準噶爾雅羅魚仔魚饑餓試驗及不可逆點的確定

宋明波，胡江偉，李曉東，王 雪，賀疆滔，時春明，王 松，牛建功

(新疆水產科學研究所，農業(yè)農村部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，新疆 烏魯木齊 830000)

仔魚期是魚類生活史中最脆弱、對環(huán)境條件最敏感的時期，饑餓是導致仔魚死亡的主要原因之一。Blaxex J H S等[1]于1963年首先提出“不可逆點(PNR)”的概念，即饑餓仔魚抵達該點時，盡管還能生存較長一段時間，但其機體已虛弱到無法再恢復攝食能力，最終導致死亡，因此也被稱為“不可逆轉饑餓”。目前，國內外學者對多種仔魚的PNR和饑餓耐受力進行詳細的研究，包括哲羅鮭(Huchotaimen)、馬拉瓜麗體魚(Cichlasomamanaguense)、斑鱖(Sinipercascherzeri)、葉爾羌高原鰍(Triplophysayarkandensis)、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)等，但有關準噶爾雅羅魚仔魚的研究未見報道。

準噶爾雅羅魚(Leuciscusmerzbacheri)為鯉科、雅羅魚亞科、雅羅魚屬的魚類，目前世界上僅分布在中國新疆地區(qū)準噶爾盆地，僅在精河入艾比湖三角洲、奎屯河入艾比湖河口區(qū)域內有分布[2-5]，是該區(qū)域內標志性物種，也是新疆獨有的土著魚類，為準噶爾盆地諸河中唯一一種具有較高經濟價值的魚類，是這些水域水生生物的關鍵種(Key species)或旗艦種(Flagship species)。準噶爾雅羅魚在1998年被《中國瀕危動物紅皮書》(魚類)列為易危物種[2]，在2019年被新疆維吾爾自治區(qū)列為I級保護水生野生動物。該魚現(xiàn)存數量極少，迫切地需要對其進行生物多樣性保護。準噶爾雅羅魚棲息區(qū)域處于新疆阿拉山口的風道區(qū)，而且阿拉山口地處世界五大風口之一，其自然環(huán)境惡劣，存在年度季風多、風級大、早晚溫差大、餌料豐度欠佳、水域鹽堿度高等多種不利因素，這都會對準噶爾雅羅魚造成饑餓生理脅迫現(xiàn)象，因此研究其初次攝食率和PNR對人工育苗工作十分重要。準噶雅羅魚原種人工孵化后的仔魚由內源性營養(yǎng)轉化為外源性營養(yǎng)的臨界期是個危險時期，即將開口的仔魚會因不能及時攝取適口餌料而出現(xiàn)大量死亡。因此，本試驗通過探索準噶爾雅羅魚仔魚的初次攝食率和確定不可逆點，以期豐富準噶爾雅羅魚早期生活史的研究資料，在生產實踐中為準噶爾雅羅魚人工育苗提供技術依托，同時對更好地救護這一易危魚類、維護準噶爾盆地河流生態(tài)環(huán)境的平衡具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年4月，本試驗在新疆水生野生動物救護中心車間開展。在水溫(16.0±0.5)℃、pH 8.05、溶解氧8 mg/L以上的條件下，對10組野生準噶爾雅羅魚進行人工催產，采取人工采卵授精獲得受精卵，在矩形槽擱卵板上充氧孵化獲得子一代苗種。

1.2 方法

準噶爾雅羅魚破膜后，選擇同批次初孵仔魚4 000尾，共分4組(每組1 000尾)，設3個平行饑餓組和1個正常投喂組。每1 000尾放入20 L玻璃水槽里進行饑餓試驗，饑餓組在不投餌的條件下喂養(yǎng)至仔魚100%死亡。本試驗各參數條件一致，試驗用水均為充分曝氣的自來水，水溫(21.0±1.5)℃，用邁卓醫(yī)用制氧機充氧，開口餌料為80～200 μm的輪蟲幼體和輪蟲，投喂密度為15～20 ind/mL。每天每組隨機取樣30尾測量仔魚全長，用以觀察和記錄仔魚的形態(tài)發(fā)育特征，統(tǒng)計死亡情況，并每日換1/3等溫水。

1.2.1 數據測量

每日嚴格按照定時隨機取樣，每次取不同水位的30尾仔魚，在舜宇體視顯微鏡(SDPTOP-SZN71)進行活體觀察和拍照。顯微觀察測量時，用軟件MVImage vt測定各形態(tài)數據，數值精確到0.1 μm，測量后的數據經過物鏡倍率調節(jié)得出準確數據。測量數據包括仔魚全長、卵黃囊長徑、卵黃囊短徑，并計算卵黃囊的體積，計算公式參照Alderdice D F等[6]方法：V=4/3π×(r/2)2×R/2，式中：V為卵黃囊體積，r為卵黃囊短徑，R為卵黃囊長徑。

以全長-日齡關系曲線和全長日增長率(LGR)比較饑餓對仔魚生長的影響，全長日增長率計算公式：LGR=100(lgL2-lgL1)/[0.434 3(t2-t1)]，式中：LGR為全長日增長率，L2、L1分別是試驗開始時和試驗結束時仔魚的全長，t2、t1分別表示試驗仔魚日齡。

1.2.2 初次攝食率

初次攝食率指消化道內含有生物餌料的仔魚尾數占測定總尾數的百分數，其測定方法為：每次取30尾仔魚，將300 mL有效水體倒入500 mL燒杯中，用小型曝氣石微充氧，因其仔魚口裂較小，3～5日齡投喂池塘培育的褶皺臂尾輪蟲幼體，之后投喂褶皺臂尾輪蟲成體，投喂密度15～20 ind/mL；燒杯放置于恒溫(21.0±1.5)℃的玻璃水槽里，3 h后將仔魚取出，用5%福爾馬林殺死，然后逐一檢查準噶爾雅羅魚的攝食情況，并計算初次攝食率。

初次攝食率=x/z×100%，式中：x為腸管內含有輪蟲的仔魚尾數，z為總測定仔魚尾數。

1.2.3 PNR的確定

每天隨機抽取饑餓組仔魚并測定其初次攝食率，確定初次攝食率最高值，當所測定的初次攝食率低于最高攝食率的1/2時，即為PNR的時間，PNR用孵化后日齡表示[7]。

1.3 數據處理與分析

試驗數據用平均值±標準差(Mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，用Excel進行作圖。

2 結果與分析

2.1 仔魚的初次攝食率及PNR

在同等試驗養(yǎng)殖條件下，投喂組初孵仔魚孵化后每日投喂輪蟲幼體，通過顯微鏡觀察，仔魚3日齡初次開口，3日齡開口為36.0%，4日齡攝食已達70.0%，說明仔魚的攝食能力較強；7日齡達到最高峰值(96.6%)，之后逐日下降；至9日齡和10日齡時分別為73.3%和46.6%，并出現(xiàn)仔魚大量死亡；至13日齡全部死亡，初次攝食率為0。圖1顯示，準噶爾雅羅魚初次攝食率在9日齡和10日齡之間時為最高初次攝食率的50%，因此，該仔魚耐饑餓的時間臨界點發(fā)生在孵化后的第9～10日齡，PNR為9～10日齡。

2.2 仔魚卵黃囊的吸收

初孵仔魚全長為(5.335±0.017)mm，頭部伏在卵黃囊上；卵黃囊呈蝌蚪狀，卵黃囊平均長徑為(2.469±0.026)mm，平均短徑為(0.780±0.026)mm，肛前長為(2.532±0.013)mm。0～4日齡仔魚卵黃囊的吸收呈現(xiàn)逐日遞減趨勢。在仔魚3日齡進入混合營養(yǎng)期階段后，饑餓組仔魚卵黃囊的吸收速率明顯比對照組慢，對照組仔魚在5日齡卵黃囊消失，而饑餓組仔魚的卵黃囊消失在6日齡(表1)。

2.3 饑餓對仔魚生長的影響

饑餓組與對照組仔魚的全長、卵黃囊長短徑和體積情況如表1所示。3日齡后饑餓對仔魚卵黃吸收速度影響極顯著(P<0.01)，表明在進食的對照組卵黃囊的消耗迅速加快；5日齡后饑餓對仔魚體長影響顯著(P<0.05)。

表1 準噶爾雅羅魚仔魚卵黃囊的吸收

饑餓組與對照組仔魚的全長增長情況如表1、圖2所示。對照組與饑餓組仔魚的全長增長在開口前基本一致，保持較快的生長速度。4日齡前全長日增長率為6.31%。3日齡開口后，兩組的生長速度開始分化，對照組仔魚全長進入2 d左右的相對緩慢增長期，當過渡到外源性營養(yǎng)期后，9日齡仔魚又進入快速生長期，15日齡全長為(16.443±1.264)mm，22日齡全長為(19.973±1.723)mm，9～22日齡全長日增長率為5.76%；而饑餓組仔魚過渡2 d的緩慢增長期后，6日齡仔魚開始出現(xiàn)負增長，10日齡開始大量死亡，13日齡仔魚全部因饑餓而死亡。

此外，全長日增長率差異也較大，對照組仔魚為6.47%，饑餓組仔魚為2.94%。

2.4 饑餓對仔魚形態(tài)和行為學特征發(fā)育的影響

初孵仔魚全身透明，肌節(jié)39～41，眼囊有色素細胞沉著，主鰓蓋和間鰓蓋清晰可見(圖3-A)。在水溫(21.0±1.5)條件下，仔魚2日齡能夠平游，3日齡少量開口攝食。隨著饑餓程度的加深，仔魚的行為和形態(tài)發(fā)生明顯分化。延遲投餌3～4 d(5～6日齡)，仔魚大量上浮覓食；延遲投餌5 d(7日齡)，仔魚漂浮水面，體弱無力、活動少，部分魚體頭部發(fā)黑，頭下尾上倒掛于水體上層，魚體獨游，開始出現(xiàn)脊索彎曲、腹部凹陷、死亡；延遲投餌7 d(10日齡)魚體發(fā)黑，腸道萎縮，大量出現(xiàn)胸角，嚴重者呈佝僂狀，開始大量死亡(圖3-B～C)，與對照組形成鮮明對比(圖3-D)。

注：A為初孵仔魚；B與C為10日齡仔魚(饑餓組)；D為10日齡仔魚(對照組)。

3 討論

3.1 仔魚的混合營養(yǎng)期

魚類卵的大小對苗種的早期發(fā)育和存活具有重要的意義[8]。準噶爾雅羅魚受精卵呈卵圓形、黏性、略有沉性，卵徑為(1.206±0.030)mm，表明該魚卵徑相對較小，和大多數卵生魚類一樣，經歷內源營養(yǎng)期、混合營養(yǎng)期和外源營養(yǎng)期。在水溫(21.0±1.5)℃條件下，初孵仔魚至2日齡為完全內源營養(yǎng)期，伴隨著卵黃囊的吸收，3日齡進入混合營養(yǎng)期，5日齡進入外源營養(yǎng)期，混合營養(yǎng)期僅為2 d?；旌蠣I養(yǎng)期的長短存在種間差異，受水溫、光照、pH值等環(huán)境因子的影響，同時受受精卵質量等內因的影響。為減少不同影響因子對種間差異的影響，以仔魚開口攝食到卵黃囊吸收完畢的時間與仔魚孵化后到開口攝食的時間之比即使用比率符號“△R”進行分析，能客觀判別不同魚類仔魚混合營養(yǎng)期的相對狀況[9]。大多數魚類的仔魚混合營養(yǎng)期分為3種類型，即△R≥1.0，屬不易遭受饑餓脅迫魚類；0.1<△R<1.0，屬易遭受饑餓脅迫魚類；0≤△R≤0.1，屬極易遭受饑餓脅迫魚類。本研究結果顯示：0.1<△R=0.67<1.0，說明準噶爾雅羅魚在卵黃囊吸收完畢之前沒有相對較長的混合營養(yǎng)期來積累攝食經歷和提高攝食能力，表明準噶爾雅羅魚幼魚屬于易遭受饑餓脅迫魚類，黑莓鱸(Pomoxisnigromacufastus)[10]和鲇魚(Silurusasolus)的幼魚同屬易遭受饑餓脅迫魚類。

根據準噶爾雅羅魚的生物學特性分析，該魚屬于小型魚類和雜食性魚類，日攝食量相對較低，但攝食范圍廣泛，包括小魚、水生植物、植物種子、鹵蠅蛹、浮游動植物以及軟體動物等[2]，因此，短暫的混合營養(yǎng)期在一定程度上對仔魚的生存制約性較為有限。

3.2 仔魚的饑餓耐力

饑餓是魚類在自然水域生態(tài)系統(tǒng)中經常面臨的一種生理脅迫現(xiàn)象，也是影響魚類正常生長、發(fā)育和生存的重要因子[11]。饑餓耐力是判斷魚類對饑餓生理脅迫的耐受程度，PNR是評價仔魚饑餓耐力的重要指標之一，從仔魚初期攝食到達PNR時間越長，仔魚饑餓耐力越強，反之越弱[12]。表2顯示，河川沙塘鱧(OdontobutispotamophilaGünther)[13]當日齡即可開口，除黑莓鱸[10]、哲羅鮭[14]、中華鱘(Acipensersinensis)[15]、白斑狗魚(Esoxlucius)[16]開口較慢以外，其他淡水魚類開口時為3～5日齡。而初孵仔魚到達PNR的時間從3日齡到19日齡長短不等，長的如瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)[17]、河川沙塘鱧[13]、中華鱘[15]、倒刺鲃(Spinibarbusdenticulatus)[18]、金鯽(Gold crucian carp)[19]、哲羅鮭[14]，其余均為3～6 d。準噶爾雅羅魚初孵仔魚3日齡開口，9～10日齡到達PNR，從初次攝食到達PNR的時間為6～7 d，說明準噶爾雅羅魚仔魚的耐饑餓能力處于中等水平。饑餓組仔魚6日齡生長發(fā)育出現(xiàn)負增長，表明準噶爾雅羅魚仔魚耐餓能力一般，這可能是造成目前自然水域狀態(tài)種群數量較少的原因之一。大多數學者認為，在混合營養(yǎng)期中延遲投餌會延遲仔魚的生長發(fā)育，且隨延遲投喂時間的延長，危害越大，這便是進展性饑餓現(xiàn)象[20]。對照組仔魚在5日齡卵黃囊消失，而饑餓組仔魚的卵黃囊消失在6日齡，這說明在饑餓脅迫的條件下，饑餓延緩了仔魚對卵黃囊的吸收，這可能是仔魚延緩了自身發(fā)育進程以應對饑餓脅迫的一種生理適應機制。

準噶爾雅羅魚在饑餓狀態(tài)下無自身物質可供消耗時，和大多數硬骨魚類一樣，既要保證基礎生存，又要進行各內臟器官的發(fā)育、完善，使得仔魚因饑餓而受到的損傷難以修復[21]，仔魚出現(xiàn)負增長現(xiàn)象，最終直接導致大量仔魚死亡。因此，在準噶爾雅羅魚幼魚饑餓達到耐力的極限時，其已虛弱到無法再恢復攝食能力，盡管還能再存活一段時間，但最終死亡，這是不可逆的一種生物學特性。

3.3 準噶爾雅羅魚初次攝食最佳投喂時間

臨界期指的是仔魚從內源性營養(yǎng)轉向外源性營養(yǎng)時，由于餌料保障和仔魚器官發(fā)育的共同作用而構成仔魚大量死亡的危險期，控制臨界期表露的主要因子：一是餌料大小、質量和密度；二是仔魚攝食機能的形成和適口餌料密度高峰出現(xiàn)時間的配合[7]。為了規(guī)避育種危險，提高人工育苗率，在實際生產中，必須重點把握好攝食投喂時間、餌料大小和餌料密度控制。仔魚對開口餌料的選擇主要是適口性和易捕性，而且輪蟲、無節(jié)幼體等小型浮游動物個體較小，游動慢，適口性、誘食性好，因此適合仔魚的開口攝食[22]。魚類的種類不同，仔魚開口攝食的餌料種類也不一樣。肉食性魚類如白斑狗魚[16]、斑鱖[23]的仔魚開口餌料為枝角類和橈足類幼體，鯉魚(Cyprinuscarpio)、葉爾羌高原鰍[24]等魚類的開口餌料通常為輪蟲。準噶爾雅羅魚初孵仔魚口徑較小，開口餌料的選擇范圍為鹵蟲幼體和輪蟲幼體，也可攝食雞蛋黃和有機碎屑。準噶爾雅羅魚初次攝食率較低，與多數卵生硬骨魚類仔魚情況相近[25]，仔魚3日齡開口攝食，混合營養(yǎng)期僅2 d，需及時進行投喂。在饑餓脅迫下，仔魚具有攝食能力的時間也僅為6～7 d。推斷在(21.0±1.5)℃培育水溫條件下，準噶爾雅羅魚仔魚的人工育苗最佳投喂時間為3～6日齡，開口餌料選擇輪蟲幼體或鹵蟲幼體，并且餌料密度在15～20 ind/mL，從而才能保證仔魚較高的成活率和良好的生長。