17p13.3微缺失/微重復(fù)與胎兒臨床表型差異的遺傳學(xué)分析
——附五例報(bào)告

楊瀅，朱湘玉，王景美，荊秀娟，顧雷雷，劉威，王皖駿，王亞平，李潔

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210008； 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院病理科，江蘇 南京 210008； 3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室，江蘇 南京 210093)

17p13.3單倍體不足或重復(fù)與罕見遺傳病表型發(fā)生相關(guān)。根據(jù)異常染色體片段所含的關(guān)鍵基因不同，17p13.3區(qū)域微缺失或重復(fù)引起的主要表型異常分為米勒·迪克綜合征(Miller- Dieker syndrome，MDS)、孤立性巨腦回畸形(isolated lissencephaly sequence，ILS)[1- 3]、17p13.3微重復(fù)綜合征Ⅰ型和17p13.3微重復(fù)綜合征Ⅱ型[4- 6]。

基因型- 表型關(guān)聯(lián)分析研究表明，17p13.3區(qū)域是智力殘疾、顱面缺損、癲癇和一些罕見癥狀的致病區(qū)域。本研究采用染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis, CMA)發(fā)現(xiàn)5個(gè)病例17p13.3區(qū)域微小基因組拷貝數(shù)改變，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real- time polymerase chain reaction, q- PCR)和熒光原位雜交技術(shù)(metaphase fluorescenceinsituhybridization, FISH)，對(duì)異常片段的親本來(lái)源進(jìn)行檢測(cè)，探討該區(qū)域遺傳物質(zhì)不均衡與臨床表型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例一般資料

本研究的5個(gè)病例來(lái)自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，患兒親屬均簽署了遺傳學(xué)檢查知情同意書。其中病例1、2和3是經(jīng)腹穿刺的羊水標(biāo)本，病例4是流產(chǎn)胚胎，病例5是引產(chǎn)胎兒皮膚組織。

1.1.1 病例1 G1P0，孕22周，單絨毛膜雙羊膜囊雙胎之一(選擇性生長(zhǎng)受限 Ⅱ 型，胎兒鏡下行減胎術(shù)后所留胎兒)。胎兒左側(cè)側(cè)腦室后角10.4 mm，右側(cè)側(cè)腦室后角9.2 mm，胎兒大小符合孕周。父母非近親婚配，自然妊娠，孕期未接觸有毒或致畸劑，無(wú)明顯遺傳病家族史。

1.1.2 病例2 G1P0，體外受精(IVF)胎兒，孕22周，超聲檢查胎兒大小符合孕周，有先天性心臟病室間隔缺損(ventricular septal defect, VSD)(圖1A、B)，父母非近親婚配，IVF妊娠，孕期未接觸有毒或致畸劑，無(wú)明顯遺傳病家族史。

圖1 病例2胎兒超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果 A.VSD，箭頭所指為室間隔近左室流出道處見回聲失落；B.箭頭所指為穿隔血流信號(hào)。RV為右心室，LV為左心室，AO為主動(dòng)脈

1.1.3 病例3 G2P0，20周胎兒，因孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前檢測(cè)(noninvasive prenatal test，NIPT)提示17p13.3缺失行羊膜腔穿刺，超聲檢查胎兒生長(zhǎng)發(fā)育符合孕周。父母非近親婚配，此次系自然妊娠，孕期未接觸有毒或致畸劑。孕婦2018年因胎兒先天性心臟病引產(chǎn)1次。孕婦本人順產(chǎn)所生，1歲說(shuō)話，1歲走路，初中畢業(yè)。身高160 cm，體重63 kg，頭圍 55 cm，有輕微特殊面容(雙眼略下斜，鼻梁塌陷寬大，短鼻，鼻孔略上翻，雙耳位低，上唇肥厚，嘴角下彎)，雙手掌紋無(wú)特殊，無(wú)雙側(cè)小指內(nèi)彎，與人交流略差，生活可自理，輕度智力低下[根據(jù)心理教育評(píng)定量表(psycho- educational profile，PEP)評(píng)估]。配偶無(wú)特殊面容，孕婦及配偶胸部CT、腹部超聲、超聲心動(dòng)圖、血常規(guī)、肝腎功能均未見明顯異常。家系其他成員無(wú)特殊表現(xiàn)。

1.1.4 病例4 G3P0，孕10周稽留流產(chǎn)組織。孕婦2017年人工流產(chǎn)1次，2018年胚胎停止發(fā)育1次(原因不明)。

1.1.5 病例5 G1P0，孕23周引產(chǎn)胎兒，女性，因孕22周超聲檢查提示腹圍相當(dāng)于20+周(圖2A)、左心發(fā)育不良綜合征、左心偏小(圖2B)、主動(dòng)脈瓣及瓣后狹窄(圖2C)、心軸左偏(圖2D)而引產(chǎn)。引產(chǎn)兒尸檢：體重446 g(體重過(guò)輕，小于第1百分位數(shù)區(qū)間)，其余各項(xiàng)生長(zhǎng)參數(shù)符合23周胎兒。面容輕度異常(雙眼線下斜，鼻梁塌陷，寬大，短鼻，鼻孔略上翻，雙耳位低，上唇肥厚)(圖3A、B)。未見第5指內(nèi)彎。左心發(fā)育不良(左心室約為右心室1/3大小)，主動(dòng)脈狹窄(主動(dòng)脈周徑0.6 cm，肺動(dòng)脈周徑1.2 cm)，主動(dòng)脈弓離斷(降主動(dòng)脈與主動(dòng)脈弓不連續(xù))。頭部與神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)特殊表現(xiàn)。鏡下觀察各重要臟器無(wú)特殊表現(xiàn)。胎兒父母非近親婚配，系自然妊娠，孕期未接觸有毒或致畸劑。男方(父本)的姐姐32歲，智力低下，記憶力差，月經(jīng)未潮；男方母親有3次人工流產(chǎn)史。

圖2 病例5胎兒超聲檢查陽(yáng)性結(jié)果 A.腹圍151.9 mm(相當(dāng)于20+周)； B.四腔心切面，左心明顯小于右心； C.主動(dòng)脈瓣瓣環(huán)徑1.96 mm，升主動(dòng)脈內(nèi)徑2.84 mm； D.心軸左偏。GA為孕周，RA為右心房，LA為左心房

圖3 病例5 引產(chǎn)胎兒外觀 A.大體觀； B.面部側(cè)面觀，輕度異常面容，耳位低

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CMA檢測(cè) 在超聲引導(dǎo)下，采集病例1、2、3中孕期羊水10 ml，同時(shí)采集胎兒父母的新鮮外周血1 ml(EDTA抗凝)，病例4的樣本為稽留流產(chǎn)的絨毛10 g，病例5的樣本為引產(chǎn)胎兒的皮膚0.5 cm2大小。采用全基因組DNA提取試劑盒(Qiagen，德國(guó))抽提DNA。病例3的母親存在輕度智力低下以及輕微的特殊面容，進(jìn)一步應(yīng)用CMA檢測(cè)技術(shù)對(duì)病例3的父母進(jìn)行檢測(cè)。常規(guī)抽提DNA，應(yīng)用Cyto scan 750 k芯片(Affymetrix，美國(guó))進(jìn)行全基因組芯片雜交。查閱PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)、DGV 數(shù)據(jù)庫(kù)(database of genomic variants)、Decipher數(shù)據(jù)庫(kù)(database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resources)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的致病性進(jìn)行分析。

1.2.2 異常片段親本來(lái)源分析 根據(jù)CMA檢測(cè)結(jié)果以及各家系臨床表現(xiàn)，選用不同的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行異常片段的驗(yàn)證和判斷其來(lái)源。

q- PCR(SYBR Green法)：設(shè)立正常對(duì)照(經(jīng)過(guò)CMA檢測(cè)驗(yàn)證的正常男性DNA標(biāo)本)。根據(jù)病例1、2、3的異常片段設(shè)計(jì)引物，選取片段內(nèi)基因2個(gè)，片段外基因1個(gè)(PMP22)，引物設(shè)計(jì)采用Primer 3工具。試驗(yàn)儀器采用StepOnePlusTMq- PCR系統(tǒng)(Life Technologies，美國(guó))，內(nèi)參為DNA拷貝數(shù)穩(wěn)定的GAPDH基因。qPCR引物見表1。

表1 q- PCR引物序列

病例4和5均存在多個(gè)片段的異常，涉及除17p13.3缺失外的其他染色體重復(fù)，根據(jù)CMA檢測(cè)結(jié)果，分別選用商品化探針(17p13.1，17號(hào)ter、10號(hào)ter、6號(hào)ter)，應(yīng)用FISH檢測(cè)技術(shù)對(duì)病例4、5父母的外周血染色體進(jìn)行FISH檢測(cè)，判斷是否存在染色體結(jié)構(gòu)異常。

2 結(jié) 果

2.1 CMA檢測(cè)結(jié)果及親本來(lái)源分析

見表2。

表2 CMA檢測(cè)結(jié)果及親本來(lái)源分析

5例17p13.3區(qū)域DNA片段拷貝數(shù)異常病例中，17p13.3微重復(fù)綜合征(Ⅱ型)1例(病例1)，臨床意義不明的染色體拷貝數(shù)變異(variants of unknown significance，VOUS)1例(病例2)，MDS綜合征3例(病例3、4、5)。病例1的17p13.3微重復(fù)為新發(fā)突變，17p13.2 p13.3微重復(fù)為母源；病例2的17p13.3微重復(fù)為母源；病例3的17p13.3微缺失為母源(CMA檢測(cè)驗(yàn)證)；病例4存在6p25.3 1.5 mb重復(fù)，17p13.3p13.2 3.98 mb缺失，17p13.2p12 8.17 mb重復(fù)，為新發(fā)突變。病例5存在10q26.12 q26.3 13.67 mb重復(fù)，17p13.3 2.27 mb缺失，來(lái)源于t(10；17)的父親。

2.2 結(jié)局隨訪

病例1、3、5選擇了終止妊娠。病例2足月順產(chǎn)男孩，出生后因VSD行修補(bǔ)手術(shù)，目前1歲半，生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)發(fā)育正常。病例4為早期胚胎停止發(fā)育。

3 討 論

在人類染色體中，17號(hào)染色體DNA(基因)序列存在較高密度的重復(fù)片段，且包含的基因較多。在17p區(qū)域，超過(guò)23%的部分是由低拷貝重復(fù)序列(low copy repeat，LCR)組成[7]。LCR的存在為非等位同源重組(non allelic homologous recombination，NAHR)的發(fā)生提供了可能[8- 10]。染色體17p13.3內(nèi)發(fā)現(xiàn)的較高密度LCR使其成為“重組熱點(diǎn)”，因此在此區(qū)段更容易發(fā)生NAHR，導(dǎo)致該區(qū)域遺傳物質(zhì)出現(xiàn)缺失和重復(fù)。

17號(hào)染色體的不穩(wěn)定性導(dǎo)致了多種疾病，包括腦形態(tài)障礙、精神疾病、癲癇和腫瘤的發(fā)生[9，11- 13]。17p13.3區(qū)域存在4種主要致病性異常，分別是MDS、ILS、17p13.3微重復(fù)綜合征Ⅰ型和Ⅱ型。位于染色體17p13.3上的PAFAH1B1、YWHAE和CRK基因是區(qū)分的關(guān)鍵。PAFAH1B1基因(601545)編碼血小板活化因子乙酰水解酶細(xì)胞內(nèi)Ⅰb亞型的非催化亞單位，其缺失導(dǎo)致經(jīng)典型無(wú)腦回畸形[2]。YWHAE基因(605066)編碼14.3.3蛋白，在神經(jīng)元遷移和軸突生長(zhǎng)中起調(diào)節(jié)作用。CRK基因(164762)編碼受體信號(hào)蛋白，參與顱面發(fā)育和神經(jīng)元遷移[14- 15]。

17p13.3區(qū)域的微重復(fù)/微缺失綜合征為罕見疾病，其臨床表型的大部分信息是基于對(duì)個(gè)案分析獲得。本研究中的5例胎兒/胚胎和病例3的母親均涉及17p13.3區(qū)域的微缺失或微重復(fù)，根據(jù)所涉及的關(guān)鍵基因(PAFAH1B1、YWHAE、CRK基因)，對(duì)5個(gè)病例的CMA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了分析及遺傳學(xué)診斷(表2)。檢出多為MDS(4例：病例3及其母親、病例4、病例5)，其中1例MDS病例涉及了PAFAH1B1基因(病例4，早期胚胎停止發(fā)育)，其余3例來(lái)自2個(gè)家系，均未涉及PAFAH1B1基因，考慮為PAFAH1B1遠(yuǎn)端的MDS。病例1為17p13.3微重復(fù)綜合征Ⅱ型，病例2 為VOUS。

文獻(xiàn)中有關(guān)PAFAH1B1遠(yuǎn)端MDS的相關(guān)研究較少[2，5，16- 23]，國(guó)內(nèi)見2篇報(bào)道[16，23]，涉及28個(gè)病例[16，20，23]。將本研究中提供詳細(xì)表型的病例3、病例3的母親及病例5與檢索獲得的病例進(jìn)行了整合分析(計(jì)31例)，其中面部異常26例(主要面部特征包括鼻根寬大、短鼻、鼻孔上翻、大而突出的上嘴唇、低耳位)，5例未提供信息；輕中度智力低下24例，7例胎兒無(wú)法提供信息；神經(jīng)系統(tǒng)未見明顯異常12例，腦白質(zhì)異常14例，未提供信息5例，胎兒期表現(xiàn)為明顯異常的2例；宮內(nèi)發(fā)育遲緩13例，出生后生長(zhǎng)發(fā)育遲緩22例；其他系統(tǒng)未見明顯異常17例，先天性心臟病6例(動(dòng)脈導(dǎo)管未閉3例，VSD 2例，左心發(fā)育不良1例)；第5指內(nèi)側(cè)彎8例。提示，相較于其他的MDS患者，PAFAH1B1遠(yuǎn)端的MDS癥候群患者存在MDS的面容特征，但臨床表現(xiàn)相對(duì)較輕，可以沒有明顯的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常?；跈z測(cè)手段的局限性，絕大部分該類患者在胎兒期缺乏特征性表現(xiàn)。

病例4是稽留流產(chǎn)標(biāo)本，CMA檢出6p25.3 1.5 mb重復(fù)，17p13.3p13.2 3.98 mb缺失，17p13.2p12 8.17 mb重復(fù)，系新發(fā)。6p末端微重復(fù)以及17p13.2p12重復(fù)的相關(guān)研究報(bào)道極少，截至2021年4月，Decipher 數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有3例類似片段的6p末端重復(fù)相關(guān)病例(290372、314724、386921)，2例類似片段的17p13.2p12重復(fù)病例(394097、396211)，且均無(wú)早期胚胎停止發(fā)育的臨床表現(xiàn)。關(guān)于MDS患者早期胚胎停止發(fā)育研究報(bào)道有4例[24- 27]，但相互之間觀點(diǎn)存在差異。其中一項(xiàng)研究分析了14個(gè)涉及MDS的家族中妊娠情況，研究顯示MDS胎兒的自然流產(chǎn)率與人群自然流產(chǎn)率沒有顯著差異[25]。病例4異常片段所涉及的基因包括6p25.3重復(fù)區(qū)域中的FOXQ1(612788)、FOXC1(601090)，17p13.3p13.2缺失區(qū)域中的MNT(603039)、PAFAH1B1(601545)、CLUH(616184)、P2RX5(602836)、HASPIN(609240)，以及17p13.2p12區(qū)域中的PFN1(176610)、CTDNEP1(610684)、KCTD11(609848)、TP53(191170)、KDM6B(611577)。鑒于上述基因在胚胎發(fā)育中的重要作用，其拷貝數(shù)異?？赡芘c病例4早期胚胎停止發(fā)育的發(fā)生有關(guān)。

病例5除MDS常見面部異常外，存在左心發(fā)育不良綜合征，體重過(guò)輕。CMA檢出10q26.12q26.3 13.67 mb重復(fù)，17p13.3 2.27 mb缺失，來(lái)源于其攜帶t(10；17)平衡易位的父親。考慮10號(hào)染色體和17號(hào)染色體的不平衡現(xiàn)象是其家中其他智力低下患者的致病原因。與本中心已報(bào)道的MDS患兒及其同胞MDS胎兒[16]的10q26.13q26.3 9.73 mb重復(fù)、17p13.3 1.68 mb缺失相比，兩者所涉及的遺傳物質(zhì)異常區(qū)段存在相似性，而臨床表現(xiàn)存在差異(已報(bào)道的病例無(wú)先天性心臟病的臨床表現(xiàn))。Decipher數(shù)據(jù)庫(kù)中涉及左心發(fā)育不良的17p13.3缺失病例僅有1例(395121)。病例5同時(shí)存在10p26區(qū)域拷貝數(shù)異常，涉及ATE1基因(607103)。Kwon等[28]證明，在ATE1基因敲除的小鼠胚胎心臟中，約90%左右心室心肌發(fā)育不良。因此考慮病例5攜帶的10p26末端部分三體可能參與了其左心發(fā)育不良的形成。

本研究依托于多種遺傳學(xué)檢測(cè)方法，明確了5例胎兒的遺傳學(xué)基礎(chǔ)以及親本來(lái)源，為遺傳咨詢提供了確切的遺傳學(xué)證據(jù)。對(duì)4例MDS患者的表型和基因型進(jìn)行了相關(guān)分析，為PAFAH1B1遠(yuǎn)端的MDS癥候群提供了新的案例。