西瓜藤鎮(zhèn)痛活性部位篩選及作用機(jī)制研究*

龔小妹，歐春麗，侯小利，張文玉，陳碩，周小雷，王碩

(1.廣西藥用植物研究所，西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；2.山東省濟(jì)南市歷下區(qū)人民醫(yī)院中藥科，濟(jì)南 250000)

西瓜藤為葫蘆科(Cucurbitaceae)植物西瓜(Citrulluslanatus)的藤莖。其作為農(nóng)作物廢棄物，資源非常豐富，如不合理利用會(huì)造成資源浪費(fèi)，還會(huì)給環(huán)境造成壓力。開展其藥用價(jià)值研究，對(duì)開發(fā)新的藥用資源，實(shí)現(xiàn)中藥資源可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[1]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，西瓜藤總提取物具有較好抗炎鎮(zhèn)痛活性[2-6]，但其鎮(zhèn)痛作用活性部位及機(jī)制尚不明確。在前期研究基礎(chǔ)上，筆者采用2.5%甲醛溶液致小鼠足下疼痛實(shí)驗(yàn)研究西瓜藤鎮(zhèn)痛活性部位，并研究西瓜藤鎮(zhèn)痛活性部位的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制，以期為西瓜藤的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，無特定病原體(SPF)級(jí)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(桂)2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(桂)2014-0003。飼養(yǎng)條件：小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，飼養(yǎng)室溫度(23±2) ℃，相對(duì)濕度(60±5)%，光暗周期同晝夜周期。

1.2藥物 西瓜藤采自廣西壯族自治區(qū)南寧市吳圩，經(jīng)廣西藥用植物研究所趙以民副研究員鑒定，為葫蘆科植物西瓜CitrullusLanatus的藤莖；吲哚美辛片(山西云鵬制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：A120708)。

1.3試劑 β-內(nèi)啡肽(beta-endorphin，β-EP)、5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)、一氧化氮(NO)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、P物質(zhì)(substance P，SP)和去甲腎上腺素(noradrenaline，NE)等試劑盒由武漢華美生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為D27014434、C32025571、D27011128、C051024113、B051125119、D27013145；總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，批號(hào)：O3527)；2.5%甲醛溶液(甲醛含量37.0%～40.0%，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：1305051)；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為110930，1208291，1305181，110825)。

1.4主要儀器 SB-1100水浴鍋、N-1106旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、EYELA-CA-1111循環(huán)冷凝真空泵(上海愛明儀器有限公司)；HX502T電子天平(慈溪市天東衡器公司，感量：0.1 mg)；Tecan Infinite F200酶標(biāo)儀(瑞士帝肯Tecan)；BIO-RAD基礎(chǔ)電泳儀(北京市六一儀器廠)；離心機(jī)(德國艾本德生命科學(xué)公司，型號(hào)：Centrifuge 5430R)。

1.5西瓜藤提取物的制備 取西瓜藤干品5 kg，粉碎，分別用藥材量的10和8倍水煮沸提取2和1.5 h，合并提取液，濃縮干燥，即得西瓜藤水部位提取物(浸膏0.8 kg)。取西瓜藤干品20 kg，粉碎，用藥材量的5倍80%乙醇分別超聲處理2和1 h，濾過，減壓濃縮得醇提取浸膏2.4 kg(每克浸膏相當(dāng)于生藥8.3 g)，將浸膏分散于去離子水5000 mL，靜置過夜，3000 r·min-1離心(r=10 cm)，分離不溶于水的黏稠固體懸浮物。取水溶液，依次用3倍量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取樣品，得石油醚部位提取物浸膏(0.12 kg)、乙酸乙酯部位提取物浸膏(0.13 kg)、正丁醇部位提取物浸膏(0.40 kg)[5]。

1.6致痛實(shí)驗(yàn) 取健康昆明種小鼠110只，雌雄各半，采用隨機(jī)分組法分為11組，每組10只，分別為吲哚美辛組[吲哚美辛片，0.009 g·kg-1·d-1，于實(shí)驗(yàn)前將吲哚美辛片用研缽粉碎，過孔徑0.075 μm(200目)篩，按成人每天每次使用69.23 mg換算成小鼠給藥劑量，0.9%氯化鈉溶液溶解，配成0.9 mg·mL-1混懸液，按0.2 mL·(20 g)-1·d-1灌胃]，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組[給予0.9%氯化鈉溶液，按0.2 mL·(20 g)-1·d-1灌胃]，西瓜藤石油醚部位提取物大劑量、小劑量組(給藥劑量相當(dāng)于生藥20.0，5.0 g·kg-1·d-1)，西瓜藤乙酸乙酯部位提取物大劑量、小劑量組(給藥劑量相當(dāng)于生藥20.0，5.0 g·kg-1)，西瓜藤正丁醇部位提取物大劑量、小劑量組(給藥劑量相當(dāng)于生藥20.0，5.0 g·kg-1·d-1)，西瓜藤水部位提取物大劑量、小劑量組(給藥劑量相當(dāng)于生藥20.0，5.0 g·kg-1·d-1)?？瞻讓?duì)照組左后足跖皮下注射0.9%氯化鈉溶液，其他各組給藥前左后足跖皮下注射2.5%甲醛溶液30 μL，計(jì)時(shí)，立即置平底大玻璃容器，記錄給藥前小鼠注射2.5%甲醛溶液后1～5 min(Ⅰ相)和15～35 min(Ⅱ相)內(nèi)痛反應(yīng)累積時(shí)間，評(píng)分。1周后，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃0.9%氯化鈉溶液，0.2 mL·(20 g)-1，其他各組灌胃相應(yīng)藥物，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，空白對(duì)照組左后足跖皮下注射0.9%氯化鈉溶液，其他各組左后足跖皮下注射2.5%甲醛溶液30 μL，立即置平底大玻璃容器，分別記錄小鼠注射2.5%甲醛溶液后1～5 min(Ⅰ相)和15～35 min(Ⅱ相)內(nèi)痛反應(yīng)累積時(shí)間，評(píng)分。評(píng)分方法：第一部分為注射2.5%甲醛溶液抬起足時(shí)間，第二部分為注射2.5%甲醛溶液舔、咬、抖動(dòng)足時(shí)間，將給藥前后評(píng)分值代入公式1分別計(jì)算各組累積分值，由公式2得出給藥后鎮(zhèn)痛評(píng)分值。公式1：累積分值=(第一部分時(shí)間×1+第二部分時(shí)間×2)/300；公式2：鎮(zhèn)痛評(píng)分值=(給藥后累計(jì)分值/給藥前累計(jì)分值)×100%[7]。

1.7小鼠血清炎癥遞質(zhì)測定 取健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，采用隨機(jī)分組法分為6組，每組10只，分別為空白對(duì)照組和模型對(duì)照組[0.9%氯化鈉溶液，0.2 mL·(20 g)-1·d-1]，吲哚美辛組(吲哚美辛片，0.009 g·kg-1·d-1，配制方法同“1.6”項(xiàng))，西瓜藤乙酸乙酯部位提取物大劑量、中劑量、小劑量組(給藥劑量相當(dāng)于生藥20.0，10，5.0 g·kg-1·d-1)，均連續(xù)灌胃給藥7 d。末次給藥后1 h，除空白對(duì)照組外，其他各組小鼠左后足跖皮下注射2.5%甲醛溶液30 μL，15 min后經(jīng)眼球取血，3500 r·min-1離心15 min(r=10 cm)，取上清液檢測血清NO、PGE2、5-HT、β-EP、SP與NE含量。

1.8小鼠腦內(nèi)環(huán)氧合酶測定[8]

1.8.1動(dòng)物分組與模型的制備 取健康昆明種小鼠288只，雌雄各半，隨機(jī)分組法分為6組，每組48只。給藥方法同“1.7”項(xiàng)。連續(xù)給藥7 d，末次給藥后1 h，各組分別取小鼠6只，雌雄各半，處死并取大腦，記為Beffer時(shí)間點(diǎn)；剩下各組小鼠，除空白對(duì)照組外，其他組小鼠左后足跖皮下注射2.5%甲醛溶液30 μL以誘導(dǎo)炎性痛。并在注射2.5%甲醛溶液后1，2，3，4，5，6，7 d，各組(包括空白對(duì)照組)分別取小鼠6只，雌雄各半，處死并取大腦，記為1，2，3，4，5，6，7 d時(shí)間點(diǎn)。

1.8.2cDNA第一鏈合成 在“1.8.1”項(xiàng)中各時(shí)間點(diǎn)取的小鼠大腦，采用總RNA提取試劑盒提取總RNA，cDNA第一鏈合成試劑盒把總RNA合成cDNA。

1.8.3反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析 將合成cDNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。聚合酶鏈反應(yīng)所用引物：GAPDH(5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，5′-TACAGCAACAGGG-TGGTGGA-3′；產(chǎn)物長度307 bp)，COX-1(5′-AGGA-GATGGCTGCTGAGTTGG-3′，5′-AATCTGACTTTCTGA-GTTGCC-3′，產(chǎn)物長度602 bp)，COX-2(5′-GGGAA-GCCTTCTCCAACC-3′，5′-GAACCCAGGTCCTCGCTT-3′，產(chǎn)物長度293 bp)。反應(yīng)條件95 ℃ 2 min，隨即30個(gè)循環(huán)聚合酶鏈反應(yīng)，循環(huán)溫度方案：95 ℃30 s，65 ℃30 s，72 ℃1 min。循環(huán)結(jié)束后，72 ℃溫育10 min，聚合酶鏈反應(yīng)所得產(chǎn)物經(jīng)加有溴化乙錠(ethidium bromide，EB)的瓊脂糖電泳，凝膠成像儀進(jìn)行圖像分析。用Quantity One軟件測條帶的灰度值(integrated density value，IDV)，計(jì)算出相對(duì)IDV。相對(duì)IDV=目的基因IDV/內(nèi)參GAPDH IDV。觀察西瓜藤鎮(zhèn)痛活性部位對(duì)小鼠腦內(nèi)COX-1、COX-2表達(dá)的影響。

2 結(jié)果

2.1小鼠疼痛評(píng)分 見表1。與模型對(duì)照組比較，西瓜藤乙酸乙酯部位提取物大劑量、小劑量組和吲哚美辛組小鼠給藥后Ⅰ相、Ⅱ相累計(jì)分值和鎮(zhèn)痛評(píng)分值均顯著降低(P<0.05)。其他各組鎮(zhèn)痛作用不明顯。因此選擇西瓜藤乙酸乙酯部位提取物作為有效鎮(zhèn)痛部位進(jìn)行鎮(zhèn)痛機(jī)制研究。

表1 各組小鼠疼痛評(píng)分結(jié)果

2.2小鼠血清炎癥因子測定結(jié)果 見表2。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清NO、PGE2、5-HT、SP、NE含量均顯著升高(P<0.05)，β-EP含量顯著降低(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，大劑量西瓜藤乙酸乙酯部位提取物可降低2.5%甲醛溶液致痛小鼠血清P物質(zhì)含量(P<0.05)；大劑量、中劑量西瓜藤乙酸乙酯部位提取物能顯著升高2.5%甲醛溶液致痛小鼠血清β-EP含量(P<0.05)，降低血清NO、PGE2、5-HT、NE含量(P<0.05)。

表2 6組小鼠血清NO、PGE2、5-HT、β-EP、SP、NE含量測定結(jié)果

2.3小鼠腦內(nèi)環(huán)氧合酶變化 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組致痛前(0 d)腦內(nèi)COX-1與COX-2表達(dá)均無明顯變化，致痛后1～4 d腦內(nèi)COX-1表達(dá)較弱，COX-2表達(dá)逐漸增強(qiáng)；5～7 d腦內(nèi)COX-1表達(dá)逐漸增強(qiáng)，COX-2表達(dá)逐漸減弱。與模型對(duì)照組比較，西瓜藤乙酸乙酯部位提取物各劑量組和吲哚美辛組致痛前(0 d)腦內(nèi)COX-1與COX-2表達(dá)均無明顯變化；西瓜藤乙酸乙酯部位提取物大劑量組和吲哚美辛組小鼠致痛后1～4 d腦內(nèi)COX-2表達(dá)被明顯抑制，5～7 d腦內(nèi)COX-1表達(dá)被明顯抑制，見圖1～3。

3 討論

疼痛是機(jī)體受到內(nèi)、外環(huán)境刺激后，組織釋放致痛物質(zhì)并傳導(dǎo)至感覺中樞，最終進(jìn)入意識(shí)階段的一個(gè)非常復(fù)雜的過程，嚴(yán)重影響患者身心健康。目前臨床上對(duì)疼痛的治療主要以西藥為主，按作用機(jī)制可分為中樞鎮(zhèn)痛藥和外周鎮(zhèn)痛藥兩類。中樞鎮(zhèn)痛藥主要以阿片生物堿類藥嗎啡為代表，但易產(chǎn)生成癮性與耐藥性；外周鎮(zhèn)痛藥主要以解熱鎮(zhèn)痛類藥對(duì)乙酰氨基酚、阿司匹林等為代表，但常伴隨胃腸道反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、凝血障礙等不良反應(yīng)，因此開發(fā)療效可靠、不良反應(yīng)少、無依賴性的中藥或天然鎮(zhèn)痛藥物已成為當(dāng)前鎮(zhèn)痛藥物研究熱點(diǎn)[9-10]。

由于疼痛機(jī)制復(fù)雜，選擇與臨床疼痛癥狀相似的動(dòng)物模型揭示鎮(zhèn)痛藥作用機(jī)制十分必要[11-12]。2.5%甲醛溶液致痛小鼠模型是目前國際公認(rèn)的研究藥物鎮(zhèn)痛作用的主要模型，其導(dǎo)致的疼痛可分為兩期，第一期為直接刺激神經(jīng)末梢引起的疼痛，第二期為炎癥遞質(zhì)(如NO、β-EP、5-HT、PGE2、SP、NE等)產(chǎn)生并釋放所致[11-12]，當(dāng)機(jī)體受到炎性痛刺激時(shí)，PGE2作為重要的炎癥遞質(zhì)，激活傷害性感受器，導(dǎo)致痛覺過敏，進(jìn)一步發(fā)動(dòng)和傳遞痛覺信號(hào)[13]，β-EP可以通過激動(dòng)阿片受體從而引起抗傷害性感受或鎮(zhèn)痛作用[14]，SP能夠在神經(jīng)末梢釋放并參與疼痛在脊髓中樞的傳導(dǎo)和調(diào)制[15]，同時(shí)產(chǎn)生過多的NO，促進(jìn)疼痛傳導(dǎo)，增加致痛遞質(zhì)的釋放[16]，5-HT作為一種致痛因子借助第二信使刺激局部和旁分泌并在感覺神經(jīng)末梢釋放而導(dǎo)致疼痛[17]。作為交感神經(jīng)遞質(zhì)，NE的異常升高與疼痛有密切關(guān)系[18]。COX是PGs合成過程中的重要限速酶，其同工酶有COX-1和COX-2，COX-2在疼痛急性早期起重要作用，COX-1與疼痛后期維持有關(guān)[19-21]。

A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.吲哚美辛組；D.西瓜藤乙酸乙酯提取物大劑量組；E.西瓜藤乙酸乙酯提取物中劑量組；F.西瓜藤乙酸乙酯提取物小劑量組。

A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.吲哚美辛組；D.西瓜藤乙酸乙酯提取物大劑量組；E.西瓜藤乙酸乙酯提取物中劑量組；F.西瓜藤乙酸乙酯提取物小劑量組；①與空白對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

A.空白對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.吲哚美辛組；D.西瓜藤乙酸乙酯提取物大劑量組；E.西瓜藤乙酸乙酯提取物中劑量組；F.西瓜藤乙酸乙酯提取物小劑量組；①與空白對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

研究表明[22-23]，中藥鎮(zhèn)痛作用主要通過提高中樞阿片肽、5-HT、NO水平，阻斷中樞性鈣通道，抑制前列腺素合成，減少腦組織興奮性氨基酸含量，以及通過減少外周致痛物質(zhì)分泌等發(fā)揮作用。本研究顯示，西瓜藤乙酸乙酯部位提取物能顯著降低2.5%甲醛溶液致痛模型小鼠Ⅰ相、Ⅱ相鎮(zhèn)痛評(píng)分值，降低外周致痛物質(zhì)NO、PGE2、5-HT、SP、NE含量，升高β-EP含量；同時(shí)能抑制2.5%甲醛溶液致痛后小鼠大腦內(nèi)COX-1與COX-2表達(dá)，可見西瓜藤乙酸乙酯部位提取物可通過中樞和外周兩方面發(fā)揮較好鎮(zhèn)痛作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為將西瓜藤開發(fā)成新型中藥鎮(zhèn)痛新藥提供參考，也為農(nóng)作物廢棄物的合理再利用提供新思路。