北方寒區(qū)阿特拉津降解菌分離鑒定

楊皓昀 高梓峰 雷杰云 陳忠誠 欒貴東 羅安恒 劉明

摘 要：利用富集培養(yǎng)法，從北方寒區(qū)施用阿特拉津的玉米地土壤中，分離出1株阿特拉津高效降解菌GH1，結(jié)合其形態(tài)、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析，將菌株GH1初步鑒定為產(chǎn)脲節(jié)桿菌（Paenarthrobacter ureafaciens）。菌株GH1在36h內(nèi)能完全降解100mg/L的阿特拉津，這為北方寒區(qū)特定環(huán)境中阿特拉津的修復(fù)提供了良好的菌株資源。

關(guān)鍵詞：阿特拉津;生物降解;16S rRNA;產(chǎn)脲節(jié)桿菌

中圖分類號(hào) X592? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）19-0018-03

Isolation and Identification of Atrazine Degrading Bacteria from Northern Cold Region

YANG Haoyun et al.

（College of Agronomy， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

Abstract： An atrazine degrading strain GH1 was isolated from the soil of maize field applied with atrazine by enrichment culture method in the cold region of northern China. Combined with its morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis， the strain GH1 was identified as Paenarthrobacter ureafaciens. The strain GH1 can completely degrade 100mg/L atrazine within 36h， which provides a good strain resource for atrazine remediation in the unique environment of northern cold region.

Key words： Atrazine; Biodegradation; 16S rRNA; Paenarthrobacter ureafaciens

雜草嚴(yán)重制約著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。隨著農(nóng)藥的發(fā)展，除草劑逐漸成為雜草防除的重要措施。黑龍江是我國農(nóng)業(yè)大省，人均耕地面積0.31hm2，是全國的3倍。在地多人少的特定條件下，除草劑的用量非常大，占農(nóng)藥用量的85%以上，居全國第1位。阿特拉津（Atrazine）又名莠去津，是一種三氮苯類除草劑，廣泛用于玉米、高粱田等的一年生闊葉雜草的防除。由于其雜草防除效果較好，價(jià)格相對(duì)便宜，投入產(chǎn)出比較高，在東北寒區(qū)的禾本科作物田除草劑中占據(jù)非常重要的地位。但隨著阿特拉津的連年、超量使用，對(duì)人類的生存健康、后茬作物的安全、黑土資源及生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，并且在部分地區(qū)已經(jīng)影響到大豆玉米輪作制度的正常開展[1]。

目前，關(guān)于阿特拉津的降解，科研人員開展了大量研究，包括物理、化學(xué)及生物方法等，其中生物修復(fù)由于其對(duì)環(huán)境友好、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，具有很強(qiáng)的優(yōu)越性。目前，已有大量的阿特拉津降解菌被分離出來，如假單胞菌、土壤桿菌、腸桿菌、諾卡氏菌、根瘤菌、紅球菌、節(jié)桿菌等[2-6]，但適合北方寒區(qū)的降解菌株資源還十分有限。本研究從從北方寒區(qū)長期施用阿特拉津的玉米田中采集土壤樣品，進(jìn)行降解菌分離鑒定以及降解率的測定，以期獲得適應(yīng)當(dāng)?shù)靥厥猸h(huán)境的降解菌株，為阿特拉津污染環(huán)境的修復(fù)提供備選資源菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO4 0.9g、Na2HPO4·12H2O 6.5g、葡萄糖3g、MgSO4 0.2g、NaCl 0.4g，蒸餾水定容至1L，調(diào)節(jié)pH至7.0，115℃條件下滅菌20min。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g，蒸餾水定容至1L，121℃條件下滅菌20min。

1.1.2 土壤樣品 土樣采集自大興安嶺某農(nóng)場長期施用阿特拉津的玉米田中。

1.1.3 儀器 高壓蒸汽滅菌器、潔凈工作臺(tái)、立式智能精密搖床、生化培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、高效液相色譜儀、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降解菌的富集與分離 在潔凈工作臺(tái)中將10g土樣加入到含有50mg/L阿特拉津的100mL無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃、150r/min富集培養(yǎng)7d，然后取10mL富集培養(yǎng)液接種到100mL新鮮的無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在其他條件不變的情況下，逐漸增加無機(jī)鹽培養(yǎng)基中阿特拉津濃度，分別為100、150、200、250、300、350、400、450、500mg/L，30℃、150r/min富集培養(yǎng)7d。富集結(jié)束后，將富集培養(yǎng)液分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍，從中各取0.1mL富集培養(yǎng)液分別涂布于含有100mg/L的阿特拉津的LB固體平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，挑取LB固體平板上產(chǎn)生明顯水解圈的單菌落，并在LB平板上連續(xù)劃線純化培養(yǎng)，直到獲得純化菌株。

1.2.2 阿特拉津的提取及降解率測定 接種OD600=0.5的降解菌懸液1mL于含100mg/L阿特拉津的100mL無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，取5mL培養(yǎng)液與三氯甲烷（色譜純）按照1∶2的比例混合，分離下層有機(jī)相，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)相濃縮并蒸發(fā)至干。最后用甲醇（色譜純）溶液調(diào)節(jié)定容至1mL，用0.22μm的有機(jī)相尼龍膜進(jìn)行過濾至進(jìn)樣瓶，采用高效液相色譜儀檢測阿特拉津濃度并計(jì)算降解率。高效液相色譜儀參數(shù)設(shè)置為：采用反相C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相甲醇水溶液，體積比為70∶30，流速為0.8mL/min，可變波長紫外檢測器檢測波長為225nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為10μL。