四君子湯對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制作用研究

馬 漪，謝 瓊

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

結(jié)腸癌是常見的胃腸道腫瘤之一，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，其發(fā)病與年齡、性別、飲食習(xí)慣及遺傳等多種因素有關(guān)。目前結(jié)腸癌主要采用手術(shù)治療，然而對(duì)于晚期或轉(zhuǎn)移的患者，治療效果并不理想。腫瘤轉(zhuǎn)移是多數(shù)癌癥患者死亡的主要原因，結(jié)腸癌的主要轉(zhuǎn)移方式為腸壁環(huán)行發(fā)展、縱徑蔓延及深層浸潤(rùn)，此外結(jié)腸癌還可通過淋巴管、血流轉(zhuǎn)移。肝臟是結(jié)腸癌擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的主要部位，患者的預(yù)后與肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此對(duì)于結(jié)腸癌及其肝轉(zhuǎn)移治療藥物的研發(fā)是目前研究重點(diǎn)[1]。Wnt/β-catenin通路是與腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路，該通路的激活能夠通過增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力，進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌在體內(nèi)血行轉(zhuǎn)移，促進(jìn)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展等[2-3]。四君子湯是中藥復(fù)方湯劑，研究發(fā)現(xiàn)其能夠增強(qiáng)腫瘤患者免疫力，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移，減少化療不良反應(yīng)[4]，但其對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用效果及機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)研究了四君子湯對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠的腫瘤抑制作用及對(duì)Wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)作用，旨在進(jìn)一步明確四君子湯的藥理作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠50只，6～8周齡，體重18～20 g，購(gòu)自湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(湘)2020-0003，飼養(yǎng)于動(dòng)物房。

1.2儀器與設(shè)備 Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó) Agilent公司)；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)(上海臣蓮生物科技發(fā)展有限公司)；Infinite F50酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；Gel Doc EZ凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；CX43熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.3藥品及試劑 四君子湯(由人參9 g、白術(shù)9 g、茯苓9 g、甘草6 g組成)由中藥飲片制成生藥含量為1 g/mL的湯劑(北京同仁堂股份有限公司)；HCT116細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；PCR反應(yīng)試劑盒(德國(guó)Qigen公司，批號(hào)：219073)；TRIzol Invitrogen總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：15596026)；XAV939(美國(guó)MedChemExpress公司，貨號(hào)：HY-15147，純度98.71%)；TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)分別為15596018和M1662)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Wnt3a及β-catenin兔多克隆抗體、GAPDH兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天生物科技公司，批號(hào)分別為C1086、AF8352、AF0066、AF1186、A0208)；RIPA裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、HE染液(武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)分別為G2002、G2014、G1005)；PCR引物設(shè)計(jì)及合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.4分組、造模及給藥 將50只小鼠隨機(jī)分為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組、四君子湯低劑量組、四君子湯中劑量組、四君子湯高劑量組及XAV939組，每組10只。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×107/mL，將小鼠麻醉后開腹，參照文獻(xiàn)[5]方法，按照0.2 mL/只向小鼠脾臟內(nèi)注射HCT116細(xì)胞懸液，縫合腹腔,7 d后以小鼠肝臟部位可觸及米粒大小包塊視為造模成功。然后四君子湯低、中、高劑量組分別按照3.5 g/kg、7 g/kg、14 g/kg(參照文獻(xiàn)[6]方法計(jì)算給藥量，以生藥含量計(jì))的劑量灌胃給予四君子湯，XAV939組按照文獻(xiàn)[7]方法腹腔注射10 mg/kg 的XAV939，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組灌胃給予等量生理鹽水，均1次/d，連續(xù)21 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1小鼠體重、肝臟重量及肝臟指數(shù) 各組小鼠稱體重后處死，分離肝臟，稱肝臟重量，計(jì)算小鼠肝臟指數(shù)(肝臟重量/體重×100%)。

1.5.2肝臟組織病理及肝組織轉(zhuǎn)移灶數(shù)量 取小鼠肝組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的標(biāo)本，常規(guī)HE染色，顯微鏡下盲法進(jìn)行觀察，并計(jì)算各樣本轉(zhuǎn)移灶數(shù)量。

1.5.3腫瘤細(xì)胞凋亡率 小鼠處死后分離腫瘤組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后制成4 μm厚石蠟切片，按照TUNEL試劑盒方法對(duì)各組小鼠腫瘤組織切片進(jìn)行染色，使用含有DAPI的抗熒光淬滅劑封片，分別在熒光顯微鏡下以360 nm和500 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察，每張切片取5個(gè)視野，觀察并計(jì)算TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算腫瘤組織細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.4腫瘤組織中Wnt3a及β-catenin mRNA表達(dá)量 采用RTq-PCR法測(cè)定：取腫瘤組織，用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行RTq-PCR反應(yīng)。引物序列：Wnt3a正向引物為5’-CCTCGTTCAGGATGTGGTTT-3’，反向引物為5’-TCTGGTGATATCGTGGGTGA-3’；β-catenin正向引物為5’-ACTGGAAGAGCTGTGTGACG-3’，反向引物為5’-GGAGGTGGTGAAGATGAAGC-3’；β-actin正向引物為5’-ACACTGTGTGCCCATCTACGAGG-3’，反向引物為5’-AGGGGCCGGACTCGTCGTCATACT-3’。以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5.5腫瘤組織中Wnt3a及β-catenin蛋白表達(dá)量 采用Western blot法測(cè)定：取腫瘤組織，裂解勻漿后取上清，蛋白經(jīng)加熱變性后，用二喹啉甲酸法測(cè)定總蛋白濃度，用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，將分離出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，依次使用1∶500稀釋的Wnt3a、β-catenin兔多克隆抗體以及山羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)孵育后，滴加ECL試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)中成像后，以GAPDH為內(nèi)參，使用ImageJ軟件計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠體重、肝臟重量及肝臟指數(shù)比較 四君子湯低、中、高劑量組及XAV939組小鼠體重、肝臟重量及肝臟指數(shù)均明顯低于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組(P均<0.05)，且四君子湯中、高劑量組及XAV939組均明顯低于四君子湯小劑量組(P均<0.05)，四君子湯高劑量組及XAV939組均明顯低于四君子湯中劑量組(P均<0.05)，四君子湯高劑量組與XAV939組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠體重、肝臟重量及肝臟指數(shù)比較

2.2各組小鼠肝組織病理變化及轉(zhuǎn)移灶數(shù)量比較

結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組小鼠肝組織充血水腫，可見明顯腫瘤轉(zhuǎn)移灶；四君子湯低、中、高劑量組及XAV939組小鼠肝組織充血水腫減輕，肝組織轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯少于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組(P均<0.05)，且四君子湯中、高劑量組明顯少于四君子湯低劑量組(P均<0.05)，四君子湯高劑量組明顯少于四君子湯中劑量組(P<0.05)，四君子湯高劑量組與XAV939組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

圖1 各組結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝組織病理HE染色表現(xiàn) (×200)

圖2 各組結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝組織轉(zhuǎn)移灶數(shù)量比較

2.3各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況比較 結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組、四君子湯低劑量組、四君子湯中劑量組、四君子湯高劑量組及XAV939組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率分別為(4.61±0.55)%、(10.07±0.94)%、(15.40±1.71)%、(21.78±1.13)%、(19.58±0.70)%，四君子湯低、中、高劑量組及XAV939組均明顯高于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組(P均<0.05)，且四君子湯中、高劑量組及XAV939組均明顯高于四君子湯小劑量組(P均<0.05)，四君子湯高劑量組及XAV939組均明顯高于四君子湯中劑量組(P均<0.05)，四君子湯高劑量組與XAV939組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組腫瘤細(xì)胞凋亡TUNEL染色表現(xiàn)見圖3。

圖3 各組結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡TUNEL染色情況

2.4各組小鼠腫瘤組織中Wnt3a及β-cateninmRNA表達(dá)量比較 四君子湯低、中、高劑量組及XAV939組小鼠腫瘤組織中Wnt3a及β-catenin mRNA表達(dá)量均明顯低于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組(P均<0.05)，且四君子湯中、高劑量組及XAV939組均明顯低于四君子湯小劑量組(P均<0.05)，四君子湯高劑量組及XAV939組均明顯低于四君子湯中劑量組(P均<0.05)，XAV939組均明顯低于四君子湯高劑量組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織中Wnt3a及β-catenin mRNA表達(dá)量比較

2.5各組小鼠腫瘤組織中Wnt3a及β-catenin蛋白表達(dá)量比較 四君子湯低、中、高劑量組及XAV939組小鼠腫瘤組織中Wnt3a及β-catenin蛋白表達(dá)量均明顯低于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組(P均<0.05)，且四君子湯中、高劑量組及XAV939組均明顯低于四君子湯小劑量組(P均<0.05)，四君子湯高劑量組及XAV939組均明顯低于四君子湯中劑量組(P均<0.05)，XAV939組均明顯低于四君子湯高劑量組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 各組結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織中Wnt3a及β-catenin蛋白表達(dá)情況

3 討 論

結(jié)腸癌為常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第3位，其可通過淋巴管及血流轉(zhuǎn)移、局部侵犯等方式轉(zhuǎn)移[8-9]。研究表明，結(jié)腸癌患者中肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率高達(dá)50%[10]，對(duì)于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移臨床主要采用手術(shù)及介入治療等手段治療，對(duì)于不可切除的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，以5-氟尿嘧啶等藥物化療為主，患者預(yù)后差[11]。

四君子湯具有益氣健脾的功效，用以治療脾胃氣虛證。近年來，四君子湯在結(jié)直腸癌的輔助治療中顯示出一定優(yōu)勢(shì)。劉良等[12]研究表明四君子湯能夠修復(fù)化療引起的小鼠胃腸道損傷，改善小鼠免疫功能。岳順[13]研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯能夠提高直腸癌患者術(shù)后輔助化療療效，改善患者腹脹和便溏癥狀，提高患者免疫力。俞志高[14]研究發(fā)現(xiàn)四君子湯能夠顯著改善結(jié)腸癌患者胃腸道功能。李斌等[15]報(bào)道四君子湯能夠降低結(jié)腸癌荷瘤小鼠瘤重，降低血清炎癥因子水平，進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)展。徐云丹等[16]發(fā)現(xiàn)四君子湯可以增強(qiáng)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的化療敏感性。由此可見四君子湯在結(jié)腸癌的治療中具有較大潛力。

肝臟指數(shù)反映了肝組織充血水腫狀態(tài)及腫瘤轉(zhuǎn)移灶生長(zhǎng)程度；轉(zhuǎn)移灶數(shù)量則直接反映了腫瘤細(xì)胞的惡化程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組比較，四君子湯各劑量組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量也顯著減少，且與四君子湯的劑量表現(xiàn)出依賴性，同時(shí)TUNEL染色顯示腫瘤細(xì)胞凋亡率隨四君子湯劑量的增加而逐漸升高，這提示四君子湯能夠呈劑量依賴性的顯著抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶的進(jìn)一步惡化。

Wnt/β-catenin通路是細(xì)胞增殖過程中必需的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤的進(jìn)展過程中通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等多種途徑導(dǎo)致了腫瘤的進(jìn)一步惡化及進(jìn)展[17-18]。目前研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路與肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲及細(xì)胞耐藥均有明顯相關(guān)性[19-20]。楊曉等[21]研究表明Wnt/β-catenin通路參與HCT116細(xì)胞的分裂及凋亡等生理過程，抑制Wnt/β-catenin通路能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡。任建琳等[22]研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路與結(jié)腸癌HT29細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移有關(guān)，抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白水平能夠抑制皮下荷瘤大鼠HT29細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。武健等[23]研究發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲機(jī)制與Wnt/β-catenin通路蛋白異常升高有關(guān)。由此可見，在結(jié)腸癌的多器官轉(zhuǎn)移等進(jìn)展過程中Wnt/β-catenin通路起著重要作用。XAV939是藥理機(jī)制明確的Wnt/β-catenin通路抑制劑，故本實(shí)驗(yàn)用其作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四君子湯各劑量組小鼠腫瘤組織中Wnt3a及β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯低于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組，表明四君子湯能夠通過抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移。

綜上所述，四君子湯能夠減少結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

(致謝：特別感謝湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院許佳老師在實(shí)驗(yàn)中給予的支持和幫助！)

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。