肝豆?fàn)詈俗冃缘幕蛟\斷研究進(jìn)展

姚碧蓮， 張欣欣， 韓 悅

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院a.全科醫(yī)學(xué)科；b.臨床病毒研究室，上海200025）

肝豆?fàn)詈俗冃杂址Q威爾遜?。╓ilson disease，WD），是由于ATP酶銅轉(zhuǎn)運(yùn)β基因ATP7B[1-2]發(fā)生變異、造成體內(nèi)銅代謝紊亂的常染色體隱性遺傳病。該基因的致病變異導(dǎo)致ATP酶的功能缺陷或喪失，造成膽道排銅障礙，大量銅蓄積于肝、腦、腎、骨關(guān)節(jié)、角膜等組織和臟器[3-5]。本病在世界范圍內(nèi)攜帶者頻率為1∶100～1∶90，流行率在1∶40 000～1∶30 000之間[6]。既往國(guó)外報(bào)道WD人群發(fā)病率為1/10萬(wàn)～1/3萬(wàn)，雜合子頻率為1/200～1/100[7]，而英國(guó)一項(xiàng)研究認(rèn)為其理論發(fā)病率不低于1/7 026，推測(cè)外顯率低下和診斷的局限性可能是實(shí)際發(fā)病率統(tǒng)計(jì)偏低的主要原因[8]。胡文斌等在安徽省3個(gè)縣連續(xù)進(jìn)行2次調(diào)查，共調(diào)查153 370人，發(fā)現(xiàn)WD患者9例，推測(cè)患病率為5.87/10萬(wàn)[9-10]。一 般 認(rèn) 為 該病發(fā)病率在中國(guó)比西方國(guó)家更高[11]。

由于銅沉積的組織器官不同，因此臨床上WD患者臨床表現(xiàn)多種多樣，臨床表現(xiàn)既往可主要分為肝型、腦型、混合型和其他類型。肝型患者主要臨床癥狀包括無(wú)癥狀性轉(zhuǎn)氨酶升高、肝腫大、脾腫大、肝炎、脂肪肝、肝硬化和急性肝衰竭等。腦型患者表現(xiàn)主要包括帕金森綜合征，運(yùn)動(dòng)障礙，口、下頜肌張力障礙，精神癥狀等。因過(guò)量的銅還會(huì)沉積于腎臟、骨骼關(guān)節(jié)、血液、皮膚、角膜等其他組織器官中，引起相應(yīng)的組織器官損傷，可表現(xiàn)為蛋白尿、血尿、全身水腫、骨折、關(guān)節(jié)疼痛、心肌損害、肌病、溶血性貧血、皮膚色素沉著、角膜色素環(huán)（Kayser-Fleischer ring，K-F環(huán)）等[12]。臨床分型更為全面的有潛伏型（癥狀前期型）、腦型、內(nèi)臟型、腦-內(nèi)臟型、骨-肌型、脊髓型/腦脊髓型[13]。中國(guó)最新發(fā)布的《中國(guó)肝豆?fàn)詈俗冃栽\治指南2021》著重將復(fù)雜臨床表現(xiàn)按肝損害、神經(jīng)精神損害、其他系統(tǒng)損害及癥狀前個(gè)體進(jìn)行詳細(xì)敘述[14]。

WD目前診斷依靠臨床癥狀[神經(jīng)和（或）精神癥狀、原因不明的肝損害、K-F環(huán)陽(yáng)性]、溶血、生化檢查[血清銅藍(lán)蛋白降低和（或）24 h尿銅升高]以及ATP7B基因檢測(cè)[15]。WD患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，可累及各個(gè)系統(tǒng)，早期臨床癥狀多樣且不典型，極易被誤診或漏診，生化檢查存在假陽(yáng)性、假陰性，早期診斷較為困難。肝臟組織銅定量檢測(cè)雖然有較高的特異性和診斷價(jià)值，但該檢查為有創(chuàng)操作，存在風(fēng)險(xiǎn)。因此基因檢測(cè)對(duì)于患者的篩查、早期診斷和精確診斷有重要意義。

ATP7B基因及突變

研究認(rèn)為，WD是雙等位基因變異引起的單基因缺陷疾病。ATP7B基因定位于13q14.3，有21個(gè)外顯子，編碼區(qū)長(zhǎng)4.1 kb。已知突變主要集中在幾個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，同時(shí)存在大量罕見突變。到目前為止，人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD，www.hgmd.org）報(bào)道了907個(gè)不同的有害變異，通過(guò)編碼外顯子和內(nèi)含子序列分析，可檢測(cè)到878個(gè)變異（96.8%）[16]，還有很多新的突變不斷被認(rèn)識(shí)。其突變類型很復(fù)雜，包括錯(cuò)義、無(wú)義、缺失、插入、剪切位點(diǎn)突變，其中由單核苷酸引起的錯(cuò)義或無(wú)義突變最常見（60%），其次是插入、缺失（26%）和剪切位點(diǎn)突變（9%）[17]。p.H1069Q突變是西方人群較常見的突變之一，大多以復(fù)合雜合形式出現(xiàn)，合并的突變不同[18]。我國(guó)WD患者主要有p.R778L、p.P992L和p.T935M 3個(gè)高頻致病突變，占所有致病突變的50%～60%[19-22]，其他7種常見突變包括p.A874V、p.I1148T、p.Q511X、p.N1270S、p.G943D、p.R919G和p.R778Q，可占所有致病突變的67%[20]。由于不斷有新的突變被發(fā)現(xiàn)，ATP7B基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)是動(dòng)態(tài)更新的。楊任民等[23]在1997年率先報(bào)道了國(guó)內(nèi)WD患者新的變異位點(diǎn)S662T；我院張欣欣課題組研究總結(jié)了我國(guó)WD的基因型-臨床表型特點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)擴(kuò)充了14個(gè)新的突變[24]。另外有長(zhǎng)期研究在2004—2015年中國(guó)632例WD患者中發(fā)現(xiàn)173個(gè)ATP7B變異，其中58個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的變異[25]。

基因診斷策略

一、疑似患者基因檢測(cè)

針對(duì)臨床疑似患者，基因檢測(cè)方法包括對(duì)21個(gè)外顯子編碼區(qū)域及其相應(yīng)鄰近的內(nèi)含子區(qū)域序列的分析，可以根據(jù)當(dāng)?shù)厝巳褐型蛔冾l率的不同，將突變熱點(diǎn)區(qū)域的外顯子優(yōu)先排序。如果使用一代測(cè)序方法不能發(fā)現(xiàn)ATP7B外顯子編碼區(qū)域和鄰近內(nèi)含子序列存在已知致病相關(guān)變異或突變，臨床仍高度懷疑，則可考慮啟用二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)，包括全外顯子測(cè)序（whole-exome sequencing，WES）或全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing，WGS），對(duì)ATP7B基因進(jìn)行更全面的測(cè)序（可包含啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域的序列），或?qū)ふ野ˋTP7B基因在內(nèi)的其他肝病相關(guān)的基因是否存在罕見、未知突變或其他結(jié)構(gòu)改變，并結(jié)合家系基因型-臨床表型或?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)判斷致病性，擴(kuò)充WD致病相關(guān)基因突變庫(kù)。NGS具有高通量檢測(cè)特點(diǎn)，比一代測(cè)序能更全面地檢測(cè)出基因突變，提高診斷效率。在北美和歐洲兒科胃腸病學(xué)、肝病學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)的最新指南已經(jīng)推薦在合適的情況下使用NGS檢測(cè)基因突變[26]。隨著成本的控制，NGS技術(shù)在臨床工作中有更多的應(yīng)用機(jī)會(huì)。

二、WD患者家系篩查

針對(duì)確診WD患者進(jìn)行家系篩查至關(guān)重要?；颊咝值芙忝檬羌兒献拥母怕适?5%，患者子女是純合子的概率是0.5%。對(duì)于家屬的基因檢測(cè)，可以通過(guò)一代測(cè)序分析患者所示的致病突變基因或者單倍型分析，如發(fā)現(xiàn)致病突變基因或致病單倍型，可協(xié)助診斷WD（見圖1），及時(shí)予以治療。

圖1 WD基因檢測(cè)對(duì)象及策略

我國(guó)2021年新版指南提醒臨床醫(yī)師應(yīng)高度警惕血清銅藍(lán)蛋白<120 mg/L的個(gè)體及肝酶升高且24 h尿銅≥40 μg兒童，建議進(jìn)行ATP7B基因檢測(cè)以明確診斷[19]。同時(shí)更新了WD的基因篩查策略，指出臨床醫(yī)師應(yīng)先針對(duì)性篩查我國(guó)WD患者的ATP7B基因高頻致病突變，有助于節(jié)約醫(yī)療資源。對(duì)于未檢出高頻致病變異的患者，進(jìn)一步篩查ATP7B基因全長(zhǎng)編碼區(qū)及其側(cè)翼序列的致病變異以助于確診。

ATP7B基因突變與基因型-表型的關(guān)系分析

目前，眾多研究集中在探索基因型和表型之間的關(guān)系，并嘗試解釋其復(fù)雜多樣的臨床表現(xiàn)?；谌巳簶颖镜囊豁?xiàng)研究表明，患者在血銅藍(lán)蛋白水平較低的情況下，p.R778L純合子突變患者較雜合子突變患者肝損害表現(xiàn)明顯，即p.R778L突變對(duì)ATP7B功能影響較大[27-28]。有細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證明，p.R778L突變與p.T935M和p.R919G突變相比對(duì)功能影響更大[29-30]。有研究認(rèn)為p.R778L突變WD患者的發(fā)病年齡較晚，與首發(fā)癥狀和銅代謝障礙無(wú)關(guān)[31]。但是另一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)人群的研究發(fā)現(xiàn)，p.R778L預(yù)示發(fā)病年齡更早，銅藍(lán)蛋白及血清銅的水平更低，而p.T935M和p.R919G則與銅藍(lán)蛋白水平較高有關(guān)。攜帶p.R919G的患者多以單純神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主，而攜帶p.T935M的患者則往往同時(shí)具有神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟病變的表型[21]。在有限的人群樣本中，研究發(fā)現(xiàn)p.L492S、p.V519M、p.E541K、p.L549P、p.A604P、p.R616W、p.P992L、p.N1270S等往往預(yù)示著發(fā)病年齡較早，而具有p.I1148T突變的患者則大多在12歲后發(fā)病[32]。另有研究表明，p.M769Hfs*26（c.2299insC）攜帶者肝臟疾病癥狀表現(xiàn)較多，帶有p.H1069Q/p.M769Hfs*26復(fù)合雜合突變的患者常常具有相似的臨床表型和發(fā)病年齡，表現(xiàn)為構(gòu)音障礙及吞咽困難等癥狀[33]。而p.A1003T突變攜帶者與神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間關(guān)聯(lián)更為密切[18]。還有文獻(xiàn)報(bào)道，臨床上有極少部分的WD患者并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)銅藍(lán)蛋白水平降低，可能是位于第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的p.S653Y突變阻止了ATP7B從反面高爾基網(wǎng)（trans-Golgi network，TGN）上的解離，但在此之前，其能夠正常轉(zhuǎn)運(yùn)銅離子以供銅藍(lán)蛋白的合成，因此造成了該少見的臨床表型[34]。已報(bào)道的外顯子長(zhǎng)片段缺失突變有5種（Exon2-4deletion、Exon5-6deletion、Exon6-8deletion、Exon20deletion、Exon20-21deletion）[35]。在以往的研究中，攜帶大片段缺失的幼兒多存在較為嚴(yán)重的肝臟病變，如進(jìn)行性肝炎、肝硬化、肝衰竭，但無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[36]（見表1）。

表1 ATP7B突變與臨床表型

ATP7B基因單核苷酸多態(tài)性攜帶者發(fā)病分析

臨床上有極少部分的患者僅檢測(cè)出ATP7B基因中的基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)。例如p.S406A、p.V456L p.K832R、p.R952K等，相對(duì)于野生型ATP7B的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)速率較低，但并未從根本上影響ATP7B基因功能[37]。在基因分析過(guò)程中，會(huì)常規(guī)過(guò)濾掉人群中常見的SNP位點(diǎn)，因而會(huì)漏掉許多功能性SNP。對(duì)于WD患者，需要在基因檢測(cè)中注意上述這些位點(diǎn)的變異。

修飾基因?qū)D臨床表型可能存在的影響

不同WD患者之間的臨床表型差異較大，甚至在相同生活背景下的家系成員間也時(shí)常有所不同，因此不能排除其他基因參與了致病過(guò)程。銅代謝結(jié)構(gòu)域包含性蛋白1（copper metabolism domain containing 1，COMMD1）是一種與銅代謝紊亂相關(guān)的蛋白，其第164位天冬氨酸的同義突變p.D164D是p.H1069Q純合突變患者神經(jīng)和肝臟癥狀早發(fā)的重要因素[38]。此外，存在超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase，SOD2）基因p.V16A純和突變的男性患者常常發(fā)病較早，而存在過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）基因c.262C>T純和突變的男性患者發(fā)病較晚[40]。在印度人群中，有研究發(fā)現(xiàn)伴有神經(jīng)癥狀WD患者的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）大多存在p.Y90Y同義突變，且患者的平均發(fā)病年齡明顯推遲，提示BDNF可能作為一種潛在的ATP7B相關(guān)修飾基因影響WD患者的表型[41]。還有研究者提出載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）和朊粒蛋白（prion protein，PRNP）的突變是影響WD患者臨床表型的潛在因素，其突變可能與WD患者神經(jīng)系統(tǒng)表型相關(guān)[42-45]。Kluska等[45]對(duì)248例WD患者進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序分析，該研究確定了酯酶D（eaterase D，ESD）和染色體重塑因子INO80（INO80 complex subunit）2種新的可能變異，分別與神經(jīng)癥狀風(fēng)險(xiǎn)的增加和降低有關(guān)。

其他已報(bào)道的WD修飾基因還包括人銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（human antioxidant 1 copper chaperone，ATOX1）[46]、X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP）[47]、patatin樣磷脂酶域蛋白3（patatin like phospholipase domain containing 3，PNPLA3） 基 因[48]、 亞 甲 基 四 氫 葉 酸 還 原 酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）[49]（見表2）。

表2 修飾基因突變與臨床表型

另外，在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，有文獻(xiàn)報(bào)道[50]，全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序在人類肝臟樣本中發(fā)現(xiàn)了969個(gè)高甲基化和871個(gè)低甲基化差異性甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR），其中包括18個(gè)具有全基因組意義的區(qū)域。WD患者肝臟的DMR與葉酸、脂質(zhì)代謝和急性炎癥反應(yīng)等功能豐富的基因相關(guān)，并能區(qū)分WD患者早期和晚期纖維化。通過(guò)檢測(cè)血液中DMR可區(qū)分肝型WD患者組、健康組和疾病對(duì)照組，并可區(qū)分肝型WD和腦型WD。這提示了表觀變化對(duì)致病性的影響，給未來(lái)的臨床診斷帶來(lái)更多的思路和方法。

總結(jié)和展望

由于WD可以在任何年齡起病，癥狀復(fù)雜多變且隱匿，給臨床早期診斷帶來(lái)了很大的困難。基因檢測(cè)對(duì)于患者的篩查、早期和精確診斷有重要意義。中外基因突變譜系、熱點(diǎn)突變優(yōu)先排序往往存在差異，而且ATP7B基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)是動(dòng)態(tài)更新的，需要持續(xù)與國(guó)際、國(guó)內(nèi)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)接。目前的研究難點(diǎn)在于除少數(shù)熱點(diǎn)突變外，多數(shù)突變?cè)谌巳褐械念l率極低，一般難以收集到足夠的病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，而ATP7B基因型-表型依賴大量臨床數(shù)據(jù)積累，進(jìn)而在功能學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上可明確相應(yīng)致病性并輔助診斷。另外，除了ATP7B基因本身，其他遺傳因素也可影響臨床表現(xiàn)，其中表觀遺傳因素對(duì)WD表型異質(zhì)性的作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。