雙氫青蒿素通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化減輕腎臟纖維化的作用機(jī)制分析

劉玲 楊亞珍 俞東容*

慢性腎臟病（CKD）已成為威脅數(shù)十億人的全球性健康問題。據(jù)報(bào)道，中國(guó)CKD 的發(fā)病率達(dá)10.8%［1］。CKD 常導(dǎo)致腎臟纖維化，病因包括成纖維細(xì)胞聚集、間質(zhì)小管的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）、小管細(xì)胞丟失以及腎小管周圍微脈管系統(tǒng)稀疏［2］。EMT 是腎臟纖維化進(jìn)展中的關(guān)鍵之一［3］，其特征是失去E-cadherin 蛋白和細(xì)胞角蛋白等黏附分子，并出現(xiàn)新的間充質(zhì)標(biāo)記，如vimentin、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），I 型膠原蛋白和纖連蛋白［4］。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是腎臟纖維化過程中關(guān)鍵的信號(hào)通路之一。盡管在正常腎臟中該信號(hào)通路處于非激活狀態(tài)，但在多種腎臟損傷中，Wnt/β-catenin 信號(hào)被激活［5］。雙氫青蒿素（DHA）是從青蒿中提取的青蒿素的半合成衍生物。除了抗瘧疾，DHA還被發(fā)現(xiàn)具有較多潛在的藥理作用，包括抗腫瘤、抗炎和抗纖維化。本研究通過TGFβ-1 體外誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞和體內(nèi)單側(cè)輸尿管阻塞（UUO）模型，探討DHA 的抗纖維化作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清（FBS），1.2 g/L碳酸氫鈉，1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基，在37℃和5%CO2中條件下培養(yǎng)人腎近端腎小管上皮細(xì)胞系細(xì)胞（HK2）。用0.2%胰蛋白酶（Sigma）和0.02%EDTA 將HK2 細(xì)胞消化后接種到6 個(gè)孔板中。當(dāng)HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)到80%時(shí)，用無血清DMEM/F12 饑餓過夜。饑餓24 h 后，用TGFβ-1（Peprotech）和DHA 處理HK2細(xì)胞。將HK2 細(xì)胞隨機(jī)分為6組：正常組（normal組），TGFβ-1組（5 ng/mL），TGFβ-1（5ng/mL）+DHA（10 μM）組，TGFβ-1（5 ng/mL）+DHA（25 μM）組，TGFβ-1（5 ng/mL）+DHA（50 μM）組 和TGFβ-1（5ng/mL）+DHA（100 μM）組。所有細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）腎臟組織和HK2 細(xì)胞中的總RNA 分離采用RNA 分離試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行分離。2 μg 總RNA 用于逆轉(zhuǎn)錄。采用StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）和SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）檢測(cè)纖連蛋白、E-cadherin、膠原I、波形蛋白和α-SMA 的mRNA 表達(dá)水平。擴(kuò)增條件采用95℃持續(xù)30 s，然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增（95℃持續(xù)5 s，60℃持續(xù)30 s）。18 s RNA 作為內(nèi)參調(diào)整樣品間的差異。使用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)濃度。引物通過Pubmed 在線工具設(shè)計(jì)，并由上海生工公司合成。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)的引物序列

1.3 Western 蛋白印跡分析 蛋白表達(dá)通過Western 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。使用RIPA 裂解緩沖液（碧云天）提取蛋白，然后使用10%丙烯酰胺凝膠分離蛋白。將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Millipore）上后，用10%的脫脂牛奶將蛋白條帶封閉1 小時(shí)。一抗采用GAPDH（1 ∶1500，CST）、E-Cadherin（1 ∶10000，Abcam）、α-SMA（1 ∶10000，Abcam）、I 型膠原（1 ∶5000，Abcam）、t-β-catenin（1 ∶1000，CST）和p-β-catenin（1 ∶1000，CST），辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（1 ∶1500，CST）作為二抗。通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑（Millipore）檢測(cè)條帶，并通過X 射線膠片（Bio-Rad）實(shí)現(xiàn)可視化。蛋白質(zhì)表達(dá)水平通過與GAPDH 的比例定量。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理 動(dòng)物研究方案經(jīng)杭州市中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。雄性SD 大鼠（180～210 g）購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。將大鼠以12 h～12 h 的明/暗周期圈養(yǎng)在籠子中，溫度22℃，濕度40%～60%。DHA（純度>99%，分子量284.35）購(gòu)買自阿拉丁公司。將DHA 溶解在0.3%的羧甲基纖維素鈉（CMC）中。建立UUO 模型［6］：大鼠通過腹腔注射麻醉3%戊巴比妥（1 mg/kg 體重）進(jìn)行麻醉。消毒后，暴露腹腔，分離左輸尿管，并在2 處用絲線結(jié)扎左側(cè)輸尿管。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎輸尿管。將50 只SD 大鼠隨機(jī)分為五組：假手術(shù)組（假手術(shù)并使用0.3%CMC 治療）、UUO組（行UUO 手術(shù)并使用0.3%CMC 治療）；DHA-H組［行UUO 手術(shù)并使用DHA100 mg/（kg·d）治療］；DHA-M組［行UUO手術(shù)并使用DHA10 mg/（kg·d）治療］；DHA-L組［行UUO 手術(shù)并使用DHA 1 mg/（kg·d）］。DHA組大鼠通過胃內(nèi)給予DHA，1 次/d。手術(shù)后UUO 和Sham組的大鼠給予等體積的0.3%羧甲基纖維素鈉。在第14 天，通過腹膜內(nèi)注射3%戊巴比妥（30 mg/kg）將所有大鼠麻醉后處死。從腹主動(dòng)脈收集血液。使用自動(dòng)生化分析儀測(cè)試血清肌酸（Scr）和尿素氮（Bun）。腎臟與體重比通過測(cè)量左腎重量計(jì)算。一部分腎臟組織通過固定和石蠟包埋用于進(jìn)一步組織病理學(xué)檢測(cè)。另一部分腎臟組織切成小塊，用液氮冷凍，然后提取mRNA 和蛋白。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHA 減輕TGFβ-1 誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞纖維化 與normal組比較，TGFβ-1 刺激后，纖連蛋白和I 型膠原的mRNA 水平增加。DHA 減弱纖連蛋白和膠原蛋白I的升高（見圖1A、B）。通過Western-blot 進(jìn)一步評(píng)估膠原蛋白I 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過TGFβ-1刺激，膠原I 的蛋白表達(dá)增加（圖1C、D）。

圖1 DHA對(duì)TGFβ-1誘導(dǎo)HK2細(xì)胞纖維化的影響

2.2 DHA 通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路減輕TGFβ-1誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞EMT DHA 減輕TGFβ-1 誘導(dǎo)的間質(zhì)標(biāo)記物（vimentin 和α-SMA）表達(dá)，增加上皮標(biāo)記物E-cadherin 表達(dá)（見圖2 A-F）。TGFβ-1 使HK2 細(xì)胞中的p-β-catenin 活化，而DHA 減輕p-β-catenin蛋白水平的升高（圖2 D-G）。

圖2 DHA對(duì)TGFβ-1誘導(dǎo)HK2細(xì)胞EMT的影響

2.3 DHA 對(duì)UUO 大鼠腎重量指數(shù)和腎功能的影響 與假手術(shù)組比較，UUO組腎臟發(fā)生病理形態(tài)學(xué)改變。與UUO組比較，UUO+DHA10 mg/kg組及UUO+DHA100 mg/kg組降低腎臟重量指數(shù)（P<0.05）（圖3A、B）。與UUO組比較，UUO+DHA10 mg/kg組及UUO+DHA100 mg/kg組Scr 和Bun 明顯降低（P<0.05），UUO+DHA 1 mg/kg組Bun 降低（P<0.05）（見圖3C、D）。

圖3 DHA對(duì)UUO大鼠腎重量指數(shù)和腎功能的影響

2.4 DHA 對(duì)UUO 大鼠腎臟纖維化和腎小管EMT 的影響 HE 染色顯示，UUO 引起上皮細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小管擴(kuò)張，DHA 治療則顯著逆轉(zhuǎn)了這些變化。Masson 染色顯示，UUO組存在大量膠原蛋白沉積，提示更嚴(yán)重的腎臟纖維化。DHA 處理可減少劑量依賴性的膠原沉積。見圖4。

圖4 HE（A-E）和Masson三色（F-J）染色的腎臟切片的組織學(xué)

2.5 DHA 對(duì)膠原蛋白I、fibronectin、E-Cadherin 和α-SMAmRNA 表達(dá)的影響 UUO 增加I 型膠原、纖連蛋白和α-SMA 的mRNA 表達(dá)，而DHA 可以降低其表達(dá)，并具有劑量依賴性。E-Cadherin 蛋白表達(dá)在UUO組中減少，在DHA 治療后增加。見圖5。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，TGFβ-1 刺激HK2 細(xì)胞中纖維蛋白、膠原I、vimentin 和α-SMA 的表達(dá)并抑制Ecadherin 蛋白的表達(dá)。DHA 可以減輕這些影響。DHA顯著改善UUO 大鼠的腎膠原I 的表達(dá)，降低Scr 和Bun的血清水平，并抑制ECM 的產(chǎn)生。因此，DHA 可以在體內(nèi)外減輕腎臟纖維化。在腎損傷中，EMT 是腎臟纖維化的主要原因［3］。TGFβ-1 是慢性腎臟疾病發(fā)生腎臟纖維化的誘發(fā)劑［7］，并影響腎小管EMT 的大多數(shù)關(guān)鍵事件［8］。EMT 導(dǎo)致α-SMA 的重新表達(dá)和ECM（如膠原蛋白I）的積累，引發(fā)腎臟纖維化［9］。

青蒿素是從青蒿植物中提取的倍半萜內(nèi)酯過氧化物。DHA 是青蒿素的衍生物。除抗瘧疾作用外，DHA還具有抗炎、抗纖維化、抗腫瘤和免疫抑制作用［10］。本研究顯示，DHA 在腎臟纖維化中具有抗纖維化作用，有望成為治療慢性腎臟疾病進(jìn)展的藥物。CKD 的進(jìn)展以腎細(xì)胞丟失和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）堆積為特征［11］。腎臟纖維化可能是由于ECM 合成增加和降解降低所致。本研究顯示，由TGFβ-1 誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞和UUO 大鼠模型中，ECMs 生物標(biāo)志物（包括纖連蛋白和I 型膠原）顯著增加。但DHA 治療后，這些ECMs 生物標(biāo)志物顯著下降。表明，DHA 的抗纖維化作用可能與DHA調(diào)節(jié)腎臟ECM 動(dòng)態(tài)失衡作用有關(guān)。

肌成纖維細(xì)胞是過量ECM 的主要來源［12］。研究表明，成肌纖維細(xì)胞來源于病理和損傷條件下腎小管發(fā)生EMT 的腎小管細(xì)胞［13］。因此，腎小管EMT 對(duì)于腎臟纖維化的發(fā)展至關(guān)重要。EMT 的過程特征為間充質(zhì)（如α-SMA 和vimentin）的表達(dá)增加。本研究結(jié)果顯示，DHA 可以下調(diào)纖維化大鼠腎臟中α-SMA 和vimentin的表達(dá)，并上調(diào)E-cadherin 蛋白的表達(dá)，提示DHA 可以緩解病理?xiàng)l件下腎小管EMT。表明DHA 的腎臟保護(hù)作用可能與肌成纖維細(xì)胞減少和ECM 產(chǎn)生沉積有關(guān)。

在EMT 過程中，涉及較多信號(hào)通路，包括TGF-β超家族和Wnt/β-catenin 等［14］。較多研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 的獨(dú)特靶基因，目前已經(jīng)鑒定幾種直接靶基因，如纖連蛋白、snail 和腎素-血管緊張素系統(tǒng)。腎臟中的snail 活化促進(jìn)腎小管EMT 誘導(dǎo)腎臟纖維化［15］。snail 可以轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin 蛋白的表達(dá)并破壞上皮細(xì)胞間的粘附［4］。在受損的腎臟中，Wnt4 的表達(dá)代表增殖性髓質(zhì)成纖維細(xì)胞的數(shù)量與Wnt/β-catenin 途徑自發(fā)驅(qū)動(dòng)間質(zhì)周細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞［16］。這些研究表明Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在啟動(dòng)腎小管EMT 中具有重要作用。本研究中，TGFβ-1 誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞表達(dá)較高水平的活化β-catenin 和相關(guān)分子，表明Wnt/β-catenin 通路在TGFβ-1 誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞中被激活。DHA 可有效抑制β-catenin 的活性并降低該信號(hào)通路的激活。

綜上所述，DHA 通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制EMT，在體內(nèi)外對(duì)腎臟纖維化均有保護(hù)作用。DHA 有望成為預(yù)防和治療腎臟纖維化的候選藥物。