孫 菲, 蘇維瑋, 付艷華, 王經偉
山東大學齊魯醫(yī)院(青島) 肝病科, 山東 青島 266035
肝細胞癌(HCC)發(fā)病率高、預后差,是全球范圍內常見的消化系統惡性腫瘤。早期肝癌以手術切除為主,中晚期肝癌主要治療方式包括局部消融、經肝動脈栓塞化療、免疫及靶向治療等,但總體治療效果欠佳,我國肝癌患者5年存活率僅12.1%[1]。因此進一步研究原發(fā)性肝癌發(fā)病機制及尋找新的治療靶點顯得十分重要。Krüppel樣因子(Krüppel-like factors,KLFs)為鋅指蛋白類轉錄因子,目前,已鑒定包含17個人類KLFs成員。KLF4是KLFs家族重要成員之一,屬于C2H2型鋅指蛋白,參與調控細胞周期、炎癥反應以及細胞增殖、凋亡,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,在誘導干細胞分化、胚胎發(fā)育及調控上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等過程中發(fā)揮重要作用。目前,KLF4已被證實在HCC中表達下降,進一步研究證實上調KLF4可以抑制肝癌細胞增殖、侵襲[2]。相關研究[3-5]證明,KLF4在肝癌中參與調節(jié)Notch通路、Wnt/β-catenin等多個信號通路,與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關,但其中的具體調控機制仍未完全明確,本文將從KLF4的結構、功能以及在肝癌中發(fā)揮的作用進行綜述。
人KLF4基因位于染色體9q31,編碼的KLF4蛋白含470個氨基酸殘基,分子量約55 kDa。小鼠的KLF4基因定位于染色體4B3,編碼含483個氨基酸殘基的多肽,與人類KLF4氨基酸序列相比,同源性為91%。KLF4蛋白含有2個核定位信號,分別位于鋅指結構的N-端及前方,二者都能單獨將KLF4蛋白轉移至細胞核內。KLF4蛋白具備3個主要功能結構域[6]:羧基端DNA結合域、氨基端轉錄調節(jié)域、鋅指結構核定位序列。KLF4羧基端序列高度保守,包含3個連續(xù)的Cys2-His2鋅指結構,發(fā)揮特異性結合DNA的作用;氨基端轉錄調節(jié)域序列高度變異,其中轉錄激活結構域富含脯氨酸和絲氨酸,位于91~117位氨基酸殘基處;轉錄抑制結構域富含脯氨酸,位于第181~371氨基酸殘基處。同時具備激活域和抑制域使得KLF4對下游靶基因具有活化和抑制雙重調控作用[7]。
KLF4介導的基因轉錄通過磷酸化、乙?;?、甲基化和泛素化等多種方式進行翻譯后修飾。這些修飾通過改變KLF4的蛋白質結構穩(wěn)定性、DNA結合能力和轉錄活性來調控其功能[8]。KLF4第225及229位賴氨酸殘基受p300/CBP復合物調節(jié),發(fā)生乙?;揎椇笸蛔?yōu)榫彼幔琄LF4活性受到抑制[9],進而削弱其反式激活靶基因的能力。而抑制組蛋白乙?;途彼峒谆軌騾f同作用激活KLF4表達。研究[10]表明,磷酸化ERK1和ERK2可抑制KLF4活性,同時可將F-box蛋白βTrCP1或βTrCP2聚集到KLF4的N端結構域,進而導致KLF4的泛素化和降解,同時促進胚胎干細胞分化。Yang等[11]發(fā)現,宮頸癌細胞中KLF4啟動子CpG島高甲基化狀態(tài)誘導KLF4失活,抑制其腫瘤抑制因子功能。由此可見,KLF4介導的基因轉錄受多種方式調節(jié)修飾。
KLF4高表達于胃腸道上皮細胞,在角膜、血管內皮、睪丸組織、胸腺細胞和T淋巴細胞也有不同程度的表達。研究[12]表明,KLF4參與調控細胞分化、炎癥反應、胚胎發(fā)育等生命過程,并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關。KLF4同時具備轉錄激活域和轉錄抑制域,因此KLF4在不同腫瘤發(fā)展過程中可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮不同功效,可作為腫瘤治療的分子靶點。KLF4作為抑癌基因還是癌基因發(fā)揮作用,受細胞分化差異、細胞核基因表達狀態(tài)以及細胞染色質環(huán)境等因素調節(jié),具體機制尚待進一步探究。研究表明, KLF4在胃癌[13]、食管癌[14]、結腸癌[15]、胰腺癌[16]等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。相反,KLF4在皮膚鱗癌、喉癌等腫瘤中發(fā)揮促癌作用。Lin等[17]研究發(fā)現KLF4在HCC中呈現低表達, 增加KLF4表達可以逆轉EMT過程并促進肝癌細胞凋亡,肝癌患者中低表達KLF4者預后相對更差,更易發(fā)生肝內轉移及肝外轉移。
KLF4不僅是正常細胞增殖的重要調控因子,也能夠調控各種腫瘤細胞的生長增殖。相關研究表明肝癌組織和細胞中KLF4表達明顯下調或缺失,KLF4對肝癌細胞增殖和侵襲轉移發(fā)揮抑制作用[18-19],提示肝癌中KLF4是一個抑癌基因。KLF4對于抑制肝癌細胞增殖與阻滯細胞周期有關。KLF4通過作用于p21CIP1/WAF1基因啟動子中富含GC的特異性順式作用元件,反式激活p21CIP1/WAF1等細胞周期負性調控因子,抑制細胞周期蛋白cyclinB1及cyclinD1的表達,將細胞周期阻滯于G1/S期或者G2/M期,進而抑制腫瘤增殖[20]。KLF4還可以上調細胞周期抑制蛋白CDKN1A的表達,KLF4通過結合特異性SP1樣順式元件來激活CDKN1A啟動子,同時聚集p53到CDKN1A啟動子區(qū)域,進而激活CDKN1A基因的轉錄。CDKN1A在多種腫瘤中可抑制細胞生長增殖,通過抑制G1期向S期進展負性調控細胞周期。CDKN1A還可激活p21CIP1/WAF1并促進其轉錄表達,而p21CIP1/WAF1激活是p53、APC及TGFβ等腫瘤抑制信號通路激活的核心環(huán)節(jié)。研究[21]表明KLF4可以上調P-cadherin的表達,而P-cadherin在肝癌中通過調節(jié)GSK-3β抑制腫瘤生長增殖。Li等[22]研究發(fā)現,在肝癌細胞中,KLF4甲基化修飾后表達沉默,導致其下游靶基因維生素D3受體與維生素D3作用減弱,抑制后者抗增殖效應,促進肝癌細胞增殖及侵襲。而上調KLF4表達能明顯抑制裸鼠移植瘤的生長和轉移,提示KLF4可作為肝癌基因治療的新靶點。相關研究[23]發(fā)現肝癌中KLF4上調CD9和CD81的表達,后者通過負向調節(jié)MAPK/JNK信號通路來抑制細胞增殖,發(fā)揮腫瘤抑制作用。以上研究表明,KLF4在肝癌中發(fā)揮負性調控細胞周期、抑制細胞增殖的作用。
EMT涉及各種實體腫瘤發(fā)生侵襲前丟失上皮細胞特性和獲得間充質細胞特性,是癌變的中心步驟。獲得間充質特性將這些細胞從原發(fā)性腫瘤中釋放出來,使它們侵入鄰近的組織,進入循環(huán)并轉移至遠處的器官。多種轉錄因子參與調控EMT激活和發(fā)展,如Snail-1/2、Zeb-1/2、Twist、TGFβ1等,KLF4也是其中之一,可直接抑制EMT關鍵基因的表達。在HCC中,KLF4通過調控ERK、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin等信號通路發(fā)揮作用,抑制EMT[24]。KLFs家族成員KLF11通過與Smad7啟動子結合而抑制其表達,進而促進肝癌細胞EMT。而KLF4通過與KLF11啟動子結合,抑制其誘導的肝癌EMT過程[25]。同時,KLF4還可以通過與Smad7啟動子結合而上調其表達,通過這條途徑,抑制TGFβ信號傳導,因此,在HCC細胞中KLF4表達的缺失可能有助于致癌性TGFβ信號的激活和隨后的腫瘤進展[26]。結腸癌中KLF4通過抑制TGFβ1/Smad信號傳導,抑制結腸癌細胞EMT進展,降低其侵襲力[27]。Lin等[17]研究發(fā)現,在HCC中,上調KLF4表達可以抑制其間充質特性,使細胞形態(tài)向上皮細胞轉化,進而抑制肝癌細胞的轉移和侵襲,反之敲除KLF4則使細胞獲得間質特性并促進細胞增殖和遷移。其機制可能是通過KLF4 特異性結合slug啟動子并抑制其活性,而上調slug表達可一定程度逆轉KLF4介導的細胞上皮樣表型。Liu等[28]研究表明,在前列腺癌中,KLF4可以抑制slug轉錄表達,KLF4缺失促進slug依賴的EMT發(fā)生,進而促進腫瘤的轉移。以上研究表明,KLF4對腫瘤EMT過程發(fā)揮抑制作用,進而降低腫瘤的遷移、侵襲能力,抑制腫瘤進一步惡性進展。
研究[29]表明,KLF4表達缺失的腫瘤細胞更具侵襲性,肺癌細胞中上調KLF4表達可以增加CDH1的表達,并抑制SNAI2、TWIST1和Vimentin的表達,進而抑制細胞的遷移和入侵。在順鉑耐藥鼻咽癌細胞中,KLF4通過抑制NOTCH1表達進而抑制細胞遷移侵襲[30]。在HCC中,KLF4通過與miRNA相互作用,抑制SNAI1、SNAI2和ZEB1表達,進而抑制肝癌細胞遷移侵襲[31]。He等[32]研究發(fā)現,在HCC中,腫瘤壞死因子受體相關因子7(TRAF7)作為一種E3-泛素連接酶,通過將KLF4泛素化和降解進而促進HCC的遷移和侵襲。研究[33]表明肝癌中KLF4的轉錄活性被DDX17負性調節(jié),后者在肝癌中促進腫瘤增殖轉移。KLF4還可以上調金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)-1、TIMP-2表達,后者參與調節(jié)細胞外基質降解,進而降低肝癌細胞侵襲力[34]。Yang等[35]及Rajasekaran等[36]研究發(fā)現,單酰甘油酯酶(monoacylglycerol lipase,MGLL)在肝癌中低表達,是肝癌中KLF4作用的靶基因之一。MGLL低表達的患者5年生存率降低,MGLL過表達抑制HCC細胞遷移侵襲,KLF4與MGLL啟動子結合并上調HCC細胞中MGLL的表達。與周圍的非腫瘤組織相比,HCC中KLF4的表達降低,并且與腫瘤數量、分化等級、淋巴結轉移和遠處轉移呈負相關,低KLF4表達可能意味著HCC患者的預后較差[37]。
KLF4基因不僅影響細胞增殖、分化,而且與細胞凋亡密切相關。KLF4在黑色素瘤通過減少腫瘤細胞凋亡促進細胞的生長,發(fā)揮促癌作用[38]。研究[39-40]表明KLF4激活可以導致p53上調和抑制Bcl-xL的表達, 通過凋亡誘導細胞死亡。KLF4可以調節(jié)p53啟動子的轉錄,而p53可以調節(jié)KLF4的表達,KLF4和p53之間的反饋回路可以促進細胞凋亡。凋亡過程的另一個重要調節(jié)劑是caspase家族,在Bax作用下,細胞線粒體滲透性增加,導致caspase3和caspase7激活,進而促進細胞凋亡。激活Bax轉錄是KLF4誘導細胞凋亡途徑之一[41]。BIK通過與Bcl-2及Bcl-xL公共BH3結構域直接作用,抑制其抗細胞凋亡功能,并以Bax依賴的方式引起細胞凋亡,Zhang等[42]證明KLF4是順鉑誘導細胞凋亡的重要調節(jié)劑,他們發(fā)現KLF4上調了前列腺癌細胞中BIK的表達,并促進順鉑誘導的BIK的表達。在不同腫瘤中,KLF4可以反過來發(fā)揮抑制細胞凋亡的功能。KLF4在高達70%的人類乳腺癌中過表達,而KLF4的核定位與侵襲性表型相關,乳腺癌中KLF4通過直接作用于p53啟動子中的PE21元件來抑制p53的表達,在此背景下,KLF4抑制DNA損傷誘導的細胞凋亡。以上KLF4在HCC中的作用見圖1。
注:KLF4的表達受到DNA甲基化、microRNA、DNA損傷等因素調節(jié)。KLF4調控的下游靶基因介導了KLF4在肝癌細胞中的抑制作用。
目前,臨床上治療肝癌的方案較多,但多數患者治療效果欠佳、預后較差。了解KLF4在肝癌中的作用有助于人們進一步明確肝癌發(fā)生發(fā)展機制,并為肝癌治療提供新的思路。KLF4作為鋅指轉錄因子家族中重要成員,在調控細胞增殖、分化、凋亡等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要的作用,與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關,KLF4在多數乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤中發(fā)揮促癌作用;而在胃癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。KLF4在HCC中低表達,增加KLF4表達可以抑制肝癌細胞增殖和轉移侵襲,關于KLF4在肝癌中具體作用機制尚需進一步研究,KLF4不僅可能成為肝癌有價值的預后生物標志物,也可能成為肝癌的治療靶點[43],為肝癌的分子靶向治療和預后監(jiān)測提供新思路。
利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明:孫菲負責課題設計,資料分析,撰寫論文;蘇維瑋、付艷華參與收集數據,修改論文;王經偉負責擬定寫作思路,指導撰寫文章并最后定稿。