嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌德氏亞種計(jì)數(shù)方法的比對(duì)研究

凌莉 許秋貝 陳碧玲 安虹 彭小莉 呂敬章

(1.廣州海關(guān)技術(shù)中心 廣東廣州 510623；2.廈門海關(guān)技術(shù)中心；3.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院；4.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院)

1 前言

嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌德氏亞種是傳統(tǒng)發(fā)酵乳的主要發(fā)酵劑[1]，嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌德氏亞種的不同添加比例造就了發(fā)酵乳的不同口味[2]。研究表明，口感較豐富的發(fā)酵乳中球菌與桿菌的比例一般大于1[3-5]。嗜熱鏈球菌為兼性厭氧菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，對(duì)酸性環(huán)境的耐受性較差[6]。而保加利亞乳桿菌德氏亞種為微需氧菌，有氧環(huán)境下生長(zhǎng)不良，但在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)良好[1，7]。

對(duì)包括嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌德氏亞種在內(nèi)的乳酸菌總數(shù)的計(jì)數(shù)，一般采用MRS瓊脂進(jìn)行厭氧培養(yǎng)[8]，該計(jì)數(shù)方法得到了廣泛運(yùn)用[9]。對(duì)嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)，大多采用M17瓊脂進(jìn)行有氧培養(yǎng)[10-11]，我國(guó)的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用的是MC瓊脂進(jìn)行有氧培養(yǎng)[12]。對(duì)保加利亞乳桿菌德氏亞種的計(jì)數(shù)，大多采用酸化MRS瓊脂進(jìn)行厭氧培養(yǎng)[6，11]。在我國(guó)的乳酸菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)包括保加利亞乳桿菌德氏亞種在內(nèi)的乳桿菌，采用的是MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)法[12]。為比較不同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法對(duì)嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌德氏亞種計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，本文采用MRS瓊脂和酸化MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)，MC瓊脂有氧培養(yǎng)的方法，分別對(duì)含嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌德氏亞種的菌粉以及市售發(fā)酵乳中的乳酸菌計(jì)數(shù)，進(jìn)行了比對(duì)研究。

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

2.1.1 主要試劑

MC瓊脂、MRS瓊脂均(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)；在MRS瓊脂中添加醋酸至pH 5.4，成為酸化MRS。

2.1.2 主要儀器

拍打器：Interscience Bag Mixer 400VW拍擊式均質(zhì)器(法國(guó))；恒溫培養(yǎng)箱：MEMMERT ICP600(德國(guó))；厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)：MARKⅡ(荷蘭)。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)樣品

S菌粉(奶粉基質(zhì)、嗜熱鏈球菌添加量約為107CFU/g)；SL菌粉(奶粉基質(zhì)、嗜熱鏈球菌添加量約為107CFU/g、保加利亞乳桿菌德氏亞種添加量約為106CFU/g)，由江蘇省微康生物科技有限公司提供。不同品牌的市售發(fā)酵乳6份(配料表中只添加嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌德氏亞種2種菌株)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

無(wú)菌取樣25 g樣品置于裝有225 mL無(wú)菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，均質(zhì)2 min，選取2～3個(gè)合適的稀釋度，吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿，然后分別傾注冷卻至48℃的MRS瓊脂、酸化MRS瓊脂，36℃厭氧培養(yǎng)72 h；同時(shí)傾注MC瓊脂，36℃需氧培養(yǎng)72 h。15 min內(nèi)完成從樣品稀釋到平皿傾注。每個(gè)菌粉樣品重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 S菌粉的計(jì)數(shù)結(jié)果及分析

S菌粉的MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)以及MC瓊脂有氧培養(yǎng)的計(jì)數(shù)結(jié)果，均在嗜熱鏈球菌添加量的范圍內(nèi)，但MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)結(jié)果高于MC瓊脂有氧培養(yǎng)的結(jié)果，且二者之間有極顯著性差異(P<0.01)。S菌粉中添加的是嗜熱鏈球菌，該菌為兼性厭氧菌，在有氧及厭氧條件下均可生長(zhǎng)。用MRS瓊脂進(jìn)行厭氧培養(yǎng)的方法，適用于包括嗜熱鏈球菌在內(nèi)的乳酸菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。但是MC瓊脂由于營(yíng)養(yǎng)不足和緩沖能力差，對(duì)嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果偏低[13]，詳見(jiàn)表1。

表1 S菌粉的計(jì)數(shù)結(jié)果

酸化MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果低于MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)結(jié)果，且具有極顯著性差異(P<0.01)，這是由于嗜熱鏈球菌不耐酸的原因[6]。

3.2 SL菌粉的計(jì)數(shù)結(jié)果及分析

SL菌粉中嗜熱鏈球菌添加量約為107CFU/g、保加利亞乳桿菌德氏亞種的添加量約為嗜熱鏈球菌的1/10。由表2可見(jiàn)，SL菌粉的MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)的計(jì)數(shù)結(jié)果，在添加的菌量范圍內(nèi)。MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)結(jié)果高于MC瓊脂有氧培養(yǎng)的結(jié)果，且二者之間有顯著性差異(P<0.05)，這也是由于MC瓊脂有氧培養(yǎng)，對(duì)嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果偏低的原因。

酸化MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果低于MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)結(jié)果，且具有極顯著性差異(P<0.01)，由于嗜熱鏈球菌不耐酸，酸化MRS瓊脂上生長(zhǎng)的是保加利亞乳桿菌德氏亞種，而且其計(jì)數(shù)結(jié)果約為MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)結(jié)果的1/10，這與SL菌粉中乳酸菌的添加量一致。

由于MC瓊脂有氧培養(yǎng)，對(duì)嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果偏低，MC瓊脂計(jì)數(shù)的嗜熱鏈球菌數(shù)與酸化MRS瓊脂計(jì)數(shù)的是保加利亞乳桿菌德氏亞種數(shù)量之和，也小于MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)的計(jì)數(shù)的乳酸菌總數(shù)，且二者之間有顯著性差異(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 SL菌粉的計(jì)數(shù)結(jié)果

SL菌粉的MRS瓊脂平板，有大小2種菌落(圖1)：大菌落為圓形、濕潤(rùn)、灰白色菌落；小菌落中等偏小，邊緣整齊光滑。隨機(jī)挑取大小菌落各10個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果顯示：大菌落均為革蘭氏陽(yáng)性桿菌(圖3)；小菌落均為革蘭氏陽(yáng)性球菌，呈短鏈狀(圖4)。酸化MRS瓊脂上只有一種圓形大菌落，邊緣粗糙(圖2)，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性桿菌。

3.3 市售發(fā)酵乳品的計(jì)數(shù)結(jié)果及分析

從表3數(shù)據(jù)可知，對(duì)于6份不同品牌的市售發(fā)酵乳產(chǎn)品，酸化MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果低于MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)結(jié)果，且具有極顯著性差異(P<0.01)。同時(shí)，MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)結(jié)果高于MC瓊脂有氧培養(yǎng)的結(jié)果，且二者之間有顯著性差異(P<0.05)。另外，MC瓊脂計(jì)數(shù)的嗜熱鏈球菌數(shù)與酸化MRS瓊脂計(jì)數(shù)的是保加利亞乳桿菌德氏亞種數(shù)量之和，也小于MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)的計(jì)數(shù)的乳酸菌總數(shù)，且二者之間有顯著性差異(P<0.05)。

表3 發(fā)酵乳計(jì)數(shù)結(jié)果

4 結(jié)論

嗜熱鏈球菌為兼性厭氧菌，在有氧及厭氧條件下均可生長(zhǎng)，但是不耐酸且對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高，對(duì)嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)一般采用緩沖能力強(qiáng)且營(yíng)養(yǎng)豐富的M17瓊脂[10-11]。雖然MC瓊脂在有氧培養(yǎng)條件下，可抑制常與嗜熱鏈球菌共同作為發(fā)酵劑的保加利亞乳桿菌德氏亞種的生長(zhǎng)，但大量文獻(xiàn)報(bào)道及比對(duì)研究表明[13]，MC瓊脂對(duì)嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果顯著低于M17瓊脂。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MC瓊脂有氧培養(yǎng)的方法對(duì)嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果，也顯著低于MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)的方法。因此，MC瓊脂并不適用于嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)。

因?yàn)槿闂U菌能耐受酸性環(huán)境，所以對(duì)乳桿菌的計(jì)數(shù)大多采用酸化MRS瓊脂進(jìn)行厭氧培養(yǎng)[6，11]。同時(shí)pH 5.4的酸性環(huán)境不利于常和保加利亞乳桿菌德氏亞種共同作為發(fā)酵劑的嗜熱鏈球菌的復(fù)蘇，對(duì)于嗜熱鏈球菌的添加量遠(yuǎn)大于保加利亞乳桿菌德氏亞種的SL菌粉，酸化的MRS瓊脂上生長(zhǎng)的菌落仍以保加利亞乳桿菌德氏亞種為主，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。

MRS厭氧培養(yǎng)的方法常用于乳酸菌總數(shù)的計(jì)數(shù)[8]，采用該方法對(duì)SL菌粉計(jì)數(shù)時(shí)，MRS瓊脂上同時(shí)嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌德氏亞種，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。對(duì)于含有嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌德氏亞種的產(chǎn)品，可采用酸化MRS瓊脂計(jì)數(shù)保加利亞乳桿菌德氏亞種，采用M17瓊脂計(jì)數(shù)嗜熱鏈球菌，其乳酸菌總數(shù)則為酸化MRS計(jì)數(shù)結(jié)果與M17瓊脂計(jì)數(shù)結(jié)果之和。由于厭氧培養(yǎng)MRS瓊脂上可同時(shí)生長(zhǎng)嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌德氏亞種，對(duì)于含有嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌德氏亞種的產(chǎn)品，如果采用MRS瓊脂計(jì)數(shù)結(jié)果與嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)結(jié)果之和，作為乳酸菌總數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果，則會(huì)造成嗜熱鏈球菌的重復(fù)計(jì)數(shù)。