檜烯抗弓形蟲活性的體外評價

邱燕華，翟斌濤，尚小飛，周緒正，李 冰，張繼瑜

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

弓形蟲病是由弓形蟲引起的一種重要的人獸共患寄生蟲病，弓形蟲(Toxoplasmagondii)能感染包括人在內(nèi)的所有溫血動物，甚至包括一些冷血動物，并且能寄生于動物機體的所有有核細胞內(nèi)[1-3]。弓形蟲病不僅嚴重影響人類的健康，還造成了巨大的經(jīng)濟損失。當(dāng)前對于弓形蟲病的治療主要依賴基于乙胺嘧啶的化學(xué)療法，該方法雖然可以有效地控制弓形蟲的急性感染，但普遍存在毒副作用大、治療周期長、易復(fù)發(fā)和對弓形蟲組織包囊缺乏療效等缺點[4-5]。因此，篩選和研發(fā)出安全且高效的抗弓形蟲藥物任重而道遠。萜類化合物作為天然產(chǎn)物中最多的一部分，已發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性，其中包括抗弓形蟲作用，比如青蒿素、熊果酸、百里酚和穿心蓮內(nèi)酯等在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出了良好的抗弓形蟲活性[6-9]。本試驗選擇了26個萜類化合物進行抗弓形蟲活性的篩選，并對篩選出的化合物檜烯進行了一系列體外活性評價。檜烯是一種單萜類化合物，已作為香料添加劑使用，正在探索作為下一代飛機燃料的成分[10]。目前已知檜烯具有多種生物活性，但對弓形蟲的研究未見報道，本研究對其作為抗弓形蟲先導(dǎo)化合物具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和弓形蟲 非洲綠猴腎細胞(Vero)購自中國科學(xué)院細胞庫；弓形蟲RH-2F購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)；弓形蟲Ⅰ型蟲株RH和Ⅱ型蟲株P(guān)ru速殖子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，其中RH-2F是表達了β-半乳糖苷酶的弓形蟲RH株，Ⅰ型蟲株RH是強毒株，致死率較高，一般發(fā)生急性感染；而Ⅱ型Pru是弱毒株，毒力相對較弱，一般經(jīng)過急性感染期后在組織內(nèi)形成包囊而轉(zhuǎn)為慢性感染。

1.1.2 藥物與試劑 26個萜類化合物購自源葉、麥克林和邁瑞爾等多家公司。CCK-8試劑購自MCE公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)以及雙抗等添加劑均購自英濰捷基公司。臺盼藍染色液購自索萊寶公司，Beta-Glo?檢測試劑購自普洛麥格公司，所有抗體均購自Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和弓形蟲的培養(yǎng)與純化

Vero細胞培養(yǎng)于含10% FBS、1% NEAA、1% Glutamax、1% Sodium pyruvate和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中。3種蟲株用含3%FBS的DMEM培養(yǎng)基于Vero細胞中培養(yǎng)和傳代。弓形蟲多數(shù)溢出細胞時用細胞刮把細胞刮下，27 G 針頭反復(fù)抽吸兩次，200×g離心5 min后，用5 μm孔徑的濾膜過濾上清，1 500×g離心10 min，獲得純化后的速殖子，速殖子用培養(yǎng)基重懸，臺盼藍染色，血細胞計數(shù)板計數(shù)后用于后續(xù)試驗與傳代[11]。

1.3 萜類化合物活性的初步篩選

26種萜類化合物(表1)用DMSO溶解成20 mg·mL-1的原液待用。RH速殖子3×105個·mL-1接種于有單層Vero細胞的12孔板中，8 h后試驗組分別加入用培養(yǎng)基配制的高(40 μg·mL-1)、 低(5 μg·mL-1)兩個濃度的不同化合物孵育。對照組僅感染RH但未做其他處理，用只含細胞和培養(yǎng)基的孔作為空白組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，分別于24、48和72 h時于倒置顯微鏡下觀察。按與對照組相比視野中弓形蟲數(shù)量減少60%以上的標準初步篩選出活性化合物。

1.4 活性化合物的細胞毒性檢測

對于初步篩選得到的活性化合物，采用CCK-8法測定其對Vero細胞的毒性。Vero細胞1×105個·mL-1， 接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后，加入各濃度的化合物。以未加化合物的孔為對照組，只含培養(yǎng)基的孔為空白組。培養(yǎng)24 h后加入CCK-8試劑，作用1～2 h后于酶標儀內(nèi)測定各孔D450 nm值，獨立的試驗重復(fù)3次。用Graph Pad Prism 8.3繪圖并計算95%的細胞存活率，以此作為化合物對Vero細胞的最大安全濃度[12]。

1.5 活性化合物對弓形蟲增殖的影響

12孔板的單層細胞中加入濃度為2×105個·mL-1的RH速殖子。入侵8 h后加入各濃度為安全濃度的活性化合物孵育，并以0.25% DMSO為對照組，分別于培養(yǎng)24、48和72 h時Giemsa染色觀察結(jié)果[13]。

1.6 檜烯對RH-2F的抑制作用

用表達β-半乳糖苷酶的弓形蟲RH-2F株用于生長抑制測定[14]。從Vero細胞中收獲新鮮活力強的RH-2F速殖子，調(diào)整RH-2F的濃度為1×105個·mL-1。 以此配制各濃度的檜烯，以0.25%DMSO為對照組，只含培養(yǎng)基的為空白組。培養(yǎng)12 h后加入Beta-Glo?檢測試劑，作用30 min后于光度計中檢測發(fā)光值[15-16]。

1.7 檜烯對細胞內(nèi)RH的抗增殖作用

將1×105個·mL-1的RH速殖子接種于有單層Vero細胞的12孔板爬片中，入侵4 h后，加入檜烯作用24和48 h，0.25%DMSO為陰性對照組，10 μg·mL-1的乙胺嘧啶為陽性對照。用4%多聚甲醛固定，抗原修復(fù)，10%山羊血清封閉，0.2%Triton X-100通透，選擇用兔抗弓形蟲多克隆抗體對弓形蟲進行標記，二抗為山羊抗兔lgG H&L(Alexa Fluor?488)，DAPI染核[17]。染色封片后于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.8 檜烯對細胞內(nèi)Pru的抗增殖作用

1.8.1 Giemsa染色 6孔板的單層細胞中加入濃度為1.5×105個·mL-1的Pru速殖子。入侵12 h， 用DPBS洗去未入侵的速殖子，并加入濃度為80 μg·mL-1的檜烯，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照。分別于培養(yǎng)24和48 h時Giemsa染色觀察結(jié)果。

1.8.2 細胞免疫熒光 將1×105個·mL-1的Pru速殖子接種于12孔板中的單層Vero細胞的爬片中，入侵6 h后加入檜烯作用24 h，同時設(shè)置陽性對照和陰性對照。固定、封閉，通透和染色。小鼠抗弓形蟲單克隆抗體為一抗，二抗為山羊抗小鼠lgG H&L(Alexa Fluor?647)，DAPI染核。封片后于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.9 檜烯對RH的抗入侵作用

將含有各濃度檜烯的1×105個·mL-1的RH速殖子在培養(yǎng)箱中處理1 h后接種于單層Vero細胞中，0.25%DMSO為陰性對照組，10 μg·mL-1的乙胺嘧啶為陽性對照。入侵2 h后，盡量用PBS將未入侵的速殖子洗去。固定、抗原修復(fù)和封閉后用小鼠抗弓形蟲單克隆抗體對細胞外的弓形蟲進行標記，二抗為山羊抗小鼠lgG H&L(Alexa Fluor?647)。0.2%Triton X-100通透后選擇用兔抗弓形蟲多克隆抗體對細胞內(nèi)的弓形蟲進行標記，二抗為山羊抗兔lgG H&L(Alexa Fluor?488)，DAPI染核[18-19]。封片后于共聚焦顯微鏡下隨機選擇10個視野觀察拍照并計數(shù)。按公式入侵率(%)=試驗組細胞內(nèi)弓形蟲數(shù)/陰性對照組細胞內(nèi)弓形蟲數(shù)×100%計算。

1.10 結(jié)果統(tǒng)計及分析

用GraphPad Prism 8.3進行IC50的計算及繪圖，并檢驗(t檢驗)組間數(shù)據(jù)的顯著性，安全濃度于GraphPad官網(wǎng)計算。細胞免疫熒光圖片使用軟件ZEN 2.6進行處理。**.P<0.01、***.P<0.001和****.P<0.000 1都代表相同時間點試驗組與對照組比較存在極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 26個萜類化合物抗弓形蟲活性的初步篩選

26個萜類化合物以高濃度(40 μg·mL-1)和低濃度(5 μg·mL-1)兩個濃度進行初步篩選，與對照組相比視野中弓形蟲數(shù)量減少60%以上判定為有效。結(jié)果如表1，初步篩選出了檜烯、莪術(shù)烯和環(huán)黃芪醇3個活性化合物。

表1 萜類化合物初篩結(jié)果

2.2 活性化合物的細胞毒性

篩選得到的檜烯、莪術(shù)烯和環(huán)黃芪醇對Vero細胞的IC50分別為147.3、31.32和104.7 μg·mL-1(圖1)。 根據(jù)GraphPad Prism 8.3擬合的曲線斜率和IC50值計算出各個化合物對Vero細胞的最大安全濃度，檜烯、莪術(shù)烯和環(huán)黃芪醇的最大安全濃度依次為81.74、17.38 和50.15 μg·mL-1。選擇以檜烯80 μg·mL-1、莪術(shù)烯17 μg·mL-1和環(huán)黃芪醇50 μg·mL-1用于后續(xù)試驗。

圖1 活性化合物的細胞毒性Fig.1 Cytotoxicity of active compounds

2.3 活性化合物對弓形蟲增殖的影響

Giemsa染色分析發(fā)現(xiàn)莪術(shù)烯(17 μg·mL-1)、環(huán)黃芪醇(50 μg·mL-1)和檜烯(80 μg·mL-1)3個化合物中檜烯對弓形蟲的作用顯著，雖然在24和48 h時檜烯組仍然可觀察到少量的納蟲泡，但是72 h時檜烯組細胞中未觀察到納蟲泡和速殖子，而對照組中已無細胞結(jié)構(gòu)，視野中全是RH速殖子(圖2 A3)。莪術(shù)烯和環(huán)黃芪醇雖然可以抑制RH的增殖，但是在24、48 h時細胞中都存在納蟲泡或速殖子，72 h時速殖子已從細胞內(nèi)逸出，遍布細胞外(圖2)。

紅色箭頭所指為RH速殖子或納蟲泡，放大倍數(shù)為400×The red arrow points to Pru tachyzoites or parasitophorous vacuole, and the magnification is 400×圖2 萜類活性化合物對弓形蟲RH株增殖的影響Fig.2 Effect of terpenoid active compound on the proliferation of T. gondii RH strain

2.4 檜烯對RH-2F的抑制作用

檜烯對RH-2F的IC50為90.76 μg·mL-1，檜烯256 μg·mL-1作用12 h時RH-2F的存活率僅為16.87%。隨著劑量的遞減，存活率遞增，檜烯對RH-2F的作用呈劑量依賴性(圖3)。

圖3 檜烯對RH-2F的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of sabinene on RH-2F

2.5 檜烯對細胞內(nèi)RH的抗增殖作用

24 h時與DMSO組相比RH明顯減少，雖未見散在速殖子，但多見納蟲泡(圖4 B1)。48 h時與DMSO相比只有很少的RH速殖子，未觀察到納蟲泡(圖4 B2)。同乙胺嘧啶相比，檜烯雖然在24 h時活性更差，但在48 h時活性相當(dāng)(圖4)。

2.6 檜烯對細胞內(nèi)Pru的抗增殖作用

2.6.1 Giemsa染色觀察 24 h時Giemsa染色結(jié)果與DMSO相比檜烯組中弓形蟲明顯減少，但仍可見少量蟲體。48 h時乙胺嘧啶中可觀察到小的納蟲泡，但在檜烯中未發(fā)現(xiàn)，而此時DMSO視野中已被大大小小的納蟲泡和蟲體占據(jù)(圖5)。

2.6.2 細胞免疫熒光觀察 24 h時的細胞免疫熒光結(jié)果表明，檜烯對細胞內(nèi)的弓形蟲Ⅱ型蟲株P(guān)ru的抗增殖效果顯著，可以抑制Pru納蟲泡的形成。DMSO組中隨處可見納蟲泡，檜烯組視野中只有極少零星散在的Pru，與乙胺嘧啶相比數(shù)量和大小都小得多(圖6)。

2.7 檜烯對RH的入侵抑制作用

檜烯對RH具有極顯著的抗入侵作用(P<0.001)，并且呈劑量依賴性，40 μg·mL-1時入侵率為63.22%，120 μg·mL-1時入侵率為19.50%，都比陽性對照乙胺嘧啶(Pyr)的72.99%要低(圖7)。

3 討 論

弓形蟲病是世界上最具破壞性的人畜共患病之一，全球約有20億人感染[20]。因預(yù)防手段的有限，當(dāng)前對于弓形蟲病的措施主要是化學(xué)療法，但是當(dāng)前的治療藥物存在諸多缺陷[5]?；诏懺x和弓形蟲擁有共同的祖先和相似的生物學(xué)特性，治療弓形蟲病新藥的一個潛在來源就是重新利用針對瘧疾開發(fā)的藥物[21]。當(dāng)前已有很多研究表明，很多對瘧原蟲有效的化合物，同時也對弓形蟲有效，如磺胺嘧啶、乙胺嘧啶、青蒿素、本芴醇和阿托伐醌等化合物[21-24]。萜類化合物是天然產(chǎn)物中最大的一類，近期對于其在抗癌和抗真菌,尤其是抗瘧疾方面引起了廣泛的關(guān)注[25]。因此，本研究首先以高低兩個濃度從26個萜類化合物中初步篩選出了檜烯、莪術(shù)烯和環(huán)黃芪醇這3個具有抗弓形蟲活性的化合物。經(jīng)細胞毒性試驗確定3個化合物的安全濃度范圍，以安全濃度進行抗弓形蟲活性評價。3個化合物的細胞毒性都呈劑量依賴性，其中檜烯的細胞毒性最小，安全濃度范圍最廣，同時檜烯的抗弓形蟲活性最好。

藍色熒光為細胞核，綠色熒光為RH，放大倍數(shù)為400×The blue fluorescence is the nucleus, the green fluorescence is Pru, and the magnification is 400×圖4 檜烯對細胞內(nèi)弓形蟲RH株增殖的影響Fig.4 Effect of sabinene on the proliferation of intracellular T. gondii RH strain

檜烯是重要的天然雙環(huán)單萜，可以用作調(diào)味劑、香料添加劑、精細化學(xué)品和高級生物燃料，同時也具有抗真菌、抗炎和預(yù)防骨骼肌萎縮等生物活性[26-28]。雖然檜烯具有殺蟲作用，檜烯對赤擬谷盜(TriboliumcastaneumHerbst)和玉米象(Sitophiluszeamais)等昆蟲具有顯著的驅(qū)避作用和熏蒸毒性，但沒有關(guān)于檜烯對弓形蟲有活性的研究報道[29]。本研究通過Giemsa染色、細胞免疫熒光和生物化學(xué)發(fā)光等方法證明了檜烯對弓形蟲有顯著活性，但未對檜烯的抗弓形蟲作用機制進行探究。有研究表明檜烯是鼠傷寒沙門菌(SalmonellaTyphimurium)靶蛋白L-天冬酰胺酶的有效抑制劑，可以通過抑制L-天冬酰胺酶的活性對鼠傷寒沙門菌起作用[30]。L-天冬酰胺酶催化天冬酰胺水解為天冬氨酸和氨。另外，L-天冬酰胺酶參與氨基酸(如賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸)的生物合成[31]。除人類外，L-天冬酰胺酶存在于各種生物中，如動物、植物和各種微生物，其中就包括弓形蟲[32-33]。但檜烯是否是通過抑制L-天冬酰胺酶來抑制弓形蟲的增殖和入侵還未得知，有必要進行進一步的研究以闡明抑制機制。

紅色箭頭所指為Pru速殖子或納蟲泡，放大倍數(shù)為400×The red arrow points to Pru tachyzoites or parasitophorous vacuole, and the magnification is 400×圖5 檜烯對細胞內(nèi)弓形蟲Pru株增殖的影響(Giemsa染色)Fig.5 Effect of sabinene on the proliferation of intracellular T. gondii Pru strain(Giemsa staining)

藍色熒光為細胞核，紅色熒光為Pru，放大倍數(shù)為400×The blue fluorescence is the nucleus, the red fluorescence is Pru, and the magnification is 400×圖6 檜烯對細胞內(nèi)弓形蟲Pru株增殖的影響(細胞免疫熒光)Fig.6 Effect of sabinene on the proliferation of intracellular T. gondii Pru strain(cellular immunofluorescence)

**.P<0.01; ***.P<0.001; ****.P<0.000 1圖7 檜烯對RH的入侵抑制作用Fig.7 Inhibition effect of sabinene on RH invasion

4 結(jié) 論

從萜類化合物中篩選出了抗弓形蟲活性化合物檜烯，檜烯不僅對Vero細胞有較低的毒性，對弓形蟲的強毒Ⅰ型蟲株(RH)和弱毒Ⅱ型蟲株(Pru)都有顯著的抗增殖作用，而且對Ⅰ型蟲株(RH)的入侵有極顯著的抑制作用，檜烯可作為潛在的抗弓形蟲先導(dǎo)化合物。

致 謝

由衷地感謝原中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所朱興全研究員和賀君君博士饋贈的弓形蟲RH和Pru蟲株。