偏頜大鼠模型的構(gòu)建及其髁突CT 影像和組織學(xué)評(píng)價(jià)

張?jiān)骆?， 徐小杰 ， 劉 倩 ， 趙雅莉 ， 劉繼光， 王美青,

（1. 佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3. 空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院口腔解剖生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032；4. 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝膽外科一中心，北京 100039）

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

選取購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心的6 周齡雌性 SD 大鼠 12 只（體質(zhì)量 135～160 g），將大鼠隨機(jī)分為偏頜組和對(duì)照組，每組各6 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d 后，對(duì)偏頜組進(jìn)行偏頜咬合模型粘接操作，而對(duì)照組不做任何處理。 2 組大鼠于在相同條件下飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 所有動(dòng)物操作都得到了空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：033）。

1.2 偏頜大鼠模型的建立

在偏頜組大鼠上頜左側(cè)中切牙及下頜雙側(cè)中切牙上分別粘接統(tǒng)一規(guī)格的金屬不良修復(fù)體。 左側(cè)上頜中切牙不良修復(fù)體的制作方法（圖1）：將25 號(hào)通乳針頭（諧豐畜牧器械制品廠）彎折45°，彎折成一端長(zhǎng)3.5 mm、另一端長(zhǎng)2.5 mm 的金屬管，用鉗子夾扁，咬合時(shí)夾扁的金屬冠覆蓋在下頜切牙的遠(yuǎn)中唇側(cè)，形成正向覆覆蓋關(guān)系；雙側(cè)下頜中切牙不良修復(fù)體的制作方法：將針頭（3.5 mm，平頭，內(nèi)徑為2.9 mm；瀏河金茂塑料制品廠）切割成長(zhǎng)4.5 mm的金屬管，金屬管一端為平直斷面，另一端為近遠(yuǎn)中向與長(zhǎng)軸呈45°角的斜斷面 （金屬管斜斷面端最低點(diǎn)到平直斷面端的長(zhǎng)度為4.5 mm）。在局麻、隔濕條件下，將制備好的金屬管小心地粘接到上頜和下頜切牙上，其中，將下頜金屬管斜斷面的長(zhǎng)側(cè)置于大鼠下頜前牙右側(cè)，短側(cè)置于下頜前牙左側(cè)，而將上頜帶斜面導(dǎo)板的金屬管長(zhǎng)側(cè)置于大鼠上前牙的左側(cè)，將短側(cè)置于上前牙的右側(cè)。 當(dāng)咬合時(shí)，大鼠的下頜被推向右， 從而造成向右偏斜的偏頜（mandibular deviated occlusion, MDO）模型。 每只大鼠在5 min 內(nèi)完成所有操作。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，所有動(dòng)物均接受相同的標(biāo)準(zhǔn)化飲食，實(shí)驗(yàn)期間未見飲食量差異，無大鼠死亡。實(shí)驗(yàn)期間每隔1 日檢查1 次，確保假體沒有脫落。

圖1 對(duì)照組大鼠及偏頜造模后大鼠的咬合正面照及其示意圖Figure 1 Representative frontal view and the sketch map of the incisal occlusal relationship in control group and MDO group of rats

1.3 標(biāo)本的制備

造模12 周后， 注射過量戊巴比妥處死偏頜組及對(duì)照組大鼠，取雙側(cè)髁突，采用4%多聚甲醛將其固定24 h，micro-CT 觀察硬組織結(jié)構(gòu)。 將髁突置于30%蔗糖溶液中脫水，冰凍包埋，切片（厚約5 μm），馮庫(kù)薩（von Kossa，VK）、甲苯胺藍(lán)（toluidine blue，TB）和蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色。

1.4 Micro-CT 掃描及分析

用micro-CT 系統(tǒng) （德國(guó)巴伐利亞州西門子公司）掃描雙側(cè)髁突樣本，掃描在80 kV 和500 mA 下進(jìn)行，掃描層厚度為 8 μm，用常規(guī)的 X 線（X 線為0.8 μm）進(jìn)行校正，構(gòu)建三維圖像進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。

髁突的長(zhǎng)度和寬度用micro-CT 自帶軟件直接測(cè)量（圖2）。 為了評(píng)估軟骨下骨小梁的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)，在髁突軟骨下骨中心截面的中央選擇1 個(gè)0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm 的立方體，測(cè)量其軟骨下骨小梁區(qū)的骨小梁密度 （bone mineral density，BMD）、骨體積與組織體積之比 （the ratio of bone volume to tissue volume，BV/TV）、 骨面積與骨體積之比 （the ratio of bone surface area to bone volume，BS/BV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（trabecular number，Tb.N） 和骨小梁分離指數(shù)（trabecular separation，Tb.Sp）。

圖2 髁突micro-CT 影像測(cè)量方法Figure 2 The measuring methods of micro-CT images

1.5 冰凍切片及化學(xué)染色

采用冰凍切片機(jī)（型號(hào)：HM525NX；美國(guó)馬薩諸塞州賽默飛世爾科學(xué)公司）及自帶刀片（型號(hào)：MX35），以Kawamoto 薄膜法[3]對(duì)雙側(cè)髁突進(jìn)行硬組織矢狀面5 μm 連續(xù)切片。 選擇中央矢狀切面進(jìn)行馮庫(kù)薩染色、甲苯胺藍(lán)染色和蘇木精-伊紅染色。 組織學(xué)圖像用光學(xué)顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）獲得，并在萊卡DFC490 系統(tǒng)（德國(guó)萊卡公司）下進(jìn)行分析。 具體方法為將矢狀面髁狀突軟骨平均分為前、中、后3份[4]，在各份正中位置測(cè)量馮庫(kù)薩染色切片上未鈣化軟骨的厚度和甲苯胺藍(lán)染色切片上甲苯胺藍(lán)陽性基質(zhì)軟骨的厚度（圖3）。

圖3 馮庫(kù)薩染色片和甲苯胺藍(lán)染色片上髁突前、中、后分區(qū)及其軟骨厚度Figure 3 The cartilage thickness revealed by sections with VK staining and TB staining, the trisections were the anterior, middle and posterior third of the condyle

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均來自獨(dú)立樣本和觀察。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 17.0 版 SPSS 軟件進(jìn)行。 用 Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)評(píng)估數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性，置信度為95%，方差齊性用Levene 檢驗(yàn)。 對(duì)照組雙側(cè)數(shù)據(jù)沒有明顯差異，取對(duì)照組髁突左、右側(cè)數(shù)據(jù)平均值，用單因素方差分析方法比較對(duì)照組、偏頜組-左側(cè)、偏頜組-右側(cè)各參數(shù)測(cè)量值的差異，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT

Micro-CT 掃描結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠髁突骨質(zhì)致密，骨小梁排列整齊，關(guān)節(jié)面光滑、完整；偏頜組-左側(cè)和偏頜組-右側(cè)髁突骨小梁排列稀疏，有明顯的骨吸收征象。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見，偏頜組-右側(cè)髁突長(zhǎng)度及寬度大于對(duì)照組，偏頜組-左側(cè)髁突寬度大于對(duì)照組； 偏頜組-左側(cè)軟骨下骨小梁區(qū)的BMD、BV/TV、Tb.Th 均顯著下降，而 BS/BV、Tb.N 均顯著上升（圖4，P＜0.05）。 偏頜組-右側(cè)的軟骨下骨小梁區(qū)的 BMD、Tb.Th 均顯著下降，而 BS/BV 均顯著上升（圖 4，P＜0.05）。 偏頜組12 個(gè)髁突中有3 個(gè)髁突的表面出現(xiàn)明顯陷窩（圖5，箭頭所示），均出現(xiàn)在左側(cè)髁突。

圖4 對(duì)照組與偏頜組-左側(cè)及偏頜組-右側(cè)髁突micro-CT 檢測(cè)指標(biāo)比較Figure 4 Comparisons of the parameters measured from the micro-CT images between the control group and the left and right side condyles from the MDO group

圖5 對(duì)照組、偏頜組-左側(cè)和偏頜組-右側(cè)大鼠髁突矢狀面CT 圖片F(xiàn)igure 5 The representative micro-CT images in the sagittal sections of the mandibular condyles from the control group and that of the left and right side condyles from the MDO group

2.2 組織學(xué)染色

對(duì)照組大鼠髁突軟骨細(xì)胞層次分明， 排列整齊。 馮庫(kù)薩染色顯示，髁突軟骨下骨小梁排列整齊、密集，鈣化軟骨帶整齊；甲苯胺藍(lán)染色顯示，軟骨組織染色均勻，軟骨厚度前后向過渡光滑、流暢。 偏頜組-左側(cè)髁突軟骨細(xì)胞排列紊亂，micro-CT 顯示有凹陷的髁突，陷窩處被退變的軟骨充盈，內(nèi)有無細(xì)胞區(qū)結(jié)構(gòu)及空腔樣結(jié)構(gòu)， 陷窩周圍軟骨鈣化明顯，軟骨下骨小梁間隙較大。 甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，偏頜組陷窩部位甲苯胺藍(lán)染色陽性，中央處可有甲苯胺藍(lán)不著色的組織空腔；偏頜組-右側(cè)軟骨細(xì)胞層次分明，排列整齊，軟骨厚度前后向過渡流暢，但軟骨下骨間隙較大。 詳見圖6。

圖6 對(duì)照組及偏頜組-左側(cè)和偏頜組-右側(cè)髁突馮庫(kù)薩染色、甲苯胺藍(lán)染色及蘇木精-伊紅染色圖Figure 6 Representative images with VK staining, TB staining and HE staining for the sagittal sections of the mandibular condyles from the control group and that of the left and right side condyles from the MDO group

測(cè)量結(jié)果（圖7）顯示，偏頜組-左側(cè)髁突中1/3和后1/3 的未礦化軟骨厚度（VK 染色）比對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），偏頜組-右側(cè)髁突中 1/3 未礦化軟骨厚度比對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），而軟骨體部厚度（TB 染色）3 組間無明顯差異（P＞0.05）。 詳見圖7。

圖7 對(duì)照組與偏頜組-左側(cè)及偏頜組-右側(cè)髁突馮庫(kù)薩染色圖片顯示的未礦化軟骨厚度及甲苯胺藍(lán)染色圖片顯示的軟骨體部厚度（選區(qū)見圖3）測(cè)量結(jié)果比較Figure 7 Comparisons of the cartilage body thickness (based on TB staining) and the un-mineralized cartilage thickness (based on VK staining) between the control group and the left and right side condyles from the MDO group

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的典型形態(tài)學(xué)表現(xiàn)是軟骨細(xì)胞死亡，細(xì)胞外基質(zhì)降解，軟骨異常鈣化，最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形，異常生物力作用是其重要的致病因素[5]。 咬合紊亂是TMJ-OA 常見的病因之一[6]，前牙反[7]、深覆[8]等因素都可能是導(dǎo)致TMJ-OA 的異常咬合生物力因素， 其機(jī)制是咬合接觸部位及方向變化影響了咀嚼肌的功能，導(dǎo)致髁突應(yīng)力分布變化，進(jìn)而導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)軟骨及軟骨下骨的適應(yīng)性改建[9]。 發(fā)育期下頜髁突對(duì)不同咬合刺激具有不同的反應(yīng)特點(diǎn)。 本課題組前期結(jié)果顯示，單側(cè)前牙反可導(dǎo)致TMJ 出現(xiàn)明顯OA 樣變，其特征是軟骨細(xì)胞死亡增加，細(xì)胞外基質(zhì)降解，軟骨鈣化增加，軟骨細(xì)胞終末分化活動(dòng)增強(qiáng)[10]，而雙側(cè)前牙咬合加高則可致軟骨增殖性反應(yīng)顯著增強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量和軟骨基質(zhì)體積增加，軟骨明顯增厚[11]。無論是單側(cè)前牙反模型還是雙側(cè)前牙咬合加高模型，其導(dǎo)致的髁突變化，雙側(cè)基本對(duì)稱，無明顯差異。 而本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的偏頜模型，其髁突骨關(guān)節(jié)面變形，6 只大鼠中3 只出現(xiàn)CT 影像可見的髁突表面凹陷，且均出現(xiàn)在左側(cè)髁突，對(duì)應(yīng)的組織學(xué)切片可見關(guān)節(jié)面陷窩處軟骨增厚，內(nèi)有無細(xì)胞區(qū)及軟骨空腔，這些結(jié)果說明，偏頜可以導(dǎo)致髁突出現(xiàn)非對(duì)稱的異常改建。

臨床上常用CT 檢查TMJ 的骨性改變情況。 近年來，青少年特發(fā)性髁突吸收時(shí)有報(bào)道，其CT 影像特征是髁突皮質(zhì)破壞、髁突表面不規(guī)則吸收等[12-14]。但CT 對(duì)軟骨的成像較差。 本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建偏頜動(dòng)物模型， 在大鼠顯微CT 圖像上觀察到與臨床病例相似的髁突皮質(zhì)表面不規(guī)則凹陷征象，采用組織學(xué)染色對(duì)凹陷部位作進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，髁突表面的陷窩處有軟骨組織充填，在凹陷區(qū)軟骨中，軟骨細(xì)胞排列混亂，分層不明顯，有細(xì)胞壞死后形成的無細(xì)胞區(qū)及空腔等征象，說明偏頜對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)具有負(fù)面刺激作用，該結(jié)果與臨床研究報(bào)道的有偏側(cè)咀嚼習(xí)慣的患者常有顳下頜關(guān)節(jié)紊亂表現(xiàn)[15-16]的結(jié)論相吻合。

有研究表明，下頜偏斜對(duì)側(cè)和偏斜側(cè)的顳下頜關(guān)節(jié)中，關(guān)節(jié)盤處于不同的受力環(huán)境下，偏斜對(duì)側(cè)的關(guān)節(jié)盤受力部位靠?jī)?nèi)側(cè)， 受力區(qū)域相對(duì)集中；而偏斜側(cè)的關(guān)節(jié)盤受力部位靠外側(cè)，受力區(qū)域相對(duì)分散[17]。 雖然沒有證據(jù)證明本研究中大鼠下頜被導(dǎo)向右側(cè)后，其關(guān)節(jié)內(nèi)受壓情況將發(fā)生變化，動(dòng)物是否出現(xiàn)了偏側(cè)咀嚼，以及右側(cè)是否成為其功能性偏側(cè)咀嚼側(cè)，但是髁突凹陷均出現(xiàn)在左側(cè)，說明本研究所建偏頜模型中，下頜功能可能是不對(duì)稱的，不對(duì)稱的咀嚼活動(dòng)導(dǎo)致了髁突的不對(duì)稱性改建。 臨床上也發(fā)現(xiàn)，有偏側(cè)咀嚼習(xí)慣者，患顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病時(shí)，其癥狀常出現(xiàn)在非咀嚼側(cè)[15]。偏頜、偏側(cè)咀嚼、顳下頜關(guān)節(jié)不對(duì)稱改建及臨床上顳下頜關(guān)節(jié)紊亂表現(xiàn)之間存在怎樣的對(duì)應(yīng)關(guān)系，尚需要進(jìn)行大樣本病例分析方可得出結(jié)論。

盡管有50%的偏頜組左側(cè)髁突出現(xiàn)了陷窩樣改變，但是偏頜組雙側(cè)的髁突軟骨厚度及micro-CT測(cè)量指標(biāo)均未見明顯差異，說明偏頜導(dǎo)致的髁突異常改建的非對(duì)稱性特征以局部變化為主。 臨床上很難獲得OA 早期標(biāo)本， 很難捕捉到早期關(guān)節(jié)的細(xì)小變化。 本研究所建的偏頜模型為研究異常咬合導(dǎo)致TMJ 軟骨及軟骨下骨的異常改建規(guī)律，提供了較好的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)途徑。