丁酸介導下腸道菌群與宿主免疫互作機制的研究進展

梁開陽，孫志洪，譚支良，劉 勇*

(1. 西南大學動物科學技術學院，重慶 400700； 2. 中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 410125)

菌群來源的丁酸作為免疫調節(jié)因子，在先天免疫細胞的產生、轉移及功能發(fā)揮等重要免疫學過程中起重要調節(jié)作用；丁酸經多種途徑調節(jié)機體適應性免疫活性，包括激活細胞表面受體G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)、抑制組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)和代謝整合等機制[1-2]。因此，本文將聚焦于產丁酸菌-丁酸-宿主免疫系統(tǒng)之間的互作關系，系統(tǒng)地概述產丁酸菌及丁酸對宿主先天性免疫和適應性免疫系統(tǒng)的影響及其潛在的互作機制。

1 腸道菌群代謝產物-丁酸的生成途徑

腸道菌群作為機體最大的隱形器官，通過調控宿主營養(yǎng)素代謝和機體免疫狀態(tài)而維持機體健康穩(wěn)態(tài)。在哺乳動物大腸厭氧微生物的作用下，碳水化合物(carbohydrate，CHO)被降解發(fā)酵產生大量的短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)，包括乙酸、丙酸、丁酸，其中丁酸(butyrate)在調節(jié)宿主能量代謝、腸道內環(huán)境和宿主免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。目前已知丁酸的微生物代謝通路中，乙酰輔酶A(acetyl-CoA)通路是最主要的途徑，丁酰輔酶A(butyrate phosphate)通過丁酰輔酶A:乙酰輔酶A轉移酶(butyryl-CoA:acetate CoA-transferase，BUT)和丁酸激酶(butyrate kinase，BUK)產生丁酸[3-4]，如圖1所示。

圖1 腸道菌群代謝生成丁酸的主要代謝路徑Fig.1 The major metabolic pathways of butyrate by gut microbes

丁酸生成菌(butyrate-producing bacteria，BPB)是宿主腸道中重要的功能菌群，主要存在于盲腸和結腸，以厚壁菌門(Firmicutes)為主，還包括梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)等；而在屬水平上則有毛螺菌屬(Lachnospiraceae)、梭菌屬(Clostridium)、真桿菌屬(Eubacterium)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、羅斯菌屬(Roseburia)和厭氧菌屬(Anaerostipes)等[5-7]。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)作為腸道中最常見的丁酸生成菌之一，具有強大的產丁酸能力，并在調節(jié)機體免疫方面起著重要作用[6]。近年來，新型BPB如Mediterraneibacterbutyricigenes[8]，Collinsellaaerofacienssubsp.shenzhenensissubsp. nov.[5]和Clostridiumcompostisp. nov.[7]等也被不斷發(fā)現和分離培養(yǎng)。

2 丁酸調控腸道免疫的研究進展

2.1 丁酸調控腸道先天性免疫的研究進展

先天免疫系統(tǒng)(innate immune system，IIS)是由一系列先天性淋巴細胞(innate lymphoid cells，ILCs)和補體系統(tǒng)構成，通過炎癥反應產生非特異性防御系統(tǒng)[9]。主要效應是以化學因子(包括細胞因子)作為信號分子，將免疫細胞召集到感染或炎癥區(qū)域，激活免疫系統(tǒng)來促進清除外源病原、感染細胞、壞死細胞或抗體-抗原復合體[10-11]。丁酸在炎癥性腸病中可抑制先天性免疫中樹突狀細胞(dendritic cell，DC)、巨噬細胞(macrophage，MΦ)和中性粒細胞(neutrophils，NE)等細胞的過度活化，下調炎癥因子而減輕局部腸道炎癥。

DC是抗原呈遞的重要場所，也是連接先天和后天免疫系統(tǒng)的重要紐帶，主導T細胞反應的激活和穩(wěn)衡。菌群代謝產物丁酸通過調節(jié)DC表面功能蛋白的表達而影響其分化、成熟過程及功能特性。在丁酸的作用下，人類DC的成熟會延遲，其特征是DC的形成和CD80、CD83、CD1a和II類組織相容性復合體 (major histocompatibility complex，MHC)等分子(這些分子在成熟的樹突狀細胞中高度表達)表達受到抑制[12]，并下調CD54、CD86和II型人白細胞抗原(HLA)的表達以抑制DC表型分化[12]；此外，通過作用于GPR109A和HDAC的方式，丁酸能抑制LPS誘導的人單核細胞來源DC細胞的成熟和代謝，并調節(jié)它們使初始CD4+T細胞向產生IL-10的調節(jié)性T細胞分化[13]。最近一項研究發(fā)現，丁酸以作用于細胞GPR41、GPR109A和抑制HDAC的方式上調CD103+CD11b+DC中轉化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)和全反式維甲酸(all-trans-retinoicacid，ATRA)的生成，增加結腸黏膜內B細胞分泌型IgA(secretory immunoglobulin A，SIgA)的表達而維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)[14]。

MΦ是丁酸的重要靶點細胞，其相互作用維持MΦ調控的腸道免疫穩(wěn)態(tài)[14]。例如，丁酸通過抑制HDAC3來驅動單核細胞向MΦ的分化，和抑制T細胞產生促炎因子IL-17a，從而增加MΦ對病原菌的吞噬能力[15]。另外，丁酸通過促進MΦ中具有抗菌功能的鈣蛋白酶(calprotectin)的表達，也可以增強MΦ對菌群的殺菌能力[1,16]。添加GPCRs抑制劑-百白咳毒素，結果并不影響丁酸增強MΦ的抗菌功能，表明丁酸作用于MΦ的方式并非依賴于GPCRs[1]，而是通過作用于HDAC，丁酸使MΦ細胞中促炎因子(NO、IL-6和IL-12)表達下調并抑制腸道炎癥發(fā)生[17]。丁酸的抗炎效果在體外也得到了驗證，其可減少MΦ細胞株RAW264.7分泌促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6(LPS誘導)，而增加抗炎因子IL-10的生成[18]；推測，產丁酸共生菌可能通過下調宿主腸道MΦ中促炎因子的表達，降低腸道對共生菌的免疫反應而維持腸道菌群共生微環(huán)境。

自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)的激活受到一系列細胞表面抑制和激活受體信號的嚴格調控，這些受體與靶細胞配體相互作用。免疫受體NKG2D觸發(fā)NK和MΦ細胞的初級活化，并作為信號源刺激CD8+T細胞和T細胞的活化[19]，而丁酸又被證明能夠上調NK細胞中NKG2D配體MICA/B表達[20]，這表明丁酸可能作用于NKG2D誘導NK細胞發(fā)揮免疫效應。此外，丁酸鈉通過抑制腫瘤細胞中的HDAC而增加Ⅰ MHC的表達，導致NK細胞殺傷敏感性增強[20]。

除了調控上述幾種免疫細胞之外，丁酸還能與NE的GPR43受體結合，降低NE促炎因子如TNF-α、IL-6和IL-12等的表達，通過NE調節(jié)活性氧的產生以及增加它們吞噬細胞微生物和顆粒的能力，對人類或嚙齒動物NE進行的研究表明，丁酸能減少TNF-α的產生，最近的一項研究報道了在接受丁酸鹽灌腸的小鼠的葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎模型中NE募集和炎癥減弱，因此說明，丁酸能夠調控NE招募、效應器功能和存活等諸多方面的功能[18,21]。在炎癥反應中，丁酸可誘導激活腸道上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)、NE和嗜酸性粒細胞(eosinophils)中GPCRs的高表達，抑制HDAC，導致核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)失活，減少促炎因子的產生，進而降低炎癥反應[22-23]。同時，丁酸鹽還被證實可抑制小鼠與人的肥大細胞(mast cell)脫顆粒，通過抑制肥大細胞中的HDAC活性(而非GPCRs受體途徑)，引起組蛋白乙?；闹匦路植?，并下調BTK、SYK和LAT啟動子區(qū)乙?；?，這對于抑制炎癥因子產生和下游信號轉導引發(fā)的炎癥疾病具有積極作用[24]。

腸道菌群降解碳水化合物生成丁酸，而丁酸作為先天性免疫細胞(包括DC、NK、MΦ和NE等細胞)HDAC的抑制劑，通過增加細胞內組蛋白的乙?；潭?，誘導抗炎因子的產生，激活其他免疫細胞，從而降低局部炎癥反應和維持腸道局部穩(wěn)態(tài)。腸道菌群代謝產物-丁酸介導的腸道菌群與宿主先天性免疫細胞間的復雜關系網如圖2所示。

2.2 丁酸調控腸道適應性免疫的研究進展

除作為先天性免疫細胞的適配體發(fā)揮免疫調節(jié)作用之外，丁酸還能增加體外結腸上皮細胞產生細胞因子和趨化因子，包括TNF-α、IL-6、CXCL1和CXCl10，炎癥介質的產生是應對炎癥刺激時結腸中白細胞的充分招募和T淋巴細胞的激活所必需的，并通過DC和MΦ的激活/分化直接影響淋巴細胞[21]。丁酸調控適應性免疫主要是通過免疫細胞招募、激活及促抗體分泌等多種途徑來作用于適應性免疫細胞(包括效應B細胞和T細胞)，調控宿主長期記憶性免疫和短期免疫應答，來對抗惡性炎癥反應和維持宿主免疫穩(wěn)態(tài)[21,25]。

效應B細胞(effector B cell)能分泌多種抗體對抗病原菌入侵，菌群代謝物丁酸作為信號分子和能量物質可促進B細胞轉化為效應B細胞并產生抗體。丁酸作為能量物質調節(jié)B細胞的能量代謝，增加乙酰輔酶A產生和促進氧化磷酸化、糖酵解和脂肪酸合成而調節(jié)能量代謝過程，為抗體生成提供能量基礎[26]。最近一篇綜述闡明，丁酸作用于效應B細胞是通過抑制HDAC的方式，而非GPCRs依賴性途徑[27]，通過刺激IECs中TGF-β表達，丁酸誘導B細胞的分化，產生IgA漿細胞的類轉換(class-switched recombination，CSR)反應[14, 28]；或者直接接觸B細胞，促進B細胞活化和IgA、IgG的產生[26]。胞苷脫氨酶(adenosine deaminase，AID)和B細胞誘導成熟蛋白-1(B lymphocyte-induced maturation protein，Blimp-1)對于抗體產生和抗體反應至關重要[29-30]，但高表達的AID和Blimp-1也會引發(fā)自身免疫性疾病[31]。最新研究發(fā)現，菌群代謝產生的丁酸影響B(tài)細胞的表觀遺傳機制，下調B細胞AID和Blimp-1表達、體細胞突變、漿細胞分化和抗體產生[27]，并且抑制B細胞的IgE的CSR，減輕IgE介導的過敏性反應[27]。在其他研究中也發(fā)現，AID缺乏或者低表達的小鼠，能夠減少自身抗體的產生和延緩疾病發(fā)生[32]。這與前面闡述丁酸支持B細胞的抗體反應相矛盾，原因與丁酸使用的劑量有關，在低劑量時，丁酸適度增強CSR，支持抗體反應，而在高劑量時，減輕過敏反應[27]。此外，菌群代謝物丁酸調控色氨酸代謝菌(Allobaculum、Bifidobacterium和Rhodosprillaceae_unclassified)，使色氨酸代謝成血清素并進一步生成5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)，5-HIAA作為適配體激活調節(jié)性B細胞(Bregs)的芳基烴受體(aryl-hydrocarbon receptor，AhR)，誘導CD19+CD21hiCD24hiBregs產生抗炎因子IL-10，并阻斷B細胞生發(fā)中心和漿細胞的分化，證實補充丁酸可緩解全身性自身免疫疾病的發(fā)生[33-34]。

丁酸調節(jié)T細胞的激活和效應反應，誘導T細胞向其他細胞轉化，丁酸來源的乙酰基進入T細胞乙酰輔酶A池，通過影響組蛋白乙?；胶图毎蜃拥漠a生發(fā)揮作用[35]。適應性免疫系統(tǒng)產生的兩種主要的效應T細胞是輔助T細胞(helper T cell，Th)和調節(jié)T細胞(regulatory T cells，Tergs)。Th細胞的特征在于CD4和轉錄因子(T-bet，GATA3和RORγt)的特異性表達，以此影響其他免疫細胞激活和分化的細胞因子釋放[35-36]。DC細胞、單核細胞、MΦ等免疫細胞可分泌促炎細胞因子，例如IL-1β、IL-8和IFN-γ，參與炎癥反應的早期應答和放大，這些因子可激活初始CD4+T細胞[37]，根據釋放的特定細胞因子，CD4+T細胞會進一步分化為不同的Th亞群，如Th1、Th2、Th17等[38]。Park等[39-40]證明，丁酸可促進Th17和Th1效應細胞的生成，Th17細胞能產生細胞因子IL17和IL-22，IL-22可促進AMPs的產生，增強上皮再生，這有利于維持腸道上皮細胞功能，促進與共棲微生物的穩(wěn)態(tài)對話。此外，丁酸可促進細胞代謝，增強mTOR信號通路元件的活性和調節(jié)T細胞的葡萄糖代謝來改變T細胞的代謝過程，可增強CD8+T細胞效應功能[41]，改變CD8+T細胞的記憶電位，促進記憶細胞長期存活[42]。最近的研究還表明，丁酸直接作用于CD8+T細胞，導致CD8+T細胞的啟動增強和IFN-γ反應增強[43]。

Tregs在腸道中大量存在，并能抑制飲食和腸道菌群刺激的有害反應[44]，在微生物信號誘導下，丁酸通過GPR43受體作用于FOXP3位點和促進組蛋白H3乙?；?，調節(jié)Tregs的增殖，并增加T細胞中IL-18的產生來調節(jié)免疫和組織炎癥[41,45-46]。Singh等[47-48]證明，丁酸能通過DC細胞表面GPR109A受體，促進初始T細胞轉化為FOXP3+Treg細胞，增加抗炎細胞因子IL-10的分泌，并抑制它們向產生促炎因子IFN-γ的細胞分化。與直接加入丁酸的效果一致，用產丁酸的梭狀芽胞菌接種無菌小鼠，也能顯著增強Tregs的分化。另外，通過對人類原生菌群的選擇篩選，分離出CD4+FOXP3+Treg的誘導菌株，結果顯示，產丁酸菌ClostridiaclustersIV、ClostridiaclustersXIVa和ClostridiaclustersXVIII也能夠促進Treg的增殖和分化[28]?？偟膩碚f，這些細菌代謝產物-丁酸的抗炎作用包括增加TGF-β、IL-10等抗炎因子生成、改變MΦ和DC呈遞抗原能力和增強T細胞初始反應，根據免疫環(huán)境的不同，丁酸可以促進效應T細胞和受體T細胞免疫效應[49](圖3)。

圖3 丁酸參與腸道菌群與機體獲得性免疫的互作網絡Fig.3 Butyrate-mediated complex network between gut microbes and host adaptive immunity

3 腸道菌群-丁酸-宿主免疫軸間的互作

動物腸道菌群與免疫系統(tǒng)之間的互作平衡是抵抗病原體入侵、阻止炎癥發(fā)生的關鍵。碳水化合物被腸道菌群代謝為SCFAs，參與宿主免疫、腸道菌群結構及腸道穩(wěn)態(tài)等重要生理過程，丁酸作為重要信號分子，在宿主先天性免疫和適應性免疫中扮演重要角色，同時通過影響宿主免疫狀態(tài)和腸道微環(huán)境調控腸道菌群結構。本部分內容著重于對腸道菌群-丁酸-宿主免疫軸間的互作關系進行闡述(圖4)。

IECs接收來自共生微生物或侵入病原體的信號，并通過調節(jié)黏膜屏障將信號傳遞給固有層免疫細胞來應答腸道內環(huán)境的變化。腸道中致病菌(Salmonella、Shigella、E.coli)的入侵導致上皮屏障受損，誘發(fā)炎癥反應[50-51]，產丁酸菌如Bifidobacterium、Lactobacill等又可代謝生成丁酸發(fā)揮重要作用，增強上皮屏障[52-53]，丁酸是調控人初級IECs和IEC細胞系表達的主要代謝物，能夠調節(jié)IECs周轉速率和屏障功能，以及調節(jié)炎癥和感染刺激后的反應[54]。在結直腸癌細胞中，丁酸可抑制HDAC，減緩細胞周期和降低誘導細胞凋亡的基因表達。通過GPR109A，丁酸能夠增加有助于腸上皮穩(wěn)態(tài)的細胞因子IL-18的產生，維持缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor, HIF)的穩(wěn)定化作用[55-56]，HIF是直接參與組織完整性維護的轉錄因子，調節(jié)AMPs和腸上皮緊密連接蛋白的產生[57]，并在微生物防御和清除異種生物方面起著重要作用[58]。Toll樣受體(Toll-like receptor, TLRs)是一類廣泛存在于多種生物體內的配體結合受體，是機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，IECs在受到丁酸的刺激后，通過降低TLR4的表達和炎性細胞因子(IL-6、TNF-α)的產生，來維持腸道菌群的平衡并調控微生物以及毒素對腸道的入侵[59-60]。IDO-1由IECs產生，作為調節(jié)免疫反應的效應分子，維持腸道穩(wěn)態(tài)，Martin-Gallausiaux等[54,61]發(fā)現，丁酸通過降低STAT1水平和HDAC抑制劑性質雙重調節(jié)抑制IDO-1的表達。宿主防御肽構成了大量的天然廣譜抗菌素，是幾乎所有生命形式中重要的第一道免疫線，丁酸能促進IECs分泌AMPs，如組織蛋白酶抑制劑cathelicidin LL-37和CAP-18[21]。除此之外，丁酸通過Warburg效應會抑制結腸癌細胞增殖，但低濃度促進結腸隱窩細胞增殖，高濃度促進結腸絨毛細胞凋亡[62]。

Paneth細胞是小腸上皮細胞譜系之一，位于小腸隱窩底部，它能分泌AMPs，如防御素(defensins)、抗菌蛋白(RegIIIγ)、溶菌酶(lysozyme)，并通過殺微生物活性來促進腸道先天免疫[63]。腸道菌群組成和代謝物影響宿主免疫力，將丁酸微注射到腸管腔中，發(fā)現其通過作用于Paneth細胞表面的GPR41受體分泌產生α-defensin[64]。微生物群會隨著α-defensin水平的差異而變化[65]，分泌的α-defensin作用于腸道微生物，殺死致病菌Salmonellatyphimurium、Acinetobacterbaumannii和Enterococcusfaecium，并增加有益菌Akkermansiamuciniphila、Bifidobacteriumadolescentis和Bifidobacteriumlongum的豐度，促進腸固有免疫[64]。在仔豬日糧中添加0.2%的丁酸，能減少因大腸桿菌侵襲誘導的炎癥反應，在體內外顯著上調defensin水平，并減少糞便中大腸桿菌數量[66]。Paneth細胞數量的減少和形態(tài)上的異常導致了腸道菌群的失調，通常會減少defensin的分泌或導致其功能障礙，進而促使腸道疾病的發(fā)生[67]。因此，產丁酸菌通過生成丁酸，促進Paneth細胞defensin分泌增加，調節(jié)腸道菌群結構以維持腸道內穩(wěn)態(tài)。宿主與腸道菌群相互作用還可通過腸道微生物-腸道-腦軸雙向進行調控，丁酸刺激腸道迷走神經傳入大腦，通過自主神經系統(tǒng)調節(jié)腸道運動和改變腸道上皮通透性，并改善血腦屏障和腸道屏障的完整性，以減少因有害菌入侵引發(fā)的炎癥性疾病[68]。

細菌群落組成變化的觸發(fā)因素很多，丁酸作用動物腸道的生理變化構成一個重要因素，通過調節(jié)免疫反應影響腸道屏障功能，從而可能間接修飾腸道細菌群落。腸屏障由完整的單層上皮細胞組成，細胞間緊密連接蛋白維持腸上皮的結構完整性和正常功能，丁酸鈉處理明顯上調動物機體腸上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的基因表達，增強腸黏膜的屏障功能，維持腸黏膜的完整性[69]。大量的研究也表明，無論是口服丁酸梭菌，還是其代謝產物丁酸鹽都能增加腸道緊密連接蛋白表達[70-73]。生長因子如GLP-2、IGF-1、EGF有益于動物腸道的發(fā)育，丁酸通過促進它們在腸道中合成增加，進而改善腸形態(tài)，促進腸道細胞發(fā)育，增強吸收功能，維持上皮屏障功能[74-76]。免疫途徑的缺陷可能損害屏障功能，細菌發(fā)生易位，從而導致炎癥反應。在其他病理條件下，腸道菌群也會發(fā)生變化，例如，在炎性腸病和糖尿病患者的腸道中發(fā)現產丁酸菌顯著減少[77-78]，如Roseburia、Clostridiales、prausnitzii等，表明產丁酸菌或者丁酸是疾病抗性的重要因素[79-80]。一方面，腸道菌群結構決定丁酸產量。在腸道內丁酸濃度受腸道共生菌組成和比例的影響，微生態(tài)失調可導致丁酸含量發(fā)生變化。典型例子是將雙歧桿菌和產丁酸菌一起培養(yǎng)，雙歧桿菌較強的代謝能力使產丁酸菌的競爭力降低[81]。另一方面，丁酸濃度會反向調節(jié)菌群結構，通過口服丁酸鹽，腸道內Lachnospiraceaeblautia、Lachnospiraceaemarvinbryantia,、LachnospiraceaeNK4A136group和Faecalibacteriumprausnitzii等產丁酸菌的豐度降低[82]，說明丁酸補充劑可能是反饋抑制產丁酸菌組成與活性，或下調了參與丁酸生產的微生物基因表達。丁酸處理對回腸和結腸中的總細菌數沒有影響，但增加其中部分微生物豐度，如Acinetobacter、Actinobacillus、Facklamia、Globicatella、Kocuria和Rothia等菌屬[83]，另有研究發(fā)現，對生長豬靜脈注射丁酸鈉，Clostridiaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae和Anaerotruncus等梭菌屬豐度增加[65,84]。此外，腸道中丁酸的濃度還受膳食纖維攝入量、腸道滯留時間、宿主微生物代謝產物的影響[7]。

4 小結與展望

腸道菌群與宿主間的對話機制成為目前研究的熱點，而丁酸作為腸道菌群碳水化合物最重要的功能性代謝產物之一，被宿主靶向識別，可通過多種作用機制誘發(fā)先天和適應性免疫調節(jié)反應，從而增強或改善宿主免疫狀態(tài)。此外，腸道共生菌通過分泌丁酸作為信號分子調節(jié)宿主免疫狀態(tài)而影響腸道菌群結構與豐度，形成復雜的腸道菌群-丁酸-宿主免疫間的復雜互作關系，但除了本文所概述的三者互作關系之外，丁酸參與宿主免疫和腸道菌群功能結構的新作用機制還有待進一步研究。探明三者間的作用關系和作用機理，對維持腸道乃至機體免疫穩(wěn)態(tài)具有重要意義。