兒童肺炎支原體感染的兩種檢測(cè)方法比較

周仁希 林曉偉 陳東 周俊 吳亦棟 葉蓓

肺炎支原體（MP）是引起兒童呼吸道感染的常見(jiàn)病原微生物之一［1］，在兒童呼吸道感染中約占30%。臨床癥狀可從輕微的支氣管炎到重癥肺炎，嚴(yán)重感染可導(dǎo)致死亡，MP 也能引起多種呼吸道外并發(fā)癥，其中屬消化系統(tǒng)癥狀最常見(jiàn)。MP 感染在≥5 歲肺炎患兒中，其感染率可達(dá)50%［2］，在因呼吸道感染的住院患兒中約>19.1%［3］。由于支原體肺炎（MPP）早期臨床表現(xiàn)多樣、影像學(xué)檢查無(wú)顯著特征，因此，實(shí)驗(yàn)室特異、快速檢測(cè)MP 對(duì)兒童MP 感染臨床診斷以及監(jiān)測(cè)患兒預(yù)后具有重要的意義。本文通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)MP 抗體IgM 與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（RT-PCR）檢測(cè)MP 核酸的對(duì)照分析，探討MP 感染的兩種不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法在臨床診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018 年1 月至12 月杭州市兒童醫(yī)院同時(shí)行肺炎支原體抗體IgM 檢測(cè)及肺炎支原體核酸檢測(cè)的6091 例住院患兒的臨床資料，年齡22 天～15歲?；純喝朐汉螅瑫r(shí)采集血清樣本和咽拭子（或痰標(biāo)本）各1 份及時(shí)做肺炎支原體抗體IgM 和核酸檢測(cè)。

1.2 方法（1）儀器與試劑：抗肺炎支原體抗體IgM檢測(cè)試劑盒購(gòu)自歐盟醫(yī)學(xué)診斷有限公司，肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，ABI 7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 基因擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI 公司），HydroFlex 洗板機(jī)和Sunrise 酶標(biāo)儀（Tecan公司）。（2）ELISA 檢測(cè)：采用ELISA 原理，微孔板條上包被的肺炎支原體抗原可與稀釋樣本中的IgM 結(jié)合，加入酶標(biāo)抗人IgM 抗體溫育后加底物顯色。具體檢測(cè)方法嚴(yán)格根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每板設(shè)陰性對(duì)照3 孔，陽(yáng)性對(duì)照2 孔和空白對(duì)照1 孔。設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm處，用空白孔調(diào)零點(diǎn)后測(cè)定各孔吸光度（A 值），按照說(shuō)明書(shū)上標(biāo)定的范圍和標(biāo)準(zhǔn)判斷陽(yáng)性和陰性。（3）RTPCR 檢測(cè)：取處理后樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照的上清液2 μl 加入試劑盒反應(yīng)液中做MP 核酸定量檢測(cè)。RT-PCR 反應(yīng)循環(huán)條件：93℃ 2 min，1 個(gè)循環(huán)；93℃ 45 s，55℃ 60 s，10 個(gè)循環(huán)；93℃ 30 s，55℃45 s，30 個(gè)循環(huán)，操作嚴(yán)格按照試劑盒產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)。記錄陽(yáng)性結(jié)果的Ct 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用%表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MP檢測(cè)方法比較 MP抗體IgM陽(yáng)性或MP核酸陽(yáng)性共846 例，陽(yáng)性率13.89%，其中562 例MP 抗體IgM檢測(cè)陽(yáng)性（9.23%），383 例MP 核酸檢測(cè)陽(yáng)性（6.29%），MP 抗體IgM 檢測(cè)陽(yáng)性率高于MP 核酸，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=134.82，P=0.00）（見(jiàn)表1）。兩種方法陽(yáng)性不符合率為12.26%。

表1 MP抗體與核酸方法檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 不同年齡與季節(jié)MP 陽(yáng)性分布 兩種方法在不同年齡組均檢出MP 陽(yáng)性，陽(yáng)性結(jié)果主要集中在1～3 歲（51.42%），其次是4～6 歲（22.70%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表2）。不同季節(jié)均檢出MP 陽(yáng)性，其中11-12 月份陽(yáng)性率最高，其次是1 月份，其它季節(jié)散發(fā)（見(jiàn)圖1）。

表2 不同年齡組兩種不同檢測(cè)方法MP陽(yáng)性的檢出情況

圖1 不同季節(jié)MP陽(yáng)性分布情況（例數(shù)）

3 討論

MP 近年來(lái)發(fā)病率逐年增多，但由于其早期臨床表現(xiàn)多樣、病情輕重不一，反復(fù)，影像學(xué)檢查無(wú)顯著特征等，使得MP 鑒別診斷較為困難。此外MP 無(wú)細(xì)胞壁，導(dǎo)致作用于細(xì)胞壁的常見(jiàn)抗生素對(duì)MP 不敏感，因此對(duì)MP 感染較為特異、快速的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)顯得十分重要。MPP 發(fā)病率在不同國(guó)家、不同地區(qū)差異較大［4］。本資料結(jié)果顯示，兩種方法結(jié)合檢測(cè)總陽(yáng)性率為13.89%。MPP 好發(fā)于學(xué)齡期兒童，近年來(lái)<5 歲兒童MPP 的報(bào)道有所增加［5］，本資料結(jié)果顯示，MP 感染在1～6 歲兒童高發(fā)。MP 感染全年散發(fā)，不同地區(qū)的流行季節(jié)有所差異，北京MP 檢出陽(yáng)性率在夏秋季及秋冬季較高［6］，南京以夏秋季高發(fā)［1］，而本資料結(jié)果顯示冬季高發(fā)。

人體感染MP 后能產(chǎn)生特異性IgM 類(lèi)抗體，且通常在感染后第1 周出現(xiàn)，在第3 周達(dá)到最高滴度［7］，而MP 感染的潛伏期為2～3 周。兒童患者的特殊性導(dǎo)致其在臨床上較難采集雙份血清，本資料僅納入單份血清結(jié)果，其中284 例患兒核酸陽(yáng)性而抗體IgM 陰性，不排除檢測(cè)時(shí)患兒處于感染早期甚至潛伏期而抗體IgM 未產(chǎn)生的可能。

PCR 法檢測(cè)MP 具有較高的敏感性和特異性，且不受患者年齡、病程進(jìn)展、抗體產(chǎn)生的時(shí)間和患者免疫功能等因素的影響［8］，也可了解患者體內(nèi)MP 感染及自我復(fù)制的情況，對(duì)早期檢測(cè)MP 感染具有重要意義。但PCR 法容易受操作技術(shù)影響，也不能區(qū)分無(wú)癥狀攜帶或急性感染。本資料中463 例抗體IgM 陽(yáng)性而核酸陰性，不排除由于兒童無(wú)法配合導(dǎo)致取樣不準(zhǔn)確造成假陰性的可能。而抗體IgM 陽(yáng)性率較高，也可能存在部分抗肺炎衣原體抗體IgM、抗嗜肺軍團(tuán)菌抗體IgM 等的交叉反應(yīng)。本資料中，兩種方法陽(yáng)性不符合率為12.26%。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果不相符的患兒，核酸陽(yáng)性可以作為MP 感染的預(yù)判，而抗體IgM 陽(yáng)性的標(biāo)本應(yīng)該根據(jù)臨床癥狀體征、影像學(xué)檢查、用藥情況等作進(jìn)一步判斷。

綜上所述，兩種方法在臨床診斷中相互彌補(bǔ)，建議同時(shí)選擇兩種方法以提高臨床檢出率。