縮短禁欲時(shí)間對重度精子DNA損傷患者體外授精結(jié)局的改善作用

朱佳 余柯達(dá) 師帥 劉鴻 柳祖波 鄒立波

近年來，隨著我國初婚年齡的推遲，又因環(huán)境污染和工作壓力等因素，不孕不育的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在不孕不育患者中，50%左右是由男性因素導(dǎo)致的［1］。在進(jìn)行體外授精（IVF）治療前，需要對男方生育能力進(jìn)行評估，近年來精子DNA 碎片指數(shù)（DFI）作為一種新的精液質(zhì)量指標(biāo)被國內(nèi)外各大生殖醫(yī)學(xué)中心采納［2］。DFI 是指精子在生成及成熟的過程中其DNA 完整性被破壞而產(chǎn)生斷裂碎片的程度。精子DNA的完整性是父代遺傳信息得以準(zhǔn)確傳遞的必要條件。OLESZCZUK 等［3］研究發(fā)現(xiàn)DFI 與IVF 結(jié)局中的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和活產(chǎn)率顯著負(fù)相關(guān)。近年來國內(nèi)研究者也發(fā)現(xiàn)DFI 過高會導(dǎo)致受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率等IVF 妊娠結(jié)局變差［4-5］。目前有研究發(fā)現(xiàn)縮短禁欲時(shí)間可以降低DFI，可以作為重度DFI 的一種治療方法［6］，但也會導(dǎo)致精液體積、精子總數(shù)和濃度降低。本文探討縮短禁欲時(shí)間對重度DFI 患者精子DNA 碎片的改善作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018 年11 月到2020 年6 月本院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF 治療的男方重度精子DNA 損傷（DFI ≥20%）的夫婦200 對，納入標(biāo)準(zhǔn)：①男方無射精障礙疾病；②男方陰莖、睪丸、附睪和輸精管等無異常；③男女雙方染色體正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①男方患有重度少弱精子癥；②女方年齡≥40 歲；③女方患有多囊卵巢綜合征。按隨機(jī)數(shù)字表分為兩組，每組各100 對，設(shè)定IVF 治療時(shí)（取卵日）禁欲時(shí)間1～5 h 為觀察組，禁欲時(shí)間2～7 d 為對照組。本項(xiàng)目經(jīng)本院倫理委員會審核通過，患者均知情并簽署同意書。

1.2 方法 IVF 治療前（調(diào)整前），對男方的精液質(zhì)量進(jìn)行檢查，禁欲時(shí)間均為2～7 d，并對兩組精液常規(guī)質(zhì)量指標(biāo)和DFI 進(jìn)行比較。IVF 治療時(shí)（調(diào)整后），觀察組禁欲時(shí)間調(diào)整為1～5 h，對照組禁欲時(shí)間仍為2～7 d，比較兩組精液質(zhì)量參數(shù)和受精、卵裂、妊娠情況。（1）精液質(zhì)量檢測和DFI 測定：男方患者通過手淫法取精，液化后利用CASA 分析精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)率，采用精子形態(tài)學(xué)快速染色液（Diff-Quik 法，天津瑞愛金）和精子DNA 碎片染色試劑盒（SCD 法，安徽安科生物工程）分別檢測精子形態(tài)和DFI，方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。（2）促排卵、精液處理及授精：采用常規(guī)長方案促排卵。當(dāng)最大卵泡直徑達(dá)到18 mm，或同時(shí)3 個(gè)卵泡直徑超過16 mm 時(shí)，注射重組人絨毛膜促性腺激素（rHCG，艾澤，默克雪蘭諾），34～36 h 后超聲引導(dǎo)下取卵。男方于取卵日通過手淫法取精，液化后取部分精液進(jìn)行質(zhì)量檢查，剩余的精液采用密度梯度離心法優(yōu)化處理。行常規(guī)IVF 授精，授精后16-18 h 內(nèi)觀察受精情況，可見雙原核即為正常受精。（3）胚胎觀察及移植：觀察第3 天胚胎，先根據(jù)胚胎的碎片進(jìn)行分級：碎片≤5%，I 級；5%<碎片≤20%，II 級；20%<碎片<50%，III 級；碎片≥50%，IV 級。再根據(jù)卵裂球是否均勻，數(shù)目是否≥6，每否定一次胚胎則降一個(gè)級別，胚胎卵裂球數(shù)目≤4 則直接評為IV 胚胎。正常受精I(xiàn)～I(xiàn)II 級胚胎為有效胚胎，選擇有效胚胎進(jìn)行移植。移植30 d 后B 超檢查宮腔，內(nèi)見孕囊則確診為臨床妊娠，妊娠未滿12 周發(fā)生流產(chǎn)的為早期流產(chǎn)（不含生化妊娠）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 禁欲時(shí)間對男方精液質(zhì)量參數(shù)影響 調(diào)整后，觀察組精液體積、精子濃度低于對照組（均P<0.01），前向運(yùn)動(dòng)率高于對照組（P<0.01）。觀察組的DFI 為（18.86±3.56）%，而對照組（25.18±4.23）%，兩組差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

表1 禁欲時(shí)間對男性精液質(zhì)量參數(shù)的影響（）

表1 禁欲時(shí)間對男性精液質(zhì)量參數(shù)的影響（）

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 女方基本情況及受精卵裂情況 觀察組優(yōu)質(zhì)胚胎率為39.09%，對照組為31.18%，觀察組高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2。

表2 女方基本情況及受精卵裂情況

2.3 IVF 臨床妊娠結(jié)局 觀察組和對照組各有84 例和62 例進(jìn)行胚胎移植，剩余16 例和38 例因無有效胚胎故未進(jìn)行移植。觀察組的移植胚胎數(shù)與對照組之間無顯著性差異（P>0.05）。移植后，觀察組的種植率和臨床妊娠率為33.54%和55.95%，而對照組僅為21.93%和37.10%，觀察組均顯著高于對照組（均P<0.05）。早期流產(chǎn)率觀察組僅為14.89%，而對照組高達(dá)39.13%，兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。兩組的異位妊娠率和多胎妊娠率差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），見表3。

表3 IVF臨床妊娠結(jié)局

3 討論

不孕不育是一個(gè)深刻的醫(yī)學(xué)和社會問題，對男性生育力評估目前主要為精子濃度、精子活力和精子形態(tài)等精液質(zhì)量常規(guī)檢查，但其作為診斷指標(biāo)和指導(dǎo)選擇治療方案的價(jià)值具有一定的局限性［8］。因此一些新的精液質(zhì)量指標(biāo)被開發(fā)，用以補(bǔ)充男性生育力評價(jià)指標(biāo)，其中用于評估精子DNA 完整性的DFI 已被證實(shí)具有臨床應(yīng)用價(jià)值，可作為男性生育力相對獨(dú)立的預(yù)測指標(biāo)［9］。有研究表明當(dāng)DFI>20%時(shí)，通過自然受孕和人工授精的妊娠率顯著下降，當(dāng)DFI>30%時(shí)，妊娠率則幾乎為零［10］。

AGARWAL 等［6］研究發(fā)現(xiàn)正常男性禁欲時(shí)間為1d的精液體積、精子濃度和DFI 低于2～7 d。戎春浩等［7］發(fā)現(xiàn)縮短禁欲時(shí)間可以降低DFI，也可以提高精子前向運(yùn)動(dòng)。本研究結(jié)果與上述研究一致，IVF 治療前，禁欲時(shí)間為2～7 d，觀察組與對照組精液體積、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)率、正常形態(tài)率和DFI 均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P>0.05）；進(jìn)行IVF 治療時(shí)，觀察組禁欲時(shí)間調(diào)整為1-5 h，對照組禁欲時(shí)間仍為2～7 d，此時(shí)觀察組的精液體積、精子濃度和DFI 低于對照組（均P<0.01），前向運(yùn)動(dòng)率高于對照組（P<0.01）。表明縮短禁欲時(shí)間可以降低精子DNA 的損傷程度。氧化應(yīng)激、染色質(zhì)組裝異常和細(xì)胞凋亡是目前認(rèn)為精子DNA 發(fā)生碎片化的主要機(jī)制，其中氧化應(yīng)激是導(dǎo)致精子功能障礙和男性不育的主要原因［11］。氧化應(yīng)激是一種活性氧（ROS）與抗氧化劑之間的失衡狀態(tài)，過量的ROS 會導(dǎo)致精子DNA 氧化損傷，使DFI 升高［12］。成熟的精子在附睪中停留越久，ROS 對精子DNA 氧化損傷越嚴(yán)重［13］。

大量研究表明過高的DFI 會導(dǎo)致受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率等IVF 妊娠結(jié)局變差［4-5］。本研究結(jié)果顯示，IVF 治療中，觀察組優(yōu)質(zhì)胚胎率高于對照組（P<0.01）。胚胎移植后，觀察組種植率和臨床妊娠率高于對照組（P<0.05），早期流產(chǎn)率低于對照組（P<0.05）。表明，縮短禁欲時(shí)間可以顯著改善重度DFI 患者IVF 結(jié)局中的優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和早期流產(chǎn)率。