PD-L1、PD-L2、CD30、CD23和BCL-6在原發(fā)縱隔大B細胞淋巴瘤診斷和預后評估中的應(yīng)用價值

袁婷，曹錚，劉秀云，鄭波，馮曉莉

0 引言

原發(fā)性縱隔大B 細胞淋巴瘤（primary mediastinal B-cell lymphoma,PMBL）是一種侵襲性B細胞淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma,NHL）的2%～3%，多見于3 0～4 0 歲女性[1]。盡管采用了免疫治療方案，10%～30%的PMBL患者仍有復發(fā)。難治性（relapsed/refractory,RR）疾病需要挽救治療，且效果并不令人滿意[2]。PMBL利用PD-1/PD-L軸抑制抗腫瘤反應(yīng)[3]，抗CD30單抗（brentuximab vedotin,BV）在CD30陽性PMBL患者中表現(xiàn)出較好的療效[4]。文獻報道60%～85%的PMBL表達CD23，而在非縱隔DLBCL和結(jié)外DLBCL中表達率較低[5]。GATA3是鑒別PMBL和縱隔經(jīng)典霍奇金淋巴瘤（classic Hodgkin’s lymphoma,CHL）的最有幫助的標志物[6]，BCL-2在靜息B細胞和T細胞上表達而在正常生發(fā)中心細胞上不表達，相反BCL-6在生發(fā)中心內(nèi)的B和CD4+T細胞中表達，MUM1/IRF4和CD138反映了生發(fā)中心內(nèi)B細胞成熟為漿細胞的最后步驟，但有關(guān)PMBL中的BCL-6和MUM1表達情況的研究還較少。與其他淋巴瘤不同，PMBL缺乏預后生物標志物，并且當非縱隔原發(fā)的非特指型彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,not otherwise specified,DLBCLNOS）累及縱隔時，臨床上很難與原發(fā)性縱隔大B細胞淋巴瘤進行區(qū)分，因此我們選取了非縱隔DLBCL-NOS作為對照組，運用免疫組織化學法對診斷為PMBL、DLBCL-NOS組織中的治療相關(guān)標志物PD-L1、PD-L2、CD30及CD23、BCL-2、BCL-6、MUM1、GATA3的表達進行檢測及分析，探討上述8種蛋白在PMBL診斷和預后評估中的應(yīng)用價值，尋求更具特異性的免疫組織化學指標，提高對該病的診斷，以期為判斷PMBL預后提供理論參考進而指導臨床個體化治療。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2000—2019年中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院病理科確診的34例PMBL，對照組為隨機抽取的同期31例非縱隔原發(fā)的DLBCL-NOS，取材涵蓋了常見發(fā)病部位。34例PMBL患者有完整的隨訪資料，所有切片均由兩位有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)師獨立閱片，病理診斷依據(jù)WHO標準（2017版），結(jié)合臨床特點、組織學形態(tài)、免疫表型及分子診斷，均已明確診斷。本研究所有患者均知情同意。

1.2 病理形態(tài)學觀察及分級

1.2.1 制備組織切片 34例PMBL和31例DLBCLNOS的腫瘤組織用4%的中性甲醛固定4～6 h，取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm的組織塊，5～10倍固定液中固定3～24 h，脫水、過夜（水洗、脫水、透明、浸蠟），石蠟包埋，切片厚度為3～5 μm，烘烤。

1.2.2 免疫組織化學染色 采用4 μm厚FFPE組織切片進行免疫組織化學染色，免疫組織化學采用EnVision法。切片經(jīng)過脫蠟、水化、抗原修復后滴加一抗，主要一抗為PD-L1、PD-L2、CD30、CD23、GATA3、BCL-2、BCL-6和MUM1，一抗來源及陽性表達部位見表1。按廠家說明書操作，溫浴30～60 min后滴加二抗，DAB顯色，蘇木精對比染色，常規(guī)脫水、透明、封片。染色時每批均包括陰性對照和陽性對照。

表1 免疫組織化學檢測一抗來源及其染色部位Table 1 Source and staining site of immunohistochemical antibody

1.2.3 結(jié)果判讀 PD-L1和PD-L2細胞膜染色腫瘤細胞的百分比，見表2。針對抗體CD23、CD30和GATA3，選取代表區(qū)域計數(shù)10個高倍視野下陽性腫瘤細胞占細胞總數(shù)的百分比，<10%陽性細胞判為陰性（-），陽性細胞數(shù)≥10%且染色弱陽性為（+），陽性細胞數(shù)≥10%且染色中等陽性為（++），陽性細胞數(shù)≥10%且染色強陽性為（+++），按照（+）（-）進行記錄并分析?？贵wBCL-2、BCL-6和MUM1的截斷值為30%[7]，結(jié)果記錄見表3。本研究中染色細胞百分率主要由兩位有經(jīng)驗的臨床病理專家評分，平均陽性細胞百分率用于分析，有爭議的病例由第三位臨床病理專家確認。標志物的診斷指標計算公式：敏感度=真陽性/（真陽性+假陰性），特異性=真陰性/（真陰性+假陽性），陽性預測值=真陽性/所有陽性，陰性預測值=真陰性/所有陰性。

1.3 隨訪

通過常規(guī)的復診或電話對患者進行回顧性隨訪。主要研究終點是總生存期（overall survival,OS），其定義為從最初確診到死亡或最后一次隨訪的時間（2020年11月）。記錄以下隨訪內(nèi)容：病程、治療和預后情況、隨訪結(jié)束時的狀況（死亡、存活或失訪）、死亡原因和存活時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學軟件SPSS20.0進行統(tǒng)計分析，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。各蛋白表達與PMBL和DLBCL-NOS患者臨床及病理因素的關(guān)系采用卡方檢驗；PD-L1、PD-L2和CD30在PMBL和DLBCL-NOS中的陽性腫瘤細胞百分比組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗；Kaplan-Meier法進行單變量生存分析并繪制生存曲線，Log rank檢驗比較生存差異。所有指標采用GraphPad Prism 8及SPSS20.0進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點

PMBL患者34例，其中男性19例（55.88%），女性15例（44.12%），中位年齡28歲（15～47歲）。隨機選擇非縱隔原發(fā)的DLBCL-NOS患者31例作為對照組，其中男20例（64.52%），女性11例（35.48%），中位年齡63歲（年齡17～84歲）。兩組年齡分布差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在PMBL組中，由縱隔壓迫引起的癥狀是最主要的癥狀，全部34例病例均有大小不等的縱隔腫塊。

2.2 PMBL病理特征

形態(tài)上PMBL腫瘤細胞彌漫分布，被纖細或粗大致密膠原分割，呈簇狀、巢團狀或結(jié)節(jié)狀排列。腫瘤細胞中等大或稍大，胞質(zhì)淡染，細胞核較圓或卵圓形，部分病例中可見Reed-Sternberg樣細胞，見圖1A、B。PMBL組織形態(tài)上與累及縱隔的DLBCL-NOS有重疊，見圖1C、D，鑒別診斷需要免疫組織化學標志物的輔助。PMBL組中進行Ki-67標記，陽性細胞比例為30%～80%，其中64.71%（22/34）的病例表達超過60%，DLBCLNOS組表達相似。

圖1 PMBL(A,B)與DLBCL-NOS(C,D)的HE染色 (A,C:×200;B,D:×400)Figure 1 HE staining of PMBL(A,B) and DLBCL-NOS (C,D) (A,C:×200;B,D:×400)

2.3 PMBL與DLBCL-NOS的免疫表型

PMBL組和非縱隔原發(fā)的DLBCL-NOS組中PD-L1、PD-L2、CD30、CD23、BCL-2、BCL-6、MUM1和GATA3的表達見圖2。PD-L1、PD-L2和CD30在PMBL組陽性腫瘤細胞百分比的中位數(shù)分別為70%（30%,90%）、25%（0,70%）和17.5%（0,60%），顯著高于DLBCL-NOS組，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見表2。PMBL組CD30陽性表達率為61.76%（21/34），DLBCL-NOS組為12.90%（4/31），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。與DLBCL-NOS組比較，CD30診斷PMBL的特異性為76.47%（13/17），陽性預測值為84%（21/25），陰性預測值為32.50%（13/40）。PMBL組CD23陽性率為76.47%（26/34），在DLBCL-NOS組中陽性表達率為9.68%（3/31），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。與DLBCL-NOS組比較，CD23診斷PMBL的特異性為72.73%（8/11），陽性預測值為89.66%（26/29），陰性預測值為22.22%（8/36）。GATA3（P=0.414）、BCL-2（P=0.480）、BCL-6（P=0.659）和MUM1（P=0.601）的表達在PMBL和DLBCL-NOS組之間差異均無統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 CD23、CD30、GATA3、BCL-2、BCL-6和MUM1蛋白在PMBL和DLBCL-NOS中的表達Table 3 Expression of CD23,CD30,GATA3,BCL-2,BCL-6 and MUM1 proteins in PMBL and DLBCL-NOS groups

圖2 CD23(A)、CD30(B)、GATA3(C)、BCL-2(D)、BCL-6(E)、MUM1(F)、PD-L1(G)和PD-L2(H)在PMBL中的陽性表達 (×200)Figure 2 Positive expression of CD23(A),CD30(B),GATA3(C),BCL-2(D),BCL-6(E),MUM1(F),PD-L1(G) and PD-L2(H) in PMBL group (×200)

表2 PD-L1、PD-L2和CD30蛋白在PMBL和DLBCL-NOS中的陽性腫瘤細胞百分比 [M (P25,P75),%]Table 2 Percentage of positive tumor cells with PD-L1,PD-L2 and CD30 expression in PMBL and DLBCL-NOS [M(P25,P75),%]

2.4 PMBL的隨訪與治療

PMBL組有完整隨訪資料的患者28例，失訪6例，隨訪率82.4%。死亡6例（6/28，21.43%），中位生存期為30.5月（4.2～166.1月），總體生存曲線見圖3。5例（5/28，17.86%）單純采用CHOP方案化療，16例（16/28，57.14%）常規(guī)化療結(jié)合利妥昔單抗，1例（1/28，3.57%）PD-1抑制劑聯(lián)合常規(guī)化療4周期后達到完全緩解（complete response,CR），13例（13/28，46.43%）接受過放射治療。伴有CD30或BCL-6表達的PMBL患者其生存曲線盡管P>0.05，但仍顯示出預后差的趨勢，見圖4。

圖3 原發(fā)性縱隔大B細胞淋巴瘤患者總體生存曲線Figure 3 Overall survival curve of patients with primary mediastinal large B-cell lymphoma

圖4 伴有CD30(A)或BCL-6(B)表達的PMBL患者的生存曲線Figure 4 Survival curves of PMBL patients with CD30(A)or BCL-6(B) expression

3 討論

原發(fā)性縱隔大B細胞淋巴瘤起源于胸腺髓質(zhì)B細胞，是一種發(fā)病率較低但并不罕見的淋巴造血系統(tǒng)疾病，男女比約為1:3。本研究結(jié)果顯示PMBL發(fā)病高峰年齡段為28歲左右，男女性別無差異，與既往文獻女性患者居多的特點有所不同，而DLBCL-NOS患者多集中于老年人。組織學上，PMBL的腫瘤細胞多呈透明細胞或R-S（Reed-Sternberg）樣細胞形態(tài)，且穿刺活檢標本易擠壓、固定不佳，致使難以識別而漏診誤診，免疫組織化學可以協(xié)助診斷。PMBL表達B細胞抗原（如CD20，CD79α）和B細胞轉(zhuǎn)錄因子（如PAX-5、BOB.1、Oct-2等），不表達表面免疫球蛋白（Ig）和κ、λ[8]。PMBL在形態(tài)學和細胞學上不同病例間具有較大的變異，CD30陽性率約為80%，個體差異較大且通常染色強度較弱，CD23陽性率約為70%，BCL-2陽性率約為55%～80%，BCL-6陽性率約為45%～100%[9]。免疫組織化學研究對于PMBL和DLBCL-NOS的鑒別診斷必不可少，在本研究中我們探討了治療相關(guān)標志物PD-L1、PD-L2、CD30及CD23、BCL-2、BCL-6、MUM1和GATA3在PMBL診斷和預后評估中的應(yīng)用價值，以期為判斷PMBL預后提供理論參考進而指導臨床的個體化治療。

PD-L1和PD-L2經(jīng)常由于特定的遺傳突變而過度表達。PD-L1的表達具有時空異質(zhì)性，PD-L1陰性腫瘤復發(fā)時可能變成PD-L1陽性腫瘤（反之亦然）。Ventana的sp263 PD-L1用于免疫組織化學檢測時，建議病理學家的報告結(jié)果包括陽性腫瘤細胞百分比。對于PD-L2蛋白到目前為止還沒有得到廣泛的研究。9p24.1染色體異常多見于PMBL，相比之下這種異常在DLBCL中很少見[10-12]。一些研究已經(jīng)表明，PD-L1位點的畸變是PMBL的一個特征，并且PD-L1的表達與9p24.1的擴增相關(guān)[13]。我們在PMBL中的研究結(jié)果表明，PD-L1和PD-L2在PMBL組的表達水平較高，與DLBCL-NOS組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），因此PD-L1和PD-L2免疫組織化學檢測可作為鑒別PMBL和DLBCLNOS的輔助實驗手段，有助于識別更多對免疫檢查點抑制劑有反應(yīng)的患者，但尚需進一步的前瞻性測試和驗證，以確定免疫檢查點抑制劑在淋巴瘤亞型中的療效?；贙EYNOTE-170研究，帕博利珠單抗獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration,FDA）復發(fā)/難治性（R/R）PMBL適應(yīng)證批準。KEYNOTE-170研究中，應(yīng)用帕博利珠單抗治療R/R PMBL，中位隨訪43.1月后，76%的患者治療反應(yīng)持續(xù)時間（duration of response,DOR）超過36月，36月無進展生存（progress free survival,PFS）率達34.2%。因此，帕博利珠單抗單藥治療R/R PMBL顯示出持久的抗腫瘤效應(yīng)且安全可控[3]。另外納武利尤單抗聯(lián)合CD30單抗治療R/R PMBL的Ⅱ期臨床研究也顯示出納武利尤單抗與維布妥昔單抗BV（brentuximab vedotin）的協(xié)同效應(yīng)，其可作為橋接治療方案[4]。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了PD-1/PD-L1軸在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫方面的重要性，以及在臨床實踐中靶向這一信號通路的好處。

CD30在臨床中是一個非常重要的指標，除了淋巴造血系統(tǒng)腫瘤，CD30在非淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中也可以表達。CD30能夠幫助鑒別多種淋巴腫瘤，如霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma,HL）、間變大細胞淋巴瘤（anaplastic cell lymphoma,ALCL）[14]。除此之外，CD30在一些T細胞淋巴瘤和B細胞淋巴瘤中都可以表達，但CD30的專一性、特異性不強，給淋巴瘤的病理診斷帶來困難，需要結(jié)合形態(tài)以及其他免疫組織化學標記進行診斷。PMBL腫瘤細胞存在CD30高表達，本組試驗結(jié)果亦顯示CD30表達在PMBL與DLBCL-NOS組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），因此治療相關(guān)標志物PD-L1、PD-L2和CD30均有助于區(qū)分PMBL與DLBCL-NOS。BV是一類CD30抗體偶聯(lián)藥物，可通過抑制微管蛋白合成和細胞分裂，誘導CD30陽性腫瘤細胞凋亡。BV聯(lián)合納武利尤單抗治療R/R PMBL顯現(xiàn)出良好的協(xié)同抗腫瘤活性，客觀緩解率（objective response rate,ORR）達73%，完全緩解（complete response,CR）率為37%[4]。CD23是一種低親和力的IgE受體，還可作為成熟濾泡B細胞、活化巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和濾泡樹突狀細胞上的淋巴細胞生長因子。CD23在PMBL中的表達率為70%～85%[5,15]，與本研究在PMBL中觀察到的76.47%相符。本研究表明CD23陽性有助于PMBL與DLBCL-NOS的鑒別診斷，與既往的結(jié)果[16]一致。PMBL的分子遺傳學特征中BCL-2和BCL-6基因重排少見，而有研究表明BCL-2表達是DLBCL的預后標志物[17]。MUM1/IRF4是干擾素和細胞因子介導基因表達的重要調(diào)節(jié)劑，在既往的研究中，MUM1與DLBCL的不良預后相關(guān)[18]，但本研究結(jié)果顯示MUM1表達對PMBL的總體生存無影響，可能與本研究隊列較小有關(guān)。CD30和BCL-6的預后價值值得下一步在更大的患者隊列中進行驗證。

綜上所述，PMBL是一種起源于胸腺的成熟的侵襲性大B細胞淋巴瘤，具有獨特的臨床、免疫表型、基因型和分子特征。PMBL中治療相關(guān)標志物PD-L1、PD-L2和CD30的表達水平較高，有助于識別更多可能對免疫或靶向治療有反應(yīng)的患者。免疫組織化學標記PD-L1、PD-L2、CD30和CD23有助于PMBL與DLBCL-NOS鑒別診斷，CD30和BCL-6在PMBL的預后方面顯示了一定的趨勢，但要作為PMBL的候選預后指標應(yīng)該在更大量的樣本中進一步研究。