低溫脅迫下外源SOD對矮牽牛生理特性的影響

王曉曉

(重慶大學(xué)城市科技學(xué)院， 重慶 402167)

矮牽牛(Petuniahybrida)生存于南美洲地區(qū)，作為一種易存活的園林觀賞植物，矮牽牛如今在多個國家廣泛種植。矮牽牛屬于多年生草本植物，株高一般在15～80 cm之間，葉子為橢圓形或者卵圓形，花冠酷似喇叭狀，當(dāng)年播種即可開花數(shù)月。矮牽牛更容易在陽光充足、溫暖的環(huán)境中生存，其缺點(diǎn)是懼怕雨水、不耐低溫霜凍。如果冬季生存溫度達(dá)不到4 ℃，矮牽牛植株則停止生長。對于冬季溫度在4 ℃左右、甚至達(dá)不到4 ℃的種植環(huán)境而言，矮牽牛在低溫脅迫下越冬生存面臨困境。因此，充分了解低溫冷害對矮牽牛生長過程的影響引起了園林植物研究領(lǐng)域的重視[1]。

超氧化物歧化酶(SOD)是植物抗性系統(tǒng)酶，當(dāng)植物遭受低溫脅迫時，SOD等多種抗氧化酶活性產(chǎn)生變化以避免植物膜組織受損傷，賦予了植物抵抗逆境脅迫的能力[2]。在提供植物生長所需外源SOD、生長能量方面發(fā)揮重要作用，有效輔助低溫下植物快速生長[3]。因此，為改善植物的低溫抗逆性，可對低溫脅迫下生長的植物施加外源SOD。超氧化物歧化酶模型化合物是外源SOD的重要形式，一方面可提高植物抗旱、抗寒、抗病等能力，兼具農(nóng)藥與微肥作用；另一方面，在穩(wěn)定性與高效性方面表現(xiàn)顯著，汲取了天然酶與人工合成化合物的優(yōu)勢。

聚天冬氨酸錳(MSOD)作為一種人工合成化合物，對植物生長促進(jìn)作用十分顯著[4]。根據(jù)現(xiàn)有研究成果可知，MSOD在提高植物抗寒、抗旱、抗病、吸收肥料養(yǎng)分能力等方面發(fā)揮著重要作用，MSOD不僅能夠改善植物抗逆性，還能促進(jìn)植物生長發(fā)育，起到施加微肥與藥物的作用[5-6]。因此本研究選定MSOD作為外源模擬物，以園林植物矮牽牛作為研究對象，記錄正常溫度處理、普通低溫處理、低溫脅迫施加MSOD處理3種方式下矮牽牛生理特性變化，以獲取低溫脅迫下外源SOD對矮牽牛生理特性的影響規(guī)律。此研究對于改善園林植物矮牽牛低溫冷害環(huán)境下的生長狀態(tài)、幫助矮牽牛適應(yīng)低溫環(huán)境具有指導(dǎo)意義，令低溫逆境中生存的矮牽牛安全越冬。此外，MSOD分子量適宜、沒有毒性、水溶性優(yōu)，應(yīng)用與推廣前景廣闊，是當(dāng)前植物生長抗逆領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣品培育

本研究矮牽牛試驗(yàn)品種來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，隨機(jī)選取優(yōu)質(zhì)矮牽牛種子對其進(jìn)行種植前處理。首先，采用0.1%濃度的升汞對矮牽牛種子表皮進(jìn)行消毒，持續(xù)3 min，消毒完畢使用蒸餾水多次沖洗種子；其次，種子浸泡10 h，于培養(yǎng)皿中進(jìn)行種子培育，直至種子發(fā)芽；培育環(huán)境溫度設(shè)置在25 ℃左右，每天給矮牽牛交替施加12 h 25 ℃光照處理、12 h 18 ℃黑暗處理。試驗(yàn)所需外源SOD人工合成模擬物MSOD購自德賽化工有限公司，其外觀呈現(xiàn)黃色至紅棕色，狀態(tài)粘稠；MSOD基本屬性如下：pH值8.5～10.5，固體成分超過30%，當(dāng)環(huán)境溫度低于20 ℃時其密度不小于1.15。當(dāng)矮牽牛生長成幼苗時移栽至大型種植容器中進(jìn)行低溫脅迫測試，試驗(yàn)前定制占地面積為0.16 m2(長寬各為40 cm)、高度0.15 m的栽種容器，挑選長勢一致的矮牽牛幼苗分別種植在容器中，栽種15盆待用。

1.2 樣品處理

矮牽牛植株樣品類型劃分如下：1) ck1：將一盆矮牽牛植株置于正常溫度環(huán)境下生長；2) 低溫脅迫施加MSOD處理：矮牽牛生長處于“三葉一心”狀態(tài)時將3盆矮牽牛植株置于低溫環(huán)境下生長，并施加不同含量的MSOD，X1為施加2.5 mg·L-1濃度的植株，X2為施加5.5 mg·L-1濃度的植株，X3為施加8.5 mg·L-1濃度的植株。3) ck2將一盆矮牽牛置于低溫環(huán)境下生長，施加清水代替MSOD。每個處理3次重復(fù)，各處理的管理措施相同。

矮牽牛低溫環(huán)境處理的具體方法如下：1) 第一階段是冷馴化期：每天給矮牽牛交替施加12 h 11 ℃的光照處理、12 h 5 ℃黑暗處理，光照強(qiáng)度上限設(shè)置為2 000 lx。2) 第二階段是低溫脅迫處理期：在冷馴化期一個月之后執(zhí)行，由于矮牽牛外界環(huán)境達(dá)到0 ℃時基本停止生長，所以低溫脅迫環(huán)境溫度不能低于0 ℃，因此每天給矮牽牛交替施加12 h 2 ℃的光照處理、12 h 0 ℃黑暗處理，光照強(qiáng)度上限仍為2 000 lx。MSOD、清水要每隔7 d噴施1次，噴施3次后進(jìn)行樣品采集并進(jìn)行生理指標(biāo)測定。

1.3 生理指標(biāo)測定

當(dāng)矮牽牛植株生長至花蕾期，在同一天內(nèi)進(jìn)行矮牽牛葉片采樣，所有采樣過程中均盡量挑選植株相同部位葉片，降低外部因素導(dǎo)致的葉片生理指標(biāo)差異；樣品采摘后清洗存放在4 ℃環(huán)境中保存待用。

1) 生長指標(biāo)測定：矮牽牛試驗(yàn)處理全部結(jié)束后，使用高精度儀器測量莖基部和頂葉葉尖間距，即莖葉長度；將最長根系作為根長測量對象，測量根基部至根尖間距，即根部長度；每種MSOD濃度下各采集6份樣品取其均值，保障矮牽牛生長指標(biāo)測定的精準(zhǔn)度，最后統(tǒng)計(jì)不同處理下矮牽牛的側(cè)根數(shù)量[7]。

2) POD活性測定：基于愈創(chuàng)木酚法測定POD酶活性[8]。

3) 全氮含量測定：分別使用半微量凱氏定氮法、釩鉬黃比色法、火焰光度法測定矮牽牛植物體內(nèi)氮磷鉀含量[9]。以上指標(biāo)測定與測量需要重復(fù)執(zhí)行3次，取平均值作為最終測定結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2017與SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件完成數(shù)據(jù)處理與分析，采用visio軟件繪制結(jié)果趨勢圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下外源SOD對矮牽牛生長指標(biāo)的影響

本研究使用根系長度、莖葉的長度、根部須數(shù)描述矮牽牛生長情況，分析不同濃度MSOD在低溫環(huán)境下對矮牽牛生長的促進(jìn)作用(圖1)?？傮w而言，低溫脅迫環(huán)境下矮牽牛施加MSOD能夠促進(jìn)其多項(xiàng)生長指標(biāo)的發(fā)展。正常溫度環(huán)境下生長的矮牽牛(ck1)側(cè)根數(shù)量最多，莖葉長度、根部長度最大；低溫環(huán)境下生長僅施加清水的矮牽牛(ck2)側(cè)根數(shù)量最少、莖葉長度、根部長度最小，由此可見，低溫阻礙了矮牽牛的正常生長。同樣低溫環(huán)境下施加MSOD的樣本呈現(xiàn)優(yōu)于ck2的生長趨勢，在本研究范圍內(nèi)，MSOD濃度越高、樣本長勢越好。低溫環(huán)境下施加8.5 mg·L-1濃度的MSOD矮牽牛樣本，側(cè)根數(shù)量達(dá)到9，與正常溫度環(huán)境生長的樣本持平，莖葉長度與根部長度分別達(dá)到3.63 cm、5.01 cm，接近正常溫度環(huán)境生長情況。因此，低溫環(huán)境下適量添加MSOD有助于矮牽牛生長指標(biāo)的提升，對其生長具有促進(jìn)作用。此外，當(dāng)MSOD施加濃度為8.5 mg·L-1時，和ck2相比，矮牽牛的莖葉長度、側(cè)根數(shù)量、根部長度均表現(xiàn)出顯著相關(guān)性(p<0.05)。

圖1 矮牽牛生長指標(biāo)趨勢

2.2 低溫脅迫下外源SOD對矮牽牛POD指標(biāo)的影響

作為清除活性氧的關(guān)鍵酶，POD在避免膜質(zhì)氧化、促進(jìn)植物生長發(fā)育、抗病、抗寒方面貢獻(xiàn)突出。在一個氧化還原反應(yīng)中，如果采用的氧化劑為過氧化氫，那么過氧化物POD能夠?qū)@段氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生加速催化作用，將過氧化氫還原成水。POD將過氧化氫還原成水的過程有利于平衡植物體內(nèi)活性氧的分布，因此判斷矮牽?？购芰Φ难芯靠梢隤OD酶活性指標(biāo)作為參考。由圖2可知，ck2處理下的POD酶活性最低，ck1處理下的POD酶活性最高，這是因?yàn)殡S著矮牽牛溫度的降低其植物體內(nèi)的POD酶活性能力被弱化。低溫環(huán)境脅迫下，采用2.5 mg·L-1濃度MSOD、5.5 mg·L-1濃度MSOD、8.5 mg·L-1濃度MSOD處理下的矮牽牛植株P(guān)OD酶活性分別提高了4.1%、7.8%、17.9%，和ck2相比差異顯著(p<0.05)。其中，8.5 mg·L-1濃度MSOD處理下矮牽牛POD酶活性最接近正常溫度生長下的活性值。由此可見，8.5 mg·L-1濃度MSOD提高植物POD酶活性的效果最為明顯，增強(qiáng)了矮牽牛安全越冬的能力。綜上所述，低溫弱化了矮牽牛的POD酶活性，而MSOD可提高矮牽牛的POD酶活性。

圖2 低溫脅迫下矮牽牛POD酶活性指標(biāo)測定

2.3 低溫脅迫下外源SOD對矮牽牛生長適應(yīng)度的影響

氮磷鉀是調(diào)節(jié)矮牽牛生長的關(guān)鍵元素，能夠準(zhǔn)確表征矮牽牛營養(yǎng)水平。由表1可知：正常溫度環(huán)境下生長的矮牽牛氮磷鉀元素含量最高，吸收營養(yǎng)元素的能力最強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的生長適應(yīng)性；而低溫脅迫環(huán)境下沒有施加MSOD的植物樣本氮磷鉀元素含量最低。和ck2相比，施加MSOD處理下的樣本營養(yǎng)元素含量較高，例如X1、X2、X3處理下的矮牽牛氮元素含量增加了7.6%、29.3%、42.4%。由此可見，低溫脅迫環(huán)境下矮牽牛施加MSOD能夠提高植物吸收營養(yǎng)元素的能力，以更好的適應(yīng)生長環(huán)境。施加不同濃度MSOD的矮牽牛表現(xiàn)出不同的氮磷鉀元素含量，在氮元素和鉀元素方面：X3>X2>X1，在磷元素方面：X2>X3>X1。在本研究范圍內(nèi)，MSOD濃度越高、矮牽牛氮鉀營養(yǎng)元素吸收越好；而5.5 mg·L-1濃度MSOD就可以滿足植物體內(nèi)磷吸收需要，即使增加MSOD濃度，促進(jìn)矮牽牛磷元素吸收的作用不大。

表1 不同處理方式下矮牽牛氮磷鉀含量情況

3 討論與結(jié)論

全球極端天氣頻發(fā)會對草本植物自然生長產(chǎn)生一定威脅，一些植物很難在嚴(yán)酷的低溫環(huán)境中生存[10]。低溫脅迫下MSOD對矮牽牛生長指標(biāo)的研究顯示，不同濃度MSOD均能優(yōu)化草本植物矮牽牛的生長指標(biāo)，加快莖葉、根部的生長速度，生長效果接近于正常溫度培育的植株水平，因此外源SOD能夠幫助矮牽牛在寒冷的冬季正常生長[11]。2.5 mg·L-1、5.5 mg·L-1、8.5 mg·L-13個濃度MSOD處理下的植株相比清水處理均表現(xiàn)出良好的生長特征，且濃度越高效果越顯著。

3.1 低溫脅迫下外源SOD對矮牽牛生長指標(biāo)的影響

低溫脅迫下外源SOD對矮牽牛POD酶活性生理指標(biāo)影響顯著，對植物施加低溫脅迫作用時，植物體內(nèi)容易大量積累自由基，打破了植物細(xì)胞活性氧生產(chǎn)與清除系統(tǒng)平衡規(guī)律，不僅致使植物細(xì)胞脂質(zhì)過氧化而且損壞了植物細(xì)胞原有結(jié)構(gòu)，這一系列的非正常規(guī)律導(dǎo)致植物細(xì)胞膜非正常代謝[12]。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫環(huán)境下，8.5 mg·L-1濃度MSOD處理下矮牽牛POD酶活性提高了68.2%，外源SOD能夠有效提高草本植物體內(nèi)的POD酶活性，提高植物的抗寒能力，這是因?yàn)榈蜏丨h(huán)境下生存的草本植物對上述現(xiàn)象產(chǎn)生適應(yīng)性，植物細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶(POD)保護(hù)系統(tǒng)共同努力、相互協(xié)作消除了植物積累的自由基[13,14]，保障了植物自身的正常代謝功能。

3.2 低溫脅迫下外源SOD對矮牽牛POD指標(biāo)的影響

SOD酶、POD酶提高植物抗寒能力的作用機(jī)理為：植物由于低溫脅迫積攢大量自由基存儲在體內(nèi)，SOD是處理植物體內(nèi)活性氧的關(guān)鍵抗氧化酶，在多種抗氧化酶系統(tǒng)中SOD占據(jù)活性氧清除反應(yīng)核心位置，因?yàn)镾OD具有促進(jìn)超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)功能，解決了高毒性活性氧的催化問題[15]。SOD開啟了清除植物自由基的第一道門檻，隨后POD酶以及過氧化氫酶(CAT)等其他酶系統(tǒng)將剩余H2O2分解，多種酶協(xié)調(diào)分工使植物生理水平回歸平衡。此外，已有研究顯示[16]，矮牽牛在低溫環(huán)境脅迫下容易改變植物體內(nèi)SOD酶、POD酶、CAT酶含量，甚至干擾其膜質(zhì)過氧化水平，本研究結(jié)果與其一致。

3.3 低溫脅迫下外源SOD對矮牽牛生長適應(yīng)度的影響

根據(jù)矮牽牛植物體內(nèi)氮磷鉀含量測定結(jié)果可知，MSOD能夠在低溫環(huán)境下增加矮牽牛體內(nèi)氮磷鉀含量，幫助矮牽牛更好的適應(yīng)寒冷的生長環(huán)境，此時MSOD發(fā)揮著增效劑的作用。這是因?yàn)镸SOD本身兼有農(nóng)藥和微肥作用，不僅展現(xiàn)了超強(qiáng)的抗寒性能，還能起到促進(jìn)草本植物生長的作用。但是MSOD的增效作用在磷元素方面出現(xiàn)波動，這可能是MSOD自身攜帶負(fù)電荷基團(tuán)，吸附HPO42-的效果不理想，而吸附NH4+、K+能力強(qiáng)的結(jié)果造成的。

通過本研究可知：在低溫脅迫環(huán)境下草本植物矮牽牛的生長指標(biāo)、SOD酶活性、POD酶活性、營養(yǎng)吸收能力下降，合理設(shè)置外源SOD施加量能夠優(yōu)化矮牽牛生長指標(biāo)、提高POD酶活性、增加氮磷鉀元素的吸收能力。在本研究條件下，施加8.5 mg·L-1濃度MSOD的矮牽牛各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)化明顯。所以，本研究使用的外源SOD模擬物MSOD有助于提高矮牽牛的抗寒性、改善生長指標(biāo)、優(yōu)化營養(yǎng)吸收能力。抗寒性作為草本植物的重要生理指標(biāo)之一，在植物研究領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。目前，外源SOD模擬物在植物抗寒領(lǐng)域的研究取得了階段性成果，但是僅依靠POD等酶活性指標(biāo)定義草本植物的抗寒程度還不夠全面，今后的研究中需要繼續(xù)擴(kuò)大植物抗寒指標(biāo)的研究范圍，豐富園林觀賞植物抗寒性機(jī)理的相關(guān)研究成果。