半枝蓮堿對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲與遷移的抑制作用及其機(jī)制

李國(guó)湘，方業(yè)漢，吳彬

(1.定安縣人民醫(yī)院 骨科，海南 定安 571200； 2.海南省人民醫(yī)院 骨科，海南 ?？?570311)

骨肉瘤是原發(fā)于骨的惡性腫瘤，好發(fā)部位為長(zhǎng)骨末端?；颊吣挲g多在25歲以下，而且男性患者比例高于女性[1]。肺是骨肉瘤轉(zhuǎn)移最常見的部位，且肺轉(zhuǎn)移后患者的生存率僅為30%左右[1]。目前的臨床治療措施中，除了對(duì)骨肉瘤進(jìn)行手術(shù)直接切除外，化療也是重要的治療方式。臨床常用的骨肉瘤化療藥物包括順鉑和甲氨蝶呤等[2]，但化療藥物常有骨髓功能抑制、神經(jīng)損傷和肝腎損傷等各種毒副作用，且容易產(chǎn)生藥物耐受，影響治療效果[3- 6]。因此積極探索和開發(fā)新的安全高效的治療藥物成為骨肉瘤治療的關(guān)鍵領(lǐng)域之一，而傳統(tǒng)中藥單體以其高效低毒的優(yōu)勢(shì)引起研究者的重視。半枝蓮堿(scutebarbatine，SBT)是來源于中藥半枝蓮的二萜類生物堿，具有抗炎和抗菌等作用[7- 8]。此外，SBT也具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)肺癌、白血病等多種腫瘤具有明顯的抑制作用[9- 11]。但SBT對(duì)骨肉瘤是否也有抑制作用、其機(jī)制如何，目前缺乏相關(guān)研究。本研究將從細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲這4個(gè)方面入手，分析SBT對(duì)骨肉瘤細(xì)胞是否具有抑制作用，并對(duì)這種抑制作用可能的分子機(jī)制進(jìn)行初步解析，以期為臨床開發(fā)更加安全有效的治療骨肉瘤的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細(xì)胞株MG63、143B和Saos- 2購(gòu)自ATCC(American Type Culture Collection)。所有細(xì)胞放置于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清(FBS，Hyclone公司)、100 U·ml-1青霉素和100 μg·ml-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)培養(yǎng)，并進(jìn)行常規(guī)傳代。

1.2 主要試劑和材料

四甲基偶氮唑鹽(MTT)、蛋白提取試劑盒、細(xì)胞裂解液(RIPA)、鈉鹽(BCA)蛋白定量試劑盒、十二烷基磺酸鈉(SDS)購(gòu)自重慶升博科技有限公司，結(jié)晶紫染液、牛血清白蛋白(BSA)和Horchest 33258染液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Transwell小室、熒光素素酶底物、ECL顯影液、PVDF膜和基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)一抗B淋巴細(xì)胞瘤- 2基因相關(guān)啟動(dòng)子(BAD)、B淋巴細(xì)胞瘤- 2基因(BCL2)、活化的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase 3)、β- 連環(huán)蛋白(β- catenin)、原癌基因(C- myc)、G1/S- 特異性周期蛋白- D1(Cyclin D1)、糖原合成酶激酶- 3β(GSK3β)、磷酸化GSK3β(p- GSK3β)、GSK3β第9位絲氨酸(Ser9)和β- 肌動(dòng)蛋白(β- actin)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，脂質(zhì)體LipofectAMINE2000購(gòu)自Invitrogen公司。本實(shí)驗(yàn)完成于延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 方法

1.3.1 MTT實(shí)驗(yàn) 143B細(xì)胞按照500個(gè)·孔-1的數(shù)量接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后用不同濃度(10、20、30、40、50 μmol·L-1)SBT處理24 h，加入5 mg·ml-1的MTT溶液20 μl，37 ℃孵箱孵育4 h，棄上清，加入DMSO(100 μl·孔-1)，室溫避光振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處各孔的吸光度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)率(=SBT組OD值/對(duì)照組OD值)。

1.3.2 克隆形成實(shí)驗(yàn) 143B細(xì)胞按500個(gè)·孔-1接種于6孔板，待細(xì)胞充分貼壁后用不同濃度(20、30、40 μmol·L-1)SBT處理，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，徹底棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，4%多聚甲醛固定20 min，隨后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，利用Image J軟件計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)目。

1.3.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 143B細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為95%，用200 μl槍頭在細(xì)胞層上垂直劃線，制造出寬度一致的劃痕，用不同濃度(20、30、40 μmol·L-1)SBT處理，分別在劃痕0和16 h后顯微鏡(40倍)下拍照記錄，利用Image J軟件測(cè)量劃痕寬度并計(jì)算細(xì)胞遷移率[=(0 h劃痕寬度-16 h后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%]。

1.3.4 細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn) 將30 μl基質(zhì)膠稀釋液(DMEM培養(yǎng)基將基質(zhì)膠原液按1∶5的比例稀釋)均勻鋪于小室，隨后放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，使其完全凝固。在小室內(nèi)加入500 μl細(xì)胞懸液(6×104個(gè)·ml-1)，用不同濃度(20、30、40 μmol·L-1)SBT處理，小室放入24孔板培養(yǎng)48 h。用結(jié)晶紫對(duì)侵襲至小室下層的細(xì)胞進(jìn)行染色，顯微鏡(100倍)下拍照記錄，并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 143B細(xì)胞接種在T75(底面積75 cm2)培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)，用不同濃度(20、30、40 μmol·L-1)SBT處理143B細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。提取總蛋白，經(jīng)10% SDS- PAGE分離后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜上，5% BSA封閉1 h，加入一抗，在4 ℃冰箱中孵育過夜，TBST 洗滌3次。加入HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，滴加ECL顯影液并在凝膠成像系統(tǒng)中采集蛋白條帶圖像。

1.3.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 143B 細(xì)胞接種于T25(底面積為25 cm2)培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，進(jìn)行TopLuc質(zhì)粒(反映Wnt/β- catenin信號(hào)中TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性)轉(zhuǎn)染，體系如下：5 μl Lipofectamine2000+ 3 μg TopLuc質(zhì)粒+200 μl DMEM培養(yǎng)液(無FBS無雙抗)，4 h后再換成5 ml的完全DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至融合度90%，胰酶消化細(xì)胞并接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后用不同濃度(20、30、40 μmol·L-1)SBT處理，繼續(xù)培養(yǎng)6和12 h后，按照Promega熒光素酶檢測(cè)試劑盒提供的操作方法檢測(cè)熒光素酶活性的改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0軟件，數(shù)據(jù)作圖采用Graph Pad Prism 5軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SBT抑制人骨肉瘤細(xì)胞株增殖

MTT實(shí)驗(yàn)顯示：SBT可抑制人骨肉瘤癌細(xì)胞株MG63、143B和Saos- 2增殖，使細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，且呈一定濃度依賴性(圖1)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇20、30、40 μmol·L-13個(gè)濃度的SBT進(jìn)行分析。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示：SBT可抑制143B細(xì)胞的克隆形成(圖2A)，使細(xì)胞克隆形成數(shù)減少(圖2B)。以上結(jié)果提示，SBT可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

a P<0.05； b P<0.01

圖2 SBT對(duì)143B細(xì)胞克隆形成的影響 A. SBT對(duì)143B細(xì)胞克隆形成的影響(結(jié)晶紫染色)； B. SBT對(duì)143B細(xì)胞克隆形成的影響(克隆形成數(shù)，a P<0.01)

2.2 SBT促進(jìn)143B細(xì)胞凋亡

Horchest 33258染色結(jié)果顯示：SBT可誘導(dǎo)143B細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、碎裂和染色質(zhì)聚集等高亮熒光現(xiàn)象(圖3A、B)。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示：SBT處理后，促凋亡分子BAD蛋白水平增加，而凋亡抑制分子BCL2蛋白水平下降，細(xì)胞凋亡執(zhí)行者caspase 3的活性形式cleaved caspase 3蛋白水平增加(圖3C)。以上結(jié)果提示，SBT可促進(jìn)143B細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖3 SBT對(duì)143B細(xì)胞凋亡的影響 A. SBT對(duì)143B細(xì)胞凋亡的影響(Horchest 33258染色×100)； B. SBT對(duì)143B細(xì)胞凋亡的影響(凋亡率，a P<0.01)； C. SBT對(duì)143B細(xì)胞凋亡相關(guān)分子的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

2.3 SBT抑制143B細(xì)胞遷移和侵襲

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SBT抑制143B細(xì)胞遷移，使劃痕愈合延遲(圖4A、B)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SBT可抑制143B細(xì)胞的侵襲，使穿過小室的細(xì)胞數(shù)目減少(圖4C、D)。以上結(jié)果提示，SBT可抑制143B細(xì)胞的遷移及侵襲。

圖4 SBT對(duì)143B細(xì)胞遷移和侵襲的影響 A、B. SBT對(duì)143B細(xì)胞遷移的影響(劃痕實(shí)驗(yàn)×40，a P<0.05，b P<0.01)； C、D. SBT 對(duì)143B細(xì)胞凋亡的影響(Transwell小室實(shí)驗(yàn)×100，c P<0.01)

2.4 SBT抑制143B細(xì)胞中Wnt/β- catenin信號(hào)途徑的活化

為了驗(yàn)證SBT參與了骨肉瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制過程,我們利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和蛋白質(zhì)印跡法分析了SBT對(duì)Wnt/β- catenin信號(hào)的影響。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示：SBT處理后，TopLuc熒光素酶活性降低(圖5A、B)。進(jìn)一步蛋白質(zhì)印跡法分析證實(shí)：SBT處理后，β- catenin的蛋白水平下調(diào)，β- catenin所直接調(diào)控的下游分子C- myc及Cyclin D1的蛋白水平也相應(yīng)降低(圖5C)。不僅如此，SBT還可抑制Ser9的磷酸化水平(圖5C)。以上結(jié)果提示，SBT可抑制骨肉瘤細(xì)胞Wnt/β- catenin信號(hào)活化。

圖5 SBT對(duì)143B細(xì)胞中Wnt/β- catenin信號(hào)的影響 A、B. SBT 對(duì)143B細(xì)胞中Wnt/β- catenin信號(hào)的影響(熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，a P<0.01)；C.SBT處理36 h對(duì)143B細(xì)胞中Wnt/β- catenin信號(hào)的影響

3 討 論

骨肉瘤是骨骼系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其臨床常用的化療藥物毒副作用較大、易產(chǎn)生耐藥性，因此開發(fā)新的治療藥物有助于提高骨肉瘤的治療效果。SBT是從半枝蓮中提取的生物堿單體，具有明顯的抗腫瘤作用：SBT在體外和小鼠體內(nèi)對(duì)肺癌細(xì)胞A549均具有明顯抑制作用[9]；SBT也可抑制白血病細(xì)胞K562增殖(IC50為42.73 μmol·L-1)[10]。

本研究分析了SBT對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)提示SBT可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn)表明SBT可抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲。caspase 3是凋亡的重要執(zhí)行者，而cleaved caspase 3則是其活性形式[12]。BAD是經(jīng)典的促凋亡蛋白，而BCL2則為關(guān)鍵的抗凋亡蛋白[13]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，往往可檢測(cè)到cleaved caspase 3、BAD和 BCL2的變化，并由此作為細(xì)胞發(fā)生凋亡的特征性標(biāo)志。我們通過蛋白質(zhì)印跡法分析發(fā)現(xiàn)，SBT可增加cleaved caspase 3和BAD的蛋白水平，降低BCL2蛋白水平，而Horchest 33258染色分析發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞核出現(xiàn)核碎裂、核固縮等凋亡的細(xì)胞核形態(tài)表現(xiàn)，表明SBT可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。上述結(jié)果提示，SBT對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲均具有較好的抑制作用，而對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡則具有一定的促進(jìn)作用。

在骨肉瘤中常有Wnt/β- catenin 信號(hào)的持續(xù)激活[14- 15]。利用藥物抑制Wnt/β- catenin信號(hào)途徑[16- 17]，或小干擾RNA靶向抑制β- catenin表達(dá)[18]，均可相應(yīng)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。基于此，在機(jī)制研究中我們著眼于分析SBT對(duì)Wnt/β- catenin 信號(hào)的影響。首先熒光素酶報(bào)告基因顯示SBT可抑制Topluc熒光素酶活性，初步提示SBT可抑制Wnt/β- catenin 信號(hào)。蛋白質(zhì)印跡法分析發(fā)現(xiàn)SBT可使骨肉瘤細(xì)胞Wnt/β- catenin信號(hào)中關(guān)鍵分子β- catenin蛋白減少，繼而使得β- catenin下游靶分子c- Myc和Cyclin D1蛋白水平降低。GSK3β是β- catenin的負(fù)向調(diào)控因子，當(dāng)Ser9磷酸化后，GSK3β降解β- catenin的活性降低[19]，而我們通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SBT可抑制GSK3β的Ser9磷酸化，由此推測(cè)：SBT可通過抑制GSK3β的Ser9磷酸化，繼而促進(jìn)GSK3β對(duì)β- catenin的降解，使得β- catenin水平降低，最終導(dǎo)致Wnt/β- catenin信號(hào)受到抑制。上述結(jié)果提示：SBT可能通過抑制骨肉瘤細(xì)胞Wnt/β- catenin信號(hào)途徑抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)其發(fā)生凋亡。

本研究初步證實(shí)SBT可抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲而促進(jìn)其凋亡。這可能與SBT抑制GSK3β的Ser9磷酸化，增強(qiáng)β- catenin負(fù)向調(diào)控分子GSK3β的活性，從而降低β- catenin蛋白水平，使得Wnt/β- catenin信號(hào)受到抑制有關(guān)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)探討SBT對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中其他信號(hào)途徑如TGFβ、Hedgehog、p53、Cox2、JAK- STAT、NF- κB、MAPK和PI3K/AKT信號(hào)途徑等腫瘤相關(guān)信號(hào)途徑的影響，為深入闡明SBT抑制骨肉瘤的分子機(jī)制從而用于骨肉瘤的治療奠定基礎(chǔ)。