黃樟素型沉水樟莖段組織培養(yǎng)研究黃樟素型沉水樟莖段組織培養(yǎng)研究

肖祖飛，魏 希，張北紅，王顏波，李 鳳，姜 睿，彭 藝，金志農(nóng)

(南昌工程學(xué)院，江西省樟樹繁育與開發(fā)利用工程研究中心 江西南昌 330099)

沉水樟 (Cinnamomummicranthum)為樟科樟屬常綠喬木，主要分布在浙江、江西、湖南、臺灣、廣西等省份[1]。沉水樟干形通直、高大雄偉、枝葉繁茂，是優(yōu)良的造林和綠化樹種。沉水樟木材紋理細(xì)致，具有芳香，是船舶、高檔家具等的原材料。沉水樟枝葉富含精油，枝葉精油主成分為黃樟素的為黃樟素型沉水樟(Cinnamomummicranthumct. safrole)，是重要的醫(yī)藥原料。由于長期對沉水樟資源的人為破壞，目前沉水樟處于瀕危狀態(tài)，為國家三級重點保護(hù)植物[2-3]。沉水樟的繁殖可采用種子繁殖、扦插和組織培養(yǎng)[4-6]。有研究表明，沉水樟雌雄花發(fā)育成熟期不一致，因而結(jié)實率很低、難以采集到種子，且種子空殼率高，種子繁殖困難[2]。扦插繁殖又因資源少，較難獲得穗條，且扦插成活率低，生根難等因素，制約沉水樟苗木的繁殖。組織培養(yǎng)具有操作簡單、繁殖速度快、不受季節(jié)影響、可周年生產(chǎn)、脫毒、保持木本優(yōu)良性狀等優(yōu)點，是苗木快繁的重要方式。目前，關(guān)于沉水樟的組織培養(yǎng)研究較少，翟曉巧等[7]以沉水樟幼嫩莖段為材料，篩選了IBA與BA、IAA與BA、NAA與BA對莖段芽誘導(dǎo)的影響；羅坤水等[6]對沉水樟莖段的初代、繼代和生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選；陳碧華等[8]在翟曉巧、羅坤水等研究基礎(chǔ)上對沉水樟莖段的初代、繼代、生根培養(yǎng)基進(jìn)行改良，同時研究了組培苗的移栽技術(shù)，為沉水樟的組織培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。本文以黃樟素型沉水樟一年生半木質(zhì)化枝條為材料，研究外植體的采集時間、消毒時間和生長調(diào)節(jié)劑對黃樟素型沉水樟莖段組織培養(yǎng)的影響，以期為黃樟素型沉水樟的苗木快繁提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為黃樟素型沉水樟2年生扦插苗一年生半木質(zhì)化枝條，剪切成帶1～2個芽的莖段(1.5～3 cm)，用自來水沖洗2 h，置于超凈工作臺，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3～5次，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的采集時間對黃樟素型沉水樟莖段組織培養(yǎng)的影響

分別在2020年5月、7月和9月份，利用上述處理好的外植體，用質(zhì)量濃度0.1%的升汞(HgCl2)消毒6 min，接種在MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L IBA培養(yǎng)基上，每瓶1個莖段，30瓶，3次生物重復(fù)。接種30 d，統(tǒng)計外植體的污染率、褐化率和萌芽率。

1.2.2 消毒時間對黃樟素型沉水樟莖段組織培養(yǎng)的影響

2020年5月中旬，利用上述處理好的外植體，用質(zhì)量濃度0.1%HgCl2消毒，消毒處理時間分別為3、5、7和9 min，之后接種在MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L IBA培養(yǎng)基上，每瓶1個莖段，30瓶，3次生物重復(fù)。接種30 d，統(tǒng)計莖段的污染率、褐化率和萌芽率。

1.2.3 生長調(diào)節(jié)劑對黃樟素型沉水樟莖段萌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

2020年5月中旬，利用上述處理好的外植體，用質(zhì)量濃度0.1%的HgCl2消毒6 min，分別接種到不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基：(1)MS + 0.15 mg/L IBA + 0.2 mg/L 6-BA，(2)MS + 0.15 mg/L IBA + 0.4 mg/L 6-BA，(3)MS + 0.15 mg/L IBA + 0.8 mg/L 6-BA，(4)MS + 0.15 mg/L IBA + 1.6 mg/L 6-BA，(5)MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.30 mg/L IBA，(6)MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.45 mg/L IBA，(7)MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.60 mg/L IBA。每個處理30瓶，每瓶1個莖段。接種30 d，統(tǒng)計莖段的萌芽率。

1.2.4 生長調(diào)節(jié)劑對黃樟素型沉水樟組培苗增殖培養(yǎng)的影響

將株高3～5 cm的無菌苗修剪成約1.5 cm長的莖段(至少帶有一葉一芽)，分別接種到不同增殖培養(yǎng)基：(1)MS + 0.10 mg/L IBA + 0.25 mg/L 6-BA，(2)MS + 0.10 mg/L IBA + 0.50 mg/L 6-BA，(3)MS + 0.10 mg/L IBA + 1.00 mg/L 6-BA，(4)MS + 0.10 mg/L IBA + 2.00 mg/L 6-BA，(5)MS + 1.00 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L IBA，(6)MS + 1.00 mg/L IBA + 0.20 mg/L 6-BA，(7)MS + 1.00 mg/L IBA + 0.40 mg/L 6-BA。每個處理20瓶，每瓶6～7個莖段。繼代培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計增殖芽數(shù)、株高、莖粗。

1.2.5 生長調(diào)節(jié)劑對黃樟素型沉水樟組培苗生根培養(yǎng)研究

挑選株高3～5 cm的無菌苗接種于生根培養(yǎng)基：(1)1/2 MS + 0.5 mg/L IBA，(2)1/2 MS + 1.0 mg/L IBA，(3)1/2 MS + 1.5 mg/L IBA，(4)1/2 MS + 2.0 mg/L IBA，(5)1/2 MS + 0.5 mg/L NAA，(6)1/2 MS + 1.0 mg/L NAA，(7)1/2 MS + 1.5 mg/L NAA，(8)1/2 MS + 2.0 mg/L NAA。每瓶接種7～10株，組培苗生根培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計生根率、根數(shù)、根長和根粗。

1.2.6 黃樟素型沉水樟生根苗的煉苗和移栽技術(shù)研究

生根培養(yǎng)11～15 d，將組培生根苗移至透光率25%～30%、溫度25～30 ℃的大棚內(nèi)煉苗7～10 d，將組培苗移出瓶外，用自來水清洗干凈生根苗根部培養(yǎng)基，待移栽。移栽前將生根苗用質(zhì)量濃度0.5%多菌靈消毒10～15 min，以紅壤土和草木灰(體積比5∶1)為基質(zhì)，之后移入裝滿基質(zhì)的無紡布袋中央，保持基質(zhì)濕潤，移栽兩個月后統(tǒng)計移栽成活率。

1.2.7 組培苗培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L、瓊脂粉7.0 g/L，生根培養(yǎng)添加2 g/L活性炭，pH5.8。組培苗培養(yǎng)條件為光照3000～5000 lx、白質(zhì)光、光照時間12 h/d、溫度(25 ± 2)℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與方法

株高、根長用米尺測量、根粗用游標(biāo)卡尺測定。采用Excel2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入、整理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的采集時間對黃樟素型沉水樟莖段組織培養(yǎng)的影響

由表1可知，外植體的污染率和褐化率隨采集時間的推后而顯著升高，萌芽率隨采集時間的推后顯著降低。5月份采集外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，外植體的萌芽率最高，為51.80%，而污染率和褐化率最低，分別為18.95%和9.62%。與5月份比較，9月份采集外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，外植體的污染率和褐化率分別提高了42.72%和10.55%，萌芽率降低了36.54%。

表1 外植體采集時間對黃樟素型沉水樟莖段培養(yǎng)的影響 %

2.2 消毒時間對黃樟素型沉水樟莖段組織培養(yǎng)的影響

由表2可知，外植體的污染率隨HgCl2的消毒時間的增加而降低，褐化率隨消毒時間的增加而逐漸升高，萌芽率隨消毒時間的增加而先升后降。消毒3 min，外植體的污染率達(dá)到62.81%，顯著高于消毒5、7、9 min，外植體的污染率最低的是消毒9 min。消毒9 min，外植體的褐化率達(dá)到58.15%，顯著高于消毒7、5、3 min；消毒3 min和5 min，外植體的褐化率低，分別為10.82%和15.33%。消毒5 min，外植體的萌芽率最高，為52.59%，顯著高于消毒3、7、9 min。因此，5月份采集黃樟素型沉水樟一年生半木質(zhì)化枝條，用質(zhì)量濃度0.1%HgCl2消毒，消毒最佳時間是5 min。

表2 消毒時間對黃樟素型沉水樟莖段培養(yǎng)的影響

2.3 生長調(diào)節(jié)劑對黃樟素型沉水樟莖段萌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

由表3可知，IBA濃度為0.15 mg/L時，莖段的萌芽率隨著6-BA濃度的增加呈先增后降的趨勢。當(dāng)6-BA濃度為0.8 mg/L時，莖段的萌芽率達(dá)到最高，為66.67%，莖段的萌芽率最低的是0.15 mg/L IBA處理，僅為16.67%。當(dāng)6-BA濃度為0.8 mg/L時，莖段的萌芽率隨著IBA濃度的升高而逐漸降低。0.15 mg/L IBA處理，莖段的萌芽率最高。因此，黃樟素型沉水樟莖段萌芽的最適培養(yǎng)基為MS + 0.8 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L IBA。

表3 生長調(diào)節(jié)劑配比對黃樟素型沉水樟莖段萌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

2.4 生長調(diào)節(jié)劑對黃樟素型沉水樟組培苗增殖培養(yǎng)的影響

由表4可知，當(dāng)IBA濃度為0.10 mg/L時，組培苗的增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加而先增后降。6-BA濃度為1.00 mg/L時，增殖系數(shù)最大，為3.94，與2.00 mg/L 6-BA處理差異不顯著，顯著高于0.50 mg/L和0.25 mg/L 6-BA處理。當(dāng)6-BA濃度為1.00 mg/L時，組培苗的增殖系數(shù)隨IBA濃度的增加而先增后降，IBA濃度為0.10 mg/L，增殖系數(shù)最大。IBA有利于組培苗株高的生長，組培苗的株高隨著IBA濃度的增加而逐漸增大。組培苗的莖粗受6-BA和IBA影響不明顯，各處理組培苗的莖粗差異不顯著。因此，黃樟素型沉水樟組培苗最適增殖培養(yǎng)基為MS + 1.00 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L IBA。

表4 生長調(diào)節(jié)劑配比對黃樟素型沉水樟組培苗增殖培養(yǎng)的影響

2.5 黃樟素型沉水樟組培苗生根研究

2.5.1 黃樟素型沉水樟組培苗生根過程基部形態(tài)變化

組培苗生根培養(yǎng)1～5 d，基部形態(tài)變化不明顯；生根培養(yǎng)7 d時，少部分組培苗基部膨大、切口愈合，有少量愈傷組織出現(xiàn)；生根培養(yǎng)9 d時，大部分組培苗基部膨大、切口愈合，部分組培苗基部有凸起點；生根培養(yǎng)11 d時，組培苗基部出現(xiàn)不定根(圖1)。

注：a、b、c、d、e、f圖分別為生根培養(yǎng)1、3、5、7、9和11 d。圖1 1.0 mg/L IBA誘導(dǎo)黃樟素型沉水樟組培苗生根過程

2.5.2 生長調(diào)節(jié)劑對黃樟素型沉水樟組培苗生根的影響

由表5可知，生根率隨IBA濃度的增加而先升后降。1.0 mg/L IBA處理時，組培苗的生根率最高，為79.33%，其次是1.5 mg/L IBA處理，二者之間差異不顯著，組培苗的生根率最低的是0.5 mg/L IBA處理。1.0 mg/L IBA處理時，組培苗的根數(shù)也最多，顯著高于其它處理，組培苗的根數(shù)最少的是0.5 mg/L IBA處理。1.5 mg/L IBA處理，組培苗的根長最大，其次是1.0 mg/L IBA處理，組培苗的根長最小的是0.5 mg/L IBA處理。IBA濃度對組培苗的根粗影響不明顯，各處理間組培苗的根粗差異不顯著。

表5 IBA對黃樟素型沉水樟組培苗生根的影響

由表6可知，NAA對黃樟素型沉水樟組培苗生根也有顯著的促進(jìn)作用，生根率隨NAA濃度的增加而先升后降。1.5 mg/L NAA處理時，組培苗的生根率最高，為81.60%，顯著高于0.5mg/L和 1.0 mg/L NAA處理，稍高于2.0 mg/L NAA處理。根數(shù)的變化趨勢與生根率相似，1.5 mg/L和2.0 mg/L NAA處理，組培苗的根數(shù)分別為3.17和3.06，二者差異不顯著，顯著高于0.5 mg/L和1.0 mg/L NAA處理。2.0 mg/L NAA處理，組培苗的根長最大，為5.42 cm，其次1.5 mg/L NAA處理，二者差異不顯著，顯著高于0.5 mg/L和1.0 mg/L NAA處理。NAA對組培苗的根粗影響不明顯，各處理間組培苗的根粗差異不顯著。綜合組培苗的生根率、根數(shù)、根長和根粗指標(biāo)，黃樟素型沉水樟組培苗生根最適培養(yǎng)基為1/2 MS + 1.5 mg/L NAA。

表6 NAA對黃樟素型沉水樟組培苗生根的影響

2.6 黃樟素型沉水樟生根苗的移栽和苗期管理

組培苗生根培養(yǎng)11～15 d，移至溫室大棚，控制棚內(nèi)溫度25～30 ℃、透光率20%～35%，煉苗7～10 d。將生根苗移出瓶外，清洗干凈生根苗根部的培養(yǎng)基。移栽前用質(zhì)量濃度0.5%多菌靈消毒10～15 min，之后將生根苗移入裝有基質(zhì)的無紡布袋，移栽后20 d 內(nèi)保持空氣濕度90%以上，基質(zhì)保持濕潤，見干即澆，每次要澆透，移栽成活率可達(dá)90%(圖2)。之后依據(jù)苗木長勢施用水肥，待苗木木質(zhì)化，株高20～30 cm，可將苗木移入大田定植。

圖2 黃樟素型沉水樟組培移栽苗

3 討論與結(jié)論

3.1 外植體的采集時間和消毒時間對黃樟素型沉水樟莖段組織培養(yǎng)的影響

不同時間采集外植體，外植體的生理狀態(tài)、組織幼嫩程度、內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)等差異較大，影響外植體的成活率。有研究表明，5月份采集猴樟一年生半木質(zhì)化枝條進(jìn)行莖段組織培養(yǎng)，莖段的萌芽率顯著高于7月份和9月份[9]，也有研究表明，2～3月份采集接種材料，外植體的污染率低，無菌活體獲得率高[10]。本研究表明，與7月和9月份相比較，5月份更適合采集黃樟素型沉水樟莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)。究其原因可能是因為5月份新抽枝條處于半木質(zhì)化狀態(tài)，組織幼嫩、生長旺盛、內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)豐富、新陳代謝旺盛、表面病菌少，因而外植體成活率高。

外植體消毒常用試劑有升汞、次氯酸鈉、酒精等，其中升汞消毒效果最好，一般使用質(zhì)量濃度為0.1%。外植體的消毒時間因不同植物、采集時間、采集部位等而異。消毒時間太短，外植體消毒不徹底，污染率高；消毒時間過長，容易殺死外植體細(xì)胞，導(dǎo)致褐化率提高，成活率降低。有研究表明，質(zhì)量濃度0.1%的升汞消毒7 min，香樟莖段的污染率較低，回綠時間較短，萌芽率高[11]。以體積分?jǐn)?shù)10%的84消毒液處理油樟莖段15 min或體積分?jǐn)?shù)15%的84消毒液處理油樟莖段10 min，油樟莖段的污染率小于15%，成活率大于70%[12]。本研究表明，5月份采集黃樟素型沉水樟半木質(zhì)帶芽莖段，用質(zhì)量濃度0.1%的HgCl2消毒5 min，莖段的污染率和褐化率較低，萌芽率最高，這可能是因為半木質(zhì)化枝條本身帶病菌少、容易消毒，半木質(zhì)化枝條組織幼嫩、細(xì)胞分裂能力強，容易成活。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對黃樟素型沉水樟莖段組織培養(yǎng)的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)過程發(fā)揮重要作用。有研究表明，細(xì)胞分裂素和生長素二者的濃度配比適當(dāng)?shù)那闆r下才能在樟樹莖段腋芽誘導(dǎo)、叢生芽的增殖、生根時獲得較好效果[13-14]。本研究表明，6-BA、IBA、6-BA/IBA在黃樟素型沉水樟莖段的萌芽、組培苗的增值和生根過程中起重要作用。在IBA濃度不變情況下，黃樟素型沉水樟莖段的萌芽率隨6-BA濃度的增加而先增后降；在6-BA濃度不變情況下，黃樟素型沉水樟莖段的萌芽率隨IBA濃度的增加而降低。黃樟素型沉水樟莖段的萌芽率隨6-BA/IBA的比值的升高而先升后降。6-BA和IBA的比值為1.33時，莖段的萌芽率僅為16.67%；6-BA和IBA的比值為5.33時，莖段的萌芽率達(dá)到最大，為66.67%，之后萌芽率降低。6-BA、IBA、6-BA/IBA對黃樟素型沉水樟組培苗的增殖影響與莖段萌芽率相似。6-BA和IBA的比值為10時，增殖系數(shù)最大，達(dá)到3.94。IBA和NAA對黃樟素型沉水樟組培苗的生根有顯著促進(jìn)作用，且NAA對組培苗的生根效果優(yōu)于IBA。組培苗生根培養(yǎng)11d，基部出現(xiàn)不定根，生根適宜培養(yǎng)基為1/2 MS + 1.5 mg/L NAA，生根率為81.60%。

3.3 黃樟素型沉水樟組培生根苗移栽和煉苗研究

組培苗的移栽成活率直接關(guān)系到組培技術(shù)是否成功。組培苗從培養(yǎng)室到外界，溫度、濕度、光照等發(fā)生較大變化，需在有條件設(shè)施的地方煉苗一段時間才能移栽。有研究表明，黃樟組培苗煉苗3～5 d，采用泥炭土和珍珠巖混合基質(zhì)，適當(dāng)遮光覆膜，黃樟組培苗移栽成活率高達(dá)85%[15]。沉水樟生根組培苗瓶內(nèi)煉苗20～30 d，莖干成深綠色，可移栽到瓶外，采用1/3 椰糠 + 2/3 泥炭土作基質(zhì)，移栽后25 d內(nèi)注意控制溫度和濕度，組培苗移栽成活率可達(dá)80%以上[6]。本研究表明，黃樟素型沉水樟組培苗生根培養(yǎng)11 ～15 d，將組培生根苗移至透光率25%～30%、溫度25～30 ℃的大棚內(nèi)煉苗7～10 d，可將生根組培苗移栽到瓶外，移栽20 d內(nèi)保持濕度90%以上，移栽成活率可達(dá)90%。待苗木莖木質(zhì)化，株高15～20 cm，可將苗木移入大田定植。