guān)，共同影響著土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化。該措施下的根系分泌物相對(duì)含量增加，土壤酶也呈增加趨勢(shì)，且二者之間表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)，說明二者存在著一種活化促進(jìn)效應(yīng)。因此，生產(chǎn)實(shí)踐中可通過布設(shè)等高反坡階措施來增加土壤酶活性和根系分泌物含量，改善土壤理化性狀，以提高土壤肥力，促進(jìn)作物的生長(zhǎng)。