竹葉抗氧化物-膠原蛋白復(fù)合涂膜對鮐魚的保鮮效果

胡嘉惠，林益航，吳詩寅，魏家正，戴寧，陳靜

浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院（舟山 316022）

鮐魚（Pneumatophorus japonicus），鱸形目，鯖科，鮐屬，是中國東海與黃海海域的主要經(jīng)濟魚類[1-2]。鮐魚體內(nèi)酶系發(fā)達(dá)，蛋白質(zhì)含量較高，因此它的冷藏保鮮期較短，容易在運輸和銷售過程中發(fā)生腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生惡臭味和腐敗臭味[3-4]。因此為后續(xù)加工的順利進(jìn)行，運用各種保鮮手段延長鮐魚的保鮮期至關(guān)重要。鮐魚的保藏技術(shù)主要以物理保鮮法，即低溫保鮮為主，但低溫條件并不能完全阻止魚肉的腐敗和有害微生物的繁殖。柵欄技術(shù)能夠通過多重保鮮方法的疊加，實現(xiàn)食品的保鮮和貯藏。因此在低溫保鮮的基礎(chǔ)上，適量添加具有抗氧化活性的植物保鮮劑，有利于實現(xiàn)低溫保鮮、抑菌、抗氧化的協(xié)同作用，維持食品的優(yōu)良品質(zhì)。

竹葉抗氧化物（AOB）是來自于竹葉中的黃酮類、內(nèi)酯類和酚酸類化合物，能較好抑制多種食品致病菌[5-6]，可作為天然食品抗氧化劑在水產(chǎn)品、肉制品等食品中使用。研究表明，AOB處理后的冷卻羊肉能夠延長保鮮時間5～7 d[7]。劉夢等[8]研究發(fā)現(xiàn)相較于其他幾種天然抗氧化劑，AOB能有效減少150 ℃熱加工條件下的熟牛肉制品中的脂肪氧化。官愛艷等[9]研究表明AOB對鮮海鱸魚魚肉有保鮮作用，經(jīng)AOB浸泡處理的海鱸魚較對照組保鮮時間延長4 d。

將可食性膜包裹在水產(chǎn)品上也能夠延長水產(chǎn)品的保鮮期。如將魚鱗膠原蛋白、馬鈴薯淀粉和高良姜精油混合制備的可食性膜能抑制羅非魚魚肉的油脂氧化和微生物生長，延長魚肉的保鮮期[10]。趙厚菲[11]制備的基于肉桂醛和溶菌酶的復(fù)合涂膜顯著抑制美國紅魚在冷藏過程中細(xì)菌的生長，延緩TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)、TBA值、K值等指標(biāo)的增加速度，且將貨架期延長5～10 d。

試驗利用魚鱗膠原蛋白與竹葉抗氧化物制備具有一定抗張強度及穩(wěn)定性的可食性抑菌膜，以新鮮鮐魚魚片為原料，探究竹葉抗氧化物/膠原蛋白復(fù)合可食性抑菌膜對魚片的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

膠原蛋白粉（武漢佰興生物科技有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（上海瑞永生物科技有限公司）；甘油（Ar，西隴科學(xué)股份有限公司）；竹葉抗氧化物（AOB，浙江圣氏生物科技有限公司）；瓊脂固體培養(yǎng)基（南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司）；三氯乙酸（TCA，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液（北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院）；氯仿（Ar，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

生鮮青占魚（舟山市國際水產(chǎn)城）。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（浙江海洋大學(xué)食品實驗室）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗器（KH-500DE，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥機（DH-9626A，日本東京理化器械公司）；紫外分光光度計（UV-2802s，奧豪斯儀器上海有限公司）；半微量凱氏定氮儀（SKD-2000，上海沛歐分析儀器有限公司）；多頭磁力加熱攪拌器（HJ-6，國華常州儀器制造有限公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；數(shù)顯均漿機（T18，上海書培實驗設(shè)備有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9082 MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 竹葉提取物/膠原蛋白復(fù)合膜的制備

1.2.1.1 制備工藝流程圖

1.2.1.2 復(fù)合膜的詳細(xì)制取步驟

用50 mL、50 ℃的磷酸鹽緩沖溶液溶解12 g膠原蛋白粉。調(diào)節(jié)pH 7.5左右并加入適量甘油，于50 ℃恒溫水浴加熱，加入0.2%轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（按膠原蛋白質(zhì)量計）充分?jǐn)嚢?，攪拌后均勻加入竹葉提取物，配成的竹葉提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為膠原蛋白質(zhì)量的0，0.1%，0.5%，1.0%，3.0%和5.0%的溶液。處理好后靜置20 min，使其充分反應(yīng)。

用均漿機均質(zhì)10 min，并用超聲消泡10 min，處理后竹葉提取物/膠原蛋白混合液在聚乙烯模具中定量流延，成膜液冷卻后將其移入電熱鼓風(fēng)干燥機中干燥，干燥溫度50 ℃，干燥時間8 h，干燥完畢后，冷卻即可揭膜。

圖1 竹葉提取物/膠原蛋白復(fù)合膜的制備工藝流程圖

1.2.2 鮐魚的復(fù)合涂膜保鮮

將鮐魚去頭、去尾、清除內(nèi)臟后清洗干凈，取魚刺骨兩側(cè)魚片，每片質(zhì)量（100±5）g，用去離子水洗凈，晾干。將魚片浸泡于不同濃度梯度的復(fù)合溶液，0.5 h后取出。于已滅菌的聚乙烯小袋內(nèi)密封，置于4℃冰箱保存。以未涂膜的魚片作為對照組，分別測定0～18 d（每隔3 d測定1次）中各樣品的鮮度指標(biāo)。

1.2.3 鮐魚的微生物學(xué)指標(biāo)測定

1.2.3.1 菌落總數(shù)的測定（TVC）

依據(jù)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》[12]，測定貯藏期0～18 d內(nèi)鮐魚的菌落總數(shù)。菌落計數(shù)以菌落形成單位（CFU）計。

1.2.3.2 抑菌性的測定

竹葉提取物復(fù)合膜的抑菌性利用瓊脂擴散法進(jìn)行測定。將膜用剪刀剪成直徑大小10 mm的小圓片，將其覆蓋在用待測菌菌懸液涂布均勻的瓊脂培養(yǎng)基的表面上。倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，在37 ℃下培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，持續(xù)培養(yǎng)24 h。觀察竹葉提取物復(fù)合膜表面的菌體生長狀況，同時記錄抑菌圈的直徑[13]。

1.2.4 鮐魚的鮮度指標(biāo)測定

1.2.4.1 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

按半微量蒸餾法測定[14]。由鹽酸體積的消耗量計算TVB-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.4.2 過氧化值（PV）的測定

依據(jù)GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中過氧化值的測定》[15]測定貯藏期內(nèi)鮐魚魚肉的過氧化值（PV）。

1.2.4.3 硫代巴比妥酸值（TBA）的測定

參照GB/T 35252—2017《動植物油脂 2-硫代巴比妥酸值的測定直接法》[16]測定產(chǎn)品中硫代巴比妥酸（TBA）的值。

1.2.4.4 感官評定

由食品與藥學(xué)院的50名受過專業(yè)訓(xùn)練的工作人員和學(xué)生組成5組評價小組，每組10人，分別對試驗組和對照組的鮐魚進(jìn)行感官分析。試驗組是用竹葉提取物（從微生物學(xué)指標(biāo)測定中選取的最佳抑菌濃度）處理后的鮐魚片，對照組是沒有用竹葉提取物處理的鮐魚片，在相同條件下置于常溫下24 h所得。評價小組成員分別從色澤、氣味、總體可接受度3個指標(biāo)進(jìn)行感官評價，按表1的要求進(jìn)行評分，總分為100分，結(jié)果求均值。

表1 鮐魚感官評定表

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用3次平行試驗結(jié)果的平均值，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮐魚的微生物學(xué)指標(biāo)結(jié)果

2.1.1 竹葉抗氧化物對抑菌膜的抑菌性影響

由圖2可知：對照組膠原蛋白膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無抑菌效果，而加入竹葉抗氧化物的膠原蛋白膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制作用，且濃度越高，復(fù)合膜的抑菌作用越顯著（p＜0.05）。竹葉抗氧化物濃度增加到0.1%時，膜的抑菌性能開始出現(xiàn)，并呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，竹葉抗氧化物濃度上升至1.0%時，膜的抑菌性明顯增加。竹葉抗氧化物濃度3.0%時，此時與大腸桿菌相比，復(fù)合膜的抑菌性對金黃色葡萄球菌的抑制效果更加顯著（p＜0.05）[6]。

圖2 添加不同濃度竹葉抗氧化物復(fù)合膜的抑菌性

2.1.2 鮐魚魚片菌落總數(shù)變化

菌落總數(shù)變化（TVC）可以較直觀地反映蛋白質(zhì)和氨基酸的分解與代謝情況。因此測定菌落總數(shù)能夠用于判定水產(chǎn)品腐敗程度。含有不同濃度（0，0.1%，0.5%，1.0%，3.0%和5.0%）AOB的可食性抑菌膜對冷藏鮐魚魚片中的菌落總數(shù)變化見圖3。

圖3 冷藏鮐魚魚片的菌落總數(shù)變化情況

魚肉原始菌落數(shù)為3.15 lg CFU/g，隨著貯藏時間延長，各組樣品的TVC均上升。與對照組相比，竹葉抗氧化物復(fù)合膜包覆的樣品菌落總數(shù)增長速度較慢，這是由于膠原蛋白溶液包裹于魚片表面后形成一層薄膜，阻隔魚片與外界空氣的直接接觸，同時，竹葉抗氧化物中的黃酮類物質(zhì)能通過抑制細(xì)菌新陳代謝所需的酶類活性，達(dá)到抑菌目的[17]。

試驗前3 d，各組樣品的TVC增長速度平穩(wěn)。隨后魚體逐步進(jìn)入自溶階段，魚肉組織完整性被破壞后微生物開始從表面侵入到組織內(nèi)部，各組樣品的菌落總數(shù)開始出現(xiàn)不同幅度的增長。Al-Daqal等[18]研究表明，水產(chǎn)品的菌落總數(shù)超過6 lg CFU/g即為不可食用狀態(tài)。試驗第6天，空白對照組的菌落總數(shù)達(dá)6.74 lg CFU/g，試驗第9天時，添加0.1%和0.5%竹葉抗氧化物的魚肉樣品的菌落總數(shù)大于6 lg CFU/g，超出可食用范圍；添加1%和3%竹葉抗氧化物的魚肉樣品在第12天超出可食用范圍；添加5%竹葉抗氧化物的魚肉樣品的可食用狀態(tài)一直保持到第18天，比對照組多保持9～12 d。

在相同貯藏時間下，各試驗組的菌落總數(shù)顯著低于對照組（p＜0.05），在相同貯藏環(huán)境下，各試驗組的保鮮期較對照組更長，表明竹葉抗氧化物具有較強的抑菌作用，且抑菌效果隨著濃度升高而加強，該結(jié)論與張曉麗等[19]的研究結(jié)果相符合。

2.2 復(fù)合膜對鮐魚化學(xué)指標(biāo)的影響

2.2.1 TVB-N的變化

根據(jù)GB 2733—2015《鮮、凍動物性水產(chǎn)品》，總揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）≤20 mg/100 g的海水魚沒有發(fā)生腐敗現(xiàn)象。若海水魚TVB-N≤12 mg/100 g，則可歸類為新鮮魚，若海水魚的TVB-N＞30 mg/100 g則不可食用。TVB-N可反映魚體的鮮度和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，魚體腐敗變質(zhì)時，蛋白質(zhì)會受到內(nèi)源性酶、內(nèi)部細(xì)菌和環(huán)境細(xì)菌的影響，分解為低級的胺類物質(zhì)等，并且產(chǎn)生不愉快的氣味。7組鮐魚在為期18 d的貯藏過程中TVB-N數(shù)值的變化可由圖4反映。隨著時間延長，7組鮐魚的TVB-N在包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組與未包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組中均不斷增大。對照組在第3天時的TVB-N值達(dá)28.19 mg/100 g，說明鮐魚已腐敗變質(zhì)，不可食用。以添加不同濃度的AOB膠原蛋白薄膜作為變量，就TVB-N值的變化而言，與對照組相比，試驗組曲線上升速度顯然更低；比較不同AOB濃度下各試驗組的變化情況，膠原蛋白薄膜中AOB濃度越高，鮐魚的TVB-N值增加速度越緩慢。添加5%的AOB時，鮐魚的TVB-N上升速度最緩慢，而且完全腐敗發(fā)生在第15天，此時TVB-N值為30.79 mg/100 g。由此可見，AOB添加量5%的復(fù)合膠原蛋白膜對鮐魚的保鮮起到良好作用。

圖4 冷藏鮐魚魚片的TVB-N在使用添加不同濃度竹葉抗氧化物復(fù)合膜下的變化情況

2.2.2 PV和TBA值的變化

2.2.2.1 PV值的變化

在18 d貯藏期內(nèi)，不同AOB添加量的膠原蛋白復(fù)合膜對鮐魚的過氧化值（PV）的測定數(shù)值如圖5所示。18 d貯藏過程中，隨著時間延長，包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組與未包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組的鮐魚的過氧化值不斷增大，初期變化平緩，后期增速加快，但包膜組的鮐魚的過氧化值升高幅度不同：0.1%＞0.5%＞1.0%＞3.0%＞5.0%。對照組在第18天時，其過氧化值為15.12，相比初始值而言增加20倍。同時，AOB濃度連續(xù)增大，鮐魚樣本的過氧化值顯著性差異（p＜0.05）一并增加，顯著性越大則越能說明膜的抗氧化效果與AOB添加量相關(guān)，即AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜對鮐魚的保鮮效果顯著，與甘釗生等[20]研究的復(fù)合魚鱗膠原蛋白膜的保鮮效果相吻合。

圖5 冷藏鮐魚魚片的PV在使用添加不同濃度竹葉抗氧化物復(fù)合膜下的變化情況

2.2.2.2 TBA值的變化

鮐魚由于含有多不飽和脂肪酸，故在貯藏過程中極易發(fā)生脂肪的氧化現(xiàn)象。18 d貯藏期內(nèi)，不同AOB添加量的膠原蛋白復(fù)合膜對鮐魚的TBA的測定數(shù)值如圖6所示。18 d貯藏過程中，隨著時間延長，包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組與未包裹AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組的鮐魚的TBA值不斷增大，表示魚體的氧化過程持續(xù)不斷地發(fā)生，且魚體的氧化程度不斷加重。其中，AOB添加量5%時的TBA值的增長最為緩慢，不包膜的對照組的TBA值增長最迅速，且7組曲線的TBA值增長速率曲線各不相同，說明AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜在延緩脂肪氧化方面起到一定作用，與龐彩霞[21]研究的AOB有清除自由基能力和良好保鮮效果的結(jié)論一致。由圖6可以看出：貯藏0，3，6，9，12，15和18 d時，添加5%的AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜組的TBA值和對照組有顯著性差異（p＜0.05），且均顯著低于對照組，但均與AOB添加量3%無顯著性差異（p＞0.05）。這主要是由于魚肉體內(nèi)的酶與環(huán)境中的微生物共同作用下，魚肉脂肪分解加速，氧化程度加劇，使魚肉變質(zhì)腐敗。而AOB復(fù)合膠原蛋白薄膜的良好抑菌保鮮效果抑制這種脂肪腐敗作用，以AOB添加量5%時的薄膜抑制脂肪氧化的效果最好。

圖6 冷藏鮐魚魚片的TBA在使用添加不同濃度竹葉抗氧化物膜下的變化情況

2.2.3 鮐魚的感官評定結(jié)果

感官評價是最直觀判斷鮐魚品質(zhì)的方法，鮐魚的感官評定結(jié)果如圖7所示。試驗組在色澤、氣味和總體可接受度中的評分均高于對照組。第1周內(nèi)2組評分變化不大，這是由于初始階段細(xì)菌基數(shù)小、繁殖慢，對鮐魚品質(zhì)影響小，而從第9天開始，差距逐漸顯現(xiàn)，試驗組變化趨勢趨于平緩，較穩(wěn)定，這是由于竹葉抗氧化物具有抑菌性能，抑制腐敗菌大量繁殖，使細(xì)菌處在一個較為可控的范圍內(nèi)而對照組普遍前期變化小，后期變化大，這是由于細(xì)菌大量繁殖，腐敗進(jìn)程加劇，鮐魚鮮度急劇下降。從總體可以看出，經(jīng)竹葉抗氧化物處理后的鮐魚品質(zhì)更加穩(wěn)定，鮮度維持時間更長，說明竹葉抗氧化物膠原蛋白膜具有明顯抑菌作用。

圖7 竹葉抗氧化物復(fù)合膜對冷藏鮐魚魚片感官評定的影響

3 結(jié)論

在膠原蛋白涂膜中添加竹葉抗氧化物可有效增加涂膜的保鮮性能，以及其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌效果，竹葉抗氧化物添加量5%時，其對膜的改良效果最佳。保鮮復(fù)合涂膜通過包覆在鮐魚表面可有效延緩其TVC增長，延緩蛋白質(zhì)降解和魚體的脂肪氧化，對魚體中的微生物生長繁殖有抑制作用，延緩魚體腐敗，延長產(chǎn)品保藏時間。試驗結(jié)果為水產(chǎn)品的保鮮提供一種有效方式。

在國內(nèi)外，利用抑菌蛋白膜防止水產(chǎn)品腐敗的案例不多，既是由于抑菌蛋白膜的成本高，相比于防腐劑制作工藝也更復(fù)雜，抑菌效果也不如化學(xué)防腐劑，如何研制出一種對人體無害、工藝簡單、成本低廉且抑菌效果良好的天然防腐劑成為亟待解決的問題。通過對竹葉抗氧化物抑菌蛋白膜的研究，為抑菌蛋白膜研制提供新思路，有望研制出一種多功能、多領(lǐng)域的抑菌蛋白膜。