鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01株GE296_RS01450基因介導(dǎo)其對(duì)重金屬離子產(chǎn)生耐受性的分析

秦明星，宮曉煒，陳啟偉，王燕萍，權(quán) 衡，朱雨佳，鄭福英*，藺國(guó)珍*

(1.西北民族大學(xué)，生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipesfier，R.anatipesfier)是一種革蘭陰性菌，大小為0.2～0.4 μm，無(wú)鞭毛，屬于黃桿菌科，里默氏菌屬[1]。該菌可感染鴨、鵝、雞、火雞等家禽和野禽，尤其是2～5周齡的雛鴨易感，且發(fā)病鴨的死亡率較高，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的重大細(xì)菌性病原之一。迄今為止，國(guó)際上公認(rèn)的該菌的血清型有21種，各血清型之間無(wú)交叉保護(hù)作用，給疫苗預(yù)防增加了很大難度。因此，利用抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療仍然是控制鴨疫里默氏桿菌感染的重要手段，但抗生素的廣泛使用促進(jìn)了一些耐藥菌株的產(chǎn)生和擴(kuò)散?；诖?，科研人員開(kāi)展了鴨疫里默氏桿菌外排泵介導(dǎo)的耐藥機(jī)制的研究，以期提高抗生素的應(yīng)用效果，并控制耐藥菌株的產(chǎn)生[2-5]。

RND外排泵在革蘭陰性菌中廣泛存在，并且發(fā)揮多種生物學(xué)功能。RND外排泵由內(nèi)膜蛋白(inner membrane protein，IMP)、外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)和周質(zhì)膜融合蛋白(membrane fusion protein，MFP)構(gòu)成三重外排復(fù)合體[6-7]。RND外排泵具有廣泛的底物譜，包括抗生素、去污劑、有機(jī)溶劑、消毒劑、重金屬等，在特定條件下RND外排泵還能夠外排毒力因子[8]。根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)表的鴨疫里默氏桿菌基因組序列，該菌中存在3個(gè)RND外排泵系統(tǒng)，在RA-LZ01株中定位于GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455、GE296_RS05160-GE296_RS05165-GE296_RS05170和GE296_RS05660-GE296_RS05665-GE296_RS05770。GE296_RS05660-GE296_RS05665-GE296_RS05770對(duì)應(yīng)于RA-GD株的RIA_1117-RIA_1118-RIA_1119，該外排泵可外排氨基糖苷類抗生素和去污劑，被命名為RaeE-RaeF-RopN[9]。GE296_RS05160-GE296_RS05165-GE296_RS05170對(duì)應(yīng)于RA-CH-1菌株的B739_0871-B739_0872-B739_0873 和RA-GD菌株的RIA_1214-RIA_1215-RIA_1216，被命名為RaeC-RaeA-RaeB，該外排泵亦外排氨基糖苷類抗生素和去污劑[10]。GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455對(duì)應(yīng)于RA-GD菌株的RIA_1991-RIA_1992-RIA_1993，關(guān)于該外排泵的功能目前還未見(jiàn)報(bào)道。

GE296_RS01450基因位于RA-LZ01株基因組中的318 644—319 879 bp，讀碼框大小為1 236 bp，編碼411個(gè)氨基酸，在已發(fā)表的鴨疫里默氏桿菌基因組序列中高度保守，核苷酸序列相似性為95.93%～100%，氨基酸序列相似性為97.56%～100%。該基因編碼的產(chǎn)物標(biāo)注為GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455外排泵的外膜蛋白，預(yù)測(cè)介導(dǎo)金屬離子的外排。多種微量金屬元素，比如錳、鎳、銅、鈷、鋅、鐵等對(duì)于細(xì)菌的生命活動(dòng)至關(guān)重要，細(xì)菌中的多種酶類均需要不同的金屬離子作為輔因子，以維持細(xì)菌的正常生長(zhǎng)[11]。宿主通過(guò)降低金屬的有效性以及利用金屬元素的毒性是其控制自身被細(xì)菌感染的一種重要機(jī)制[12]；另一方面，細(xì)菌會(huì)通過(guò)各種途徑獲得維持自身生存的金屬元素，但過(guò)量的金屬離子會(huì)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生毒性，細(xì)菌必須通過(guò)多種調(diào)控機(jī)制維持金屬元素在體內(nèi)外的平衡[13]，其中細(xì)菌外排泵可發(fā)揮重要作用，比如大腸桿菌中外排銅和銀的RND外排泵CusCBA、外排鎳和鈷的RcnB外排泵等[14-15]。目前關(guān)于鴨疫里默氏桿菌中外排金屬離子的外排泵還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

鑒于基因組注釋中預(yù)測(cè)GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455外排泵介導(dǎo)金屬離子的外排，本研究通過(guò)構(gòu)建GE296_RS01450基因缺失株Δ1450和回復(fù)株cΔ1450，測(cè)定親本株RA-LZ01和缺失株Δ1450的生長(zhǎng)曲線、對(duì)抗菌素和重金屬的敏感性，以及GE296_RS01450基因在金屬離子刺激下的轉(zhuǎn)錄水平等試驗(yàn)，研究GE296_RS01450基因?qū)喴呃锬蠗U菌生長(zhǎng)能力的影響及其外排底物，重點(diǎn)驗(yàn)證該基因是否介導(dǎo)鴨疫里默氏桿菌對(duì)重金屬離子的外排，以期明確GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455外排泵是否外排重金屬離子，以拓展對(duì)鴨疫里默氏桿菌RND外排泵功能的理解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01(GenBank登錄號(hào)：NZ_CP045564.1)和LJW-2菌株、大腸桿菌ATCC25922、大腸桿菌X7213、自殺質(zhì)粒pRE112和穿梭質(zhì)粒pCPRA，均由本實(shí)驗(yàn)室保存，來(lái)源同文獻(xiàn)[5]；Trans-1感受態(tài)購(gòu)自北京全式金公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)購(gòu)自美國(guó) BD difcoTM公司，LB肉湯購(gòu)自英國(guó)Oxoid 公司，瓊脂粉購(gòu)自北京Solarbio公司，2,6-二氨基庚二酸(DPA)購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；抗生素購(gòu)自北京Solarbio公司，重金屬試劑購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，限制性內(nèi)切酶SacⅠ、SphⅠ、PstⅠ，T4連接酶，質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa 公司，細(xì)菌RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司，0.22 μm 無(wú)菌硝酸纖維素膜和過(guò)濾器購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司，SYBR qPCR Master Mix和HiScriptΙΙ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)購(gòu)自南京Vazyme生物科技有限公司。

1.1.3 主要設(shè)備 臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自Beckman公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó) Backman公司，PCR熱循環(huán)儀購(gòu)自杭州博日科技公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，搖床購(gòu)自上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司，凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 本研究中所用的引物見(jiàn)表1。

表1 PCR引物名稱和序列

1.2.2 構(gòu)建缺失株Δ1450 以親本株RA-LZ01株的基因組為模板，以1450-U-F/1450-U-R和1450-D-F/1450-D-R為引物擴(kuò)增GE296_RS01450基因的上游同源臂和下游同源臂；以菌株LJW-2基因組為模板，以Erm-F/Erm-R 為引物擴(kuò)增ermF抗性基因；通過(guò)重疊PCR將上游同源臂、ermF抗性基因和下游同源臂依次進(jìn)行融合，構(gòu)建打靶片段(該片段包括GE296_RS01450基因上游同源臂626 bp，ermF抗性基因801 bp以及下游同源臂626 bp)；用SacⅠ和SphⅠ酶將打靶片段克隆進(jìn)自殺質(zhì)粒pRE112，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌X7213化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含50 mg·L-1DPA、25 mg·L-1氯霉素的LB固體培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑單菌落接種至含50 mg·L-1DPA、25 mg·L-1氯霉素的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行增菌，隨后分別用引物1450-U-F/1450-D-R進(jìn)行PCR鑒定，并將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到的陽(yáng)性菌株即為供體菌，命名為X7213-pRE112-1450。

通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移和同源重組的方法構(gòu)建GE296_RS01450基因缺失株Δ1450。受體菌RA-LZ01和供體菌X7213-pRE112-1450分別培養(yǎng)至OD600 nm值約為1.0和0.6，分別取2 mL受體菌和4 mL供體菌，4 ℃ 6 000 r·min-1離心5 min，棄上清并收集菌體，用1 mL 0.01 mol·L-1的MgSO4重懸菌體，4 ℃ 6 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)3次，最后分別用500 μL的0.01 mol·L-1的MgSO4重懸后混勻，用無(wú)菌的0.22 μm的硝酸纖維素膜過(guò)濾，取下濾膜后，將無(wú)菌的一面貼于含50 mg·L-1DPA的TSA平板上，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，取下濾膜，用2 mL 0.01 mol·L-1MgSO4洗下濾膜上的菌苔，取200 μL 涂布在含2 mg·L-1紅霉素、5 mg·L-1多黏菌素B的TSA平板，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h， 挑取單克隆并在含2 mg·L-1紅霉素、5 mg·L-1多黏菌素B的TSB培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌，分別用鴨疫里默氏桿菌保守引物OmpA-F/OmpA-R、1450-U-F/1450-D-R、Erm-F/Erm-R、1450-800-F/1450-800-R進(jìn)行PCR鑒定，并將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到的陽(yáng)性菌株即為缺失株Δ1450。

1.2.3 構(gòu)建回復(fù)株cΔ1450 以親本株RA-LZ01基因組為模板，1450-F/1450-R為引物，擴(kuò)增GE296_RS01450基因；用PstⅠ和SphⅠ酶將目的基因克隆進(jìn)穿梭質(zhì)粒pCPRA，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)X7213化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含50 mg·L-1DPA、100 mg·L-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑單菌落進(jìn)行增菌，隨后用引物1450-F/1450-R進(jìn)行PCR鑒定，并將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到的陽(yáng)性菌株即為供體菌，命名為X7213-pCPRA-1450。

將缺失株Δ1450和供體菌X7213-pCP29-1450分別培養(yǎng)至OD600 nm值約為1.0和0.6，然后通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法將回復(fù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入缺失株，操作步驟如“1.2.2”。以含1 mg·L-1頭孢西丁的TSA平板進(jìn)行篩選，挑取單菌落進(jìn)行增菌，分別以O(shè)mpA-F/OmpA-R、1450-F/1450-R為引物進(jìn)行PCR鑒定，并將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到的陽(yáng)性菌株即為回復(fù)株cΔ1450。

1.2.4 菌株CFU和生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將親本株和缺失株分別增菌至OD600 nm約為1.0，以10倍稀釋至10-7、10-8、10-9三個(gè)濃度梯度，取100 μL分別涂布在TSA平板，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)至單菌落長(zhǎng)出，計(jì)算每個(gè)菌株的菌落形成單位(CFU)。

調(diào)整每個(gè)菌株的起始濃度均為109CFU·mL-1。以1∶100的比例分別接種至10 mL TSB中，每個(gè)菌株的接種量均為108CFU。將培養(yǎng)物以37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)，每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其OD600 nm值，共測(cè)定12 h。每個(gè)菌株做3組平行試驗(yàn)[16-17]。

1.2.6 菌株對(duì)重金屬離子的敏感性試驗(yàn) 將經(jīng)121 ℃ 20 min高壓的TSA培養(yǎng)基冷卻至40 ℃左右，分別加入AgCl、 ZnSO4、BaSO4、FeSO4、MnCl2、CuSO4、NiCl2、CoCl2、CaCl2、MgSO4共10種重金屬試劑，分別配制成含不同濃度金屬離子的培養(yǎng)板，各金屬離子的濃度如下：AgCl(1.46～0.21 mmol·L-1)；ZnSO4(0.70～0.11 mmol·L-1)；BaSO4(0.86～0.13 mmol·L-1)；FeSO4(1.32～0.16 mmol·L-1)；MnCl2(1.59～0.24 mmol·L-1)；CuSO4(0.80～0.12 mmol·L-1)；NiCl2(1.54～0.23 mmol·L-1)；CoCl2(0.84～0.13 mmol·L-1)； CaCl2(1.80～0.18 mmol·L-1)；MgSO4(1.66～0.17 mmol·L-1)，將新鮮菌液以1∶100比例重新轉(zhuǎn)接后，增菌至OD600 nm約1.0，10倍稀釋至10 CFU·mL-1，取106～10 CFU·mL-1的菌液，每個(gè)菌液樣本取5 μL進(jìn)行點(diǎn)板，將培養(yǎng)板在含5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 為了確定在不同重金屬離子的刺激下，GE296_RS01450基因的轉(zhuǎn)錄水平，將親本株分別在含CoCl2(0.42 mmol·L-1)，NiCl2(1.45 mmol·L-1)和MnCl2(1.59 mmol·L-1)的TSB中培養(yǎng)至OD600 nm約為1.0，用細(xì)菌RNA提取試劑盒提取總RNA, 然后用gDNA wiper 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板備用。qRT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s 預(yù)變性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，熔解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以特異性引物GAPDH-F/GADPH-R、q1450-F/q1450-R分別擴(kuò)增GAPDH和GE296_RS01450基因，其中GADPH基因作為內(nèi)參。通過(guò)2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量，并進(jìn)行差異性分析。*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001，NS示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 缺失株Δ1450和回復(fù)株cΔ1450的構(gòu)建

以引物OmpA-F/OmpA-R、Erm-F/Erm-R、1450-U-F/1450-D-R、1450-800-F/1450-800-R對(duì)缺失株進(jìn)行PCR鑒定，前三對(duì)引物擴(kuò)增出目的條帶，同時(shí)第四對(duì)引物擴(kuò)增不出目的條帶即為缺失株(圖1A)。將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序，證實(shí)GE296_RS01450基因缺失株Δ1450構(gòu)建成功。

A. 缺失株Δ1450的鑒定[M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. OmpA基因擴(kuò)增(1 156 bp)；2. ErmF基因擴(kuò)增(801 bp)；3. GE296_RS01450基因上游同源臂、ErmF基因和下游同源臂片段擴(kuò)增(2 053 bp)；4. GE296_RS01450基因擴(kuò)增(800 bp)]；B. 回復(fù)株cΔ1450的鑒定[M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.OmpA基因擴(kuò)增(1 156 bp)；2.GE296_RS01450基因擴(kuò)增(1 236 bp)]A. Identification of the deletion strain Δ1450 (M. DL2000 DNA marker; 1. OmpA gene (1 156 bp) amplification; 2. ErmF gene (801 bp) amplification; 3. DNA fragment (2 053 bp) including upstream homology arm, ErmF gene and downstream homology arm of GE296_RS01450; 4. GE296_RS01450 gene (800 bp) amplification); B. Identification of the complemented strain cΔ1450 (M. DL2000 DNA marker；1. OmpA gene (1 156 bp) amplification; 2. GE296_RS01450 gene (1 236 bp) amplification)圖1 缺失株Δ1450和回復(fù)株cΔ1450的鑒定Fig.1 Identification of the deletion mutant Δ1450 and complemented strain cΔ1450

以引物OmpA-F/OmpA-R、1450-F/1450-R對(duì)回復(fù)株進(jìn)行PCR鑒定，兩對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增出目的片段即為回復(fù)株(圖1B)。將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序，證實(shí)基因回復(fù)株cΔ1450構(gòu)建成功。

2.2 菌株CFU和生長(zhǎng)曲線

為證明GE296_RS01450基因的缺失是否影響菌株的生長(zhǎng)速率，測(cè)定了親本株RA-LZ01和缺失株Δ1450的CFU和生長(zhǎng)速率。經(jīng)過(guò)測(cè)定親本株 RA-LZ01為9.76×1010CFU·mL-1；缺失株Δ1450為1.963×1010CFU·mL-1。與親本株RA-LZ01相比，缺失株Δ1450的生長(zhǎng)速率并未發(fā)生明顯變化(圖2)。

圖2 親本株RA-LZ01和缺失株Δ1450的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of wild strain RA-LZ01 and deletion strain Δ1450

2.3 藥敏試驗(yàn)

通過(guò)測(cè)定親本株RA-LZ01和缺失株Δ1450對(duì)11類共27種抗菌素的MIC值，結(jié)果表明與親本株RA-LZ01相比，抗菌素對(duì)Δ1450的MIC值并未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明GE296_RS01450基因不介導(dǎo)菌株對(duì)抗菌素的耐藥。

2.4 菌株對(duì)重金屬的敏感性

重金屬離子點(diǎn)板試驗(yàn)結(jié)果顯示，與親本株RA-LZ01相比，缺失株Δ1450對(duì)CuSO4、ZnSO4、AgCl、BaSO4、FeSO4、CaCl2、MgSO4的耐受性均沒(méi)有發(fā)生改變，但對(duì)MnCl2、NiCl2和CoCl2的敏感性顯著升高；回復(fù)株cΔ1450部分回復(fù)了對(duì)MnCl2、NiCl2和CoCl2的耐受。該結(jié)果說(shuō)明GE296_RS01450基因介導(dǎo)菌株RA-LZ01對(duì)重金屬M(fèi)n、Ni和Co的耐受(圖3)。

圖3 菌株對(duì)重金屬離子的敏感性Fig.3 Sensitivity of the strains to heavy metal ions

2.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)在NiCl2和MnCl2的作用下，親本株RA-LZ01中GE296_RS01450基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分別提高了37倍和20倍，但在CoCl2的作用下，GE296_RS01450基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化(圖4A)；然而，在NiCl2、MnCl2和CoCl2作用下，回復(fù)株cΔ1450中GE296_RS01450基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)明顯變化(圖4B)。

3 討 論

迄今為止，由鴨疫里默氏桿菌引起的鴨漿膜炎是造成養(yǎng)禽業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失，制約養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要傳染病。該病的發(fā)生具有明顯的季節(jié)性，一般在春夏、秋冬交替的時(shí)節(jié)多發(fā)，臨床上主要表現(xiàn)為精神沉郁、眼和鼻分泌物增多、下痢、共濟(jì)失調(diào)和生長(zhǎng)率下降。其死亡率高達(dá)80%[20-21]。在生產(chǎn)生活中一般通過(guò)抗菌素對(duì)該病進(jìn)行預(yù)防和治療，但由于長(zhǎng)時(shí)間使用抗菌素，導(dǎo)致鴨疫里默氏桿菌在抗菌素的壓力下，產(chǎn)生的耐藥菌株逐漸增多，并產(chǎn)生多重耐藥性(MDR)，使得現(xiàn)有的抗菌素對(duì)于菌株的影響逐漸減小，因此，對(duì)細(xì)菌的外排耐藥機(jī)制進(jìn)行研究更加有利于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行防控。

在構(gòu)成生命體必需元素中，微量金屬元素雖然只占人體質(zhì)量的 0.05%，但在生命活動(dòng)過(guò)程中具有極其重要的作用。它們是多種金屬蛋白/金屬酶的活性中心。金屬蛋白和金屬酶的作用涉及到了內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、電子傳遞、生物能的產(chǎn)生、基本生物分子的合成、生物物質(zhì)的傳輸、氧化應(yīng)激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控、物質(zhì)/能量代謝調(diào)控和藥物代謝等各個(gè)方面[22]。細(xì)胞內(nèi)金屬離子的傳遞、代謝、穩(wěn)態(tài)平衡的失調(diào)，是導(dǎo)致多種疾病的關(guān)鍵因素[23]。錳(Mn)、鎳(Ni)和鈷(Co)離子都是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中必不可少的微量重金屬離子，但其過(guò)量的存在對(duì)于細(xì)胞又具有毒性作用，因此維持細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)重金屬離子的穩(wěn)態(tài)是重金屬外排泵的存在意義[24]。除了通過(guò)抗生素對(duì)鴨疫里默氏桿菌進(jìn)行防控外，還可以通過(guò)重金屬進(jìn)行防控。

RND外排泵具有廣泛的底物譜，最常見(jiàn)的底物為抗生素。目前為止，關(guān)于鴨疫里默氏桿菌外排泵的研究已有報(bào)道，如鴨疫里默氏桿菌CH-1菌株的RND外排泵基因B739_0873參與該菌對(duì)氨基糖苷類抗生素及去污劑的耐藥性，該基因的缺失導(dǎo)致其耐藥性降低[21]；鴨疫里默氏桿菌RA-GD菌株的ABC外排泵基因RIA-1614基因編碼的RanB蛋白介導(dǎo)其對(duì)氨基糖苷類抗生素和有機(jī)溶劑的耐受性，該基因的缺失導(dǎo)致其對(duì)阿米卡星、鏈霉素和幾種有機(jī)溶劑的敏感性上升[25]；鴨疫里默氏桿菌CH3菌株的M949_0459基因決定著該菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥性，該基因的缺失導(dǎo)致其對(duì)替加環(huán)素的耐藥性降低[26]；鴨疫里默氏桿菌RA-GD菌株的RND外排泵RaeE-RaeF-RopN介菌株RA-GD對(duì)阿米卡星、鏈霉素和SDS的耐藥性并且與其生長(zhǎng)速率有關(guān)，該系統(tǒng)的缺失導(dǎo)致其耐藥性和生長(zhǎng)速率降低[9]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本研究首先驗(yàn)證作為RND外排泵外膜蛋白組分的GE296_RS01450是否介導(dǎo)抗生素的外排。通過(guò)測(cè)定11類共27種抗菌素的MIC值，結(jié)果表明，GE296_RS01450滅活后，各種抗菌素對(duì)菌株的MIC值并無(wú)差異，說(shuō)明該基因與抗菌素的外排無(wú)關(guān)。

A.RAΔLZ01; B.cΔ1450圖4 親本株RAΔLZ01和回復(fù)株cΔ1450在重金屬離子作用下GE296_RS01450基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 The relative transcriptional levels of GE296_RS01450 gene of parental strain RA-LZ01 and complemented strain cΔ1450 treated with heavy metal ions

盡管許多RND系統(tǒng)研究結(jié)果表明該系統(tǒng)與抗菌素的耐藥性有關(guān)，但目前的研究結(jié)果也表明該系統(tǒng)還涉及許多的表型，包括新陳代謝，生物膜生成，鐵的獲取和毒力等。本研究通過(guò)測(cè)定親本株和缺失株的生長(zhǎng)曲線與CFU值發(fā)現(xiàn)，GE296_RS01450基因并不介導(dǎo)RA-LZ01菌株對(duì)抗菌素的耐受性，也與其生長(zhǎng)能力無(wú)關(guān)。

目前對(duì)于重金屬離子RND外排泵的研究較少，主要有大腸桿菌中能夠有效排出細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中的銅(Cu)和銀(Ag)離子的CusCBA外排泵和能同時(shí)外排鎳(Ni)和鈷(Co)離子的RcnB外排泵[15]；耐重金屬根瘤菌中能夠有效結(jié)合鋅并排出鋅(Zn)離子的ZneA外排泵[27]；銅綠假單胞菌中能夠排出細(xì)胞周質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鋅(Zn)、鎘(Cd)和鈷(Co)離子的CzcCBA外排系統(tǒng)等[12]。但目前有關(guān)鴨疫里默氏桿菌外排重金屬離子的外排泵還未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01菌株中的GE296_RS01450基因的缺失導(dǎo)致其對(duì)于重金屬離子Ni、Mn和Co的耐受性顯著下降，說(shuō)明該基因在RA-LZ01菌株外排重金屬離子Ni、Mn和Co的過(guò)程中發(fā)揮作用。

RND外排泵的底物通常情況下可以誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，如鏈霉素和SDS使RaeE-RaeF-RopN外排泵的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[22]，因此本研究應(yīng)用qPCR驗(yàn)證了MnCl2、NiCl2和CoCl2是否為GE296_RS01450基因的誘導(dǎo)底物。結(jié)果顯示，在MnCl2和NiCl2作用下，親本株中GE296_RS01450基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，但CoCl2并沒(méi)有刺激該基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯變化，可能RA-LZ01菌株中還存在其他調(diào)控CoCl2平衡的機(jī)制。然而，在NiCl2、MnCl2和CoCl2作用下，回復(fù)株cΔ1450中GE296_RS01450基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)明顯變化，出現(xiàn)該結(jié)果可能與RND外排泵相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受到多種調(diào)控因子的調(diào)控有關(guān)，比如激活因子、抑制因子、雙組分系統(tǒng)等；外排泵的底物可與相關(guān)調(diào)控蛋白結(jié)合，從而誘導(dǎo)外排泵相關(guān)基因的表達(dá)[28]。親本株中GE296_RS01450基因是天然狀態(tài)，在底物存在的情況下可被其調(diào)控因子進(jìn)行調(diào)控，而回復(fù)株中GE296_RS01450基因位于回復(fù)質(zhì)粒pCRRA中，脫離了整體調(diào)控環(huán)境，不能被底物誘導(dǎo)發(fā)生高水平轉(zhuǎn)錄。對(duì)于GE296_RS01450基因所受到的調(diào)控機(jī)制還需要深入研究。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建GE296_RS01450基因缺失株Δ1450和回復(fù)株cΔ1450，證實(shí)該基因不參與菌株生長(zhǎng)及菌株對(duì)抗生素(本研究中測(cè)定的抗菌素)的外排，可介導(dǎo)菌株對(duì)重金屬離子Ni、Mn和Co的外排。鑒于前期研究中已將鴨疫里默氏桿菌的其他兩個(gè)RND外排泵命名為RaeC-RaeA-RaeB和RaeE-RaeF-RopN，我們將GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01455外排泵命名為RaeX-RaeY-RopM，其中GE296_RS01445、GE296_RS01450和GE296_RS01455分別對(duì)應(yīng)于外排泵RaeY、外膜蛋白R(shí)opM和周質(zhì)蛋白R(shí)aeX。