血栓分子標(biāo)志物在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的檢測(cè)及臨床意義

王玉虹，江秀娟，崔杰，姜俊峰，段赟

0 引言

淋巴瘤患者體內(nèi)凝血纖溶系統(tǒng)的激活影響疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后。彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）患者的血液表現(xiàn)為高凝和纖溶亢進(jìn)狀態(tài)，這種狀態(tài)會(huì)促進(jìn)和加速淋巴瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)[1]。近年來血栓分子標(biāo)志物檢測(cè)逐漸被臨床醫(yī)生重視，血栓分子標(biāo)志物是凝血纖溶指標(biāo)，不僅作為預(yù)判血栓潛在形成的早期指標(biāo)，其對(duì)腫瘤的療效評(píng)價(jià)、預(yù)后判斷亦有作用[2]。本研究對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行檢測(cè)分析，探討血栓分子標(biāo)志物在DLBCL檢測(cè)中的實(shí)際臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2019年8月至2020年10月期間在我院住院的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者60例血標(biāo)本，按WHO分類，免疫組織化學(xué)Hans法分型。其中男39例、女21例，中位年齡54.5（24～85）歲；未并發(fā)血栓37例、并發(fā)血栓23例；淋巴瘤初治組23例、緩解組24例、未緩解組13例；選取同期健康體檢者46例作為對(duì)照組，男29例、女17例，中位年齡53（28～82）歲。所有資料均完整可靠，取得受試者知情同意。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集

用含有0.3 ml 3.2%的枸櫞酸鈉真空采血管采集研究對(duì)象的清晨空腹靜脈血2.7 ml，1:9抗凝，采血后立即混勻，以1 500g離心15 min，分離血漿上機(jī)檢測(cè)。采集LDH靜脈血標(biāo)本3～5 ml于分離膠促凝真空采血管、離心，分離血清上機(jī)檢測(cè)。

1.3 試劑與儀器

HISCL5000全自動(dòng)免疫分析儀及配套試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品均購自日本Sysmex公司，離心機(jī)為湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品，羅氏Cobas 8000全自動(dòng)生化免疫分析系統(tǒng)購自德國羅氏Cobas公司。

1.4 檢測(cè)方法

血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）、纖溶酶-α2纖溶酶抑制劑復(fù)合物（PIC）、組織型纖溶酶原激活物-抑制劑-1復(fù)合物（t-PAIC）、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復(fù)合物（TAT）采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)，按照儀器說明書步驟操作，將試劑放置于儀器相應(yīng)位置，試驗(yàn)前先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以校準(zhǔn)品的發(fā)光強(qiáng)度為縱軸，濃度為橫軸，進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控檢測(cè)（室內(nèi)質(zhì)控品提前分裝好），室內(nèi)在控后，按照儀器的使用要求放置樣本檢測(cè)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出檢測(cè)項(xiàng)目濃度。乳酸脫氫酶（LDH）釆用羅氏Cobas 8000全自動(dòng)生化免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)，操作步驟按照儀器說明書，將試劑放置于儀器相應(yīng)位置；試驗(yàn)前先用羅氏生化多項(xiàng)校準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；復(fù)溶后的正常值質(zhì)控品、病理值質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控檢測(cè)；室內(nèi)在控后，按照儀器的使用要求放置樣本檢測(cè)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出LDH濃度。

1.5 隨訪

60例DLBCL患者均具有隨訪資料，無失訪，從初次確診時(shí)間開始隨訪到2020年10月29日，隨訪形式采取對(duì)患者和（或）家屬進(jìn)行出院患者微信群、住院就診、電話咨詢和門診復(fù)查的形式。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。血漿TM、PIC、TAT和t-PAIC水平在各組中的比較采用四分位數(shù)（P25，P50，P75）表示，組間比較采用方差分析，單因素及多因素Cox回歸模型分析影響預(yù)后的因素，TM、PIC、TAT和t-PAIC水平與LDH的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿TM、PIC、TAT和t-PAIC水平在各組中的比較

淋巴瘤組與健康對(duì)照組比較，淋巴瘤組中TM、PIC指標(biāo)明顯升高（P<0.05），見表1，TAT、t-PAIC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TM、PIC凝血、纖溶指標(biāo)升高并高于對(duì)照組，表明淋巴瘤患者凝血纖溶系統(tǒng)異常。初治組與緩解組之間比較，初治組TM、PIC明顯高于緩解組（P<0.05），TAT、t-PAIC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；初治組與未緩解組比較，TM、PIC、t-PAIC、TAT各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；未緩解組TM、PIC明顯高于緩解組（P<0.05），TAT、t-PAIC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2～4。淋巴瘤并發(fā)血栓組TM、PIC、TAT均明顯高于未并發(fā)血栓組（P<0.05），見表5，t-PAIC在兩組中比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 淋巴瘤組與健康對(duì)照組血栓分子標(biāo)志物比較Table 1 Comparison of thrombus molecular markers between lymphoma group and health control group

表2 初治組與緩解組血栓分子標(biāo)志物比較Table 2 Comparison of thrombus molecular markers between initial treatment and remission groups

表3 初治組與未緩解組血栓分子標(biāo)志物比較Table 3 Comparison of thrombus molecular markers between initial treatment and non-remission groups

表4 緩解組與未緩解組血栓分子標(biāo)志物比較Table 4 Comparison of thrombus molecular markers between remission and non-remission groups

表5 淋巴瘤并發(fā)血栓組與未并發(fā)血栓組血栓分子標(biāo)志物比較Table 5 Comparison of thrombus molecular markers between thrombus and non-thrombus groups

2.2 血栓分子標(biāo)志物對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后的影響

TM、PIC、TAT和t-PAIC水平與DLBCL患者預(yù)后關(guān)系分析顯示：?jiǎn)我蛩谻ox回歸分析TM，PIC均與DLBCL患者預(yù)后密切相關(guān)（P<0.05）。多因素Cox回歸分析顯示PIC是DLBCL患者的獨(dú)立預(yù)后因素（P<0.001），見表6。進(jìn)一步分析TM、PIC、TAT和t-PAIC水平與各組LDH預(yù)后指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示：血漿TM、PIC與淋巴瘤患者初治組、未緩解組的LDH存在正相關(guān)（r=0.625,r=0.517），見表7。

表6 單因素和多因素Cox回歸分析淋巴瘤患者的預(yù)后因素Table 6 Univariate and multivariate Cox regression analyses of prognostic factors for lymphoma patients

表7 血漿TM、PIC、TAT和t-PAIC與各組LDH的相關(guān)性Table 7 Correlation of TM,PIC,TAT and t-PAIC levels with LDH in different groups of lymphoma patients

2.3 隨訪結(jié)果

用假設(shè)檢驗(yàn)對(duì)隨訪結(jié)果中死亡組的血栓分子標(biāo)志物分析，結(jié)果示：死亡組中的TM、PIC、TAT和t-PAIC水平均高于生存組，其中死亡組中TM、PIC顯著增高（P<0.05），見表8。其中隨訪生存>60月5人，48～60月之間2人，36～48月之間0人，24～36月之間5人，12～24月之間17人，<12月31人；存活48人，死亡12人，其中死亡<12月7人，12～24月2人，>24月3人；Kaplan-Meier法估計(jì)患者生存率，2年累積生存率為68%，中位生存時(shí)間為66月。

表8 生存組與死亡組血栓分子標(biāo)志物比較Table 8 Comparison of thrombus molecular markers between survival and death groups

圖1 Kaplan-Meier分析彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的生存率Figure 1 Kaplan-Meier analysis of survival of DLBCL patients

3 討論

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma,NHL）中最常見的類型，在我國約占NHL45.8%[3]。DLBCL血栓的發(fā)生率為12.8%。原發(fā)縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生率約為37.5%，中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤患者形成血栓高達(dá)59.5%[4-5]。研究顯示，凝血纖溶系統(tǒng)改變，血栓形成可能是惡性淋巴瘤患者最早期的臨床表現(xiàn)[6]。血栓被認(rèn)為是DLBCL的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，尤其是在治療早期。血栓的形成參與了腫瘤進(jìn)展、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等機(jī)制[7]。陳文欣等[8]檢測(cè)呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)腫瘤患者血漿TM、TAT、t-PAIC、PIC水平，結(jié)果顯示，可作為疾病療效觀察和預(yù)后判斷指標(biāo)。常規(guī)凝血指標(biāo)PT、APTT、TT、FDP、D-Dimer等指標(biāo)，不能較早體現(xiàn)機(jī)體真實(shí)的凝血狀態(tài)，對(duì)潛在血栓形成尚缺乏早期、敏感、精確的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)；而TM、TAT、t-PAIC、PIC可從凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)和內(nèi)皮系統(tǒng)客觀評(píng)價(jià)，全面指導(dǎo)臨床預(yù)防與治療。

本研究結(jié)果表明，淋巴瘤患者體內(nèi)凝血系統(tǒng)被激活，可能是瘤細(xì)胞直接作用于腫瘤反應(yīng)性單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板的促凝作用。TM作為血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的凝血酶受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。瘤細(xì)胞導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，可致血中TM水平增高[9]。文獻(xiàn)報(bào)道，TM在肺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等組織中表達(dá)[10]。DLBCL具有高度侵襲性，除發(fā)生在淋巴結(jié)、淋巴組織外，結(jié)外組織常被浸潤(rùn)，使周圍血管、淋巴管甚至神經(jīng)受侵，致使DLBCL血漿中TM水平會(huì)有不同程度升高。研究顯示[11]，PIC可作為惡性腫瘤患者生存預(yù)測(cè)因子，且不受疾病類型、性別、年齡、腫瘤大小和存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素的干擾，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，淋巴瘤患者處于凝血激活狀態(tài)下，又繼發(fā)纖溶系統(tǒng)激活，纖溶系統(tǒng)激活在腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中起到一定作用。本研究初治組與未緩解組間比較，TM、PIC、t-PAIC、TAT各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明疾病初診與復(fù)發(fā)進(jìn)展這兩個(gè)階段，腫瘤負(fù)荷大，侵及范圍廣，指標(biāo)之間無顯著差異，與臨床實(shí)際觀察相符合，而緩解組TM、PIC指標(biāo)明顯低于初治組、未緩解組，表明經(jīng)治療后有效的患者，腫瘤縮小甚至完全代謝緩解，TM、PIC指標(biāo)下降，可間接作為評(píng)判療效指標(biāo)。鄒麗芳等[12]觀察44例血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者止凝血功能，發(fā)現(xiàn)TAT可作為血液系統(tǒng)惡性腫瘤的疾病進(jìn)展指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，各組TAT、t-PAIC指標(biāo)無顯著差異，與文獻(xiàn)報(bào)道[13]不相一致，分析原因，其一，可能受樣本量局限，TAT、t-PAIC需大量樣本來統(tǒng)計(jì)分析；其二，本研究檢測(cè)的是血漿標(biāo)本，并未檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞標(biāo)本，可能受一定因素影響。血漿TAT作為凝血酶早期形成的敏感分子標(biāo)志物[14]，可將TAT作為并發(fā)血栓的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。腫瘤生物惡性程度高，內(nèi)皮系統(tǒng)破壞程度亦高，過度活化凝血纖溶系統(tǒng)，形成血栓的風(fēng)險(xiǎn)高，而t-PAIC在其兩組中比較無差異，t-PAIC由組織型纖溶酶原激活物（t-PA）和纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）以1:1的形式結(jié)合而成，可早期反映纖溶系統(tǒng)的激活，淋巴瘤患者體內(nèi)處于高凝狀態(tài)，首先表現(xiàn)高凝，纖溶活性降低，故淋巴瘤并發(fā)早期血栓形成t-PAIC值可能不明顯，是造成本研究結(jié)果的可能原因，另外，t-PAIC檢測(cè)更適合用于直觀判斷凝血紊亂急性期的內(nèi)皮損傷、纖溶抑制狀況，且兩組間比較t-PAIC樣本量少。

乳酸脫氫酶作為國際淋巴瘤預(yù)后、IPI（NCCN-IPI）評(píng)分的一項(xiàng)重要指標(biāo)[15-16]，它能反映出腫瘤負(fù)荷大小，預(yù)后判斷指標(biāo)敏感。TM、PIC與LDH存在正相關(guān)，說明腫瘤負(fù)荷越大，LDH升高越明顯，TM、PIC指標(biāo)相應(yīng)越高，提示預(yù)后越差。

近來隨著對(duì)DLBCL基因分型、實(shí)驗(yàn)室標(biāo)志物的研究，如何更早期的識(shí)別出高?；颊卟⒂枰跃珳?zhǔn)防治來延長(zhǎng)患者生存時(shí)間成為熱點(diǎn)。通過對(duì)血栓分子標(biāo)志物在DLBCL中的檢測(cè)以及對(duì)預(yù)后相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血栓分子標(biāo)志物中TM、PIC對(duì)淋巴瘤的療效評(píng)判、預(yù)后評(píng)估均有實(shí)際臨床意義，同時(shí)可早期發(fā)現(xiàn)淋巴瘤并發(fā)潛在血栓，預(yù)防性抗凝治療，抗凝治療的同時(shí)亦具有抗腫瘤作用，進(jìn)而改善患者預(yù)后。它們有望成為預(yù)測(cè)DLBCL患者預(yù)后的有效、便捷、實(shí)用性標(biāo)志物，能更好地在臨床中推廣應(yīng)用。