菲對(duì)融合菌株F14胞外聚合物特征的影響

劉怡暄，高 喬，王舒淇，呂岳駿，高于涵，汪 杰，侯 彬，盧 靜

（中北大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，山西 太原 030051）

0 引言

多環(huán)芳烴 （Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs）是指2 個(gè)以上苯環(huán)以稠環(huán)形式相連的有機(jī)化合物，它普遍存在于環(huán)境中，性質(zhì)穩(wěn)定，難于降解，且具有潛在的致畸性、致癌性和致突變性[1]。環(huán)境中PAHs 的主要來(lái)源于人類活動(dòng)，如廢物、化石燃料和其他碳?xì)浠衔锏牟煌耆紵⒐I(yè)生產(chǎn)、食品加工過(guò)程以及原油的泄漏等[2]。菲作為PAHs 中的一種重要污染物，常被用于對(duì)PAHs 的實(shí)驗(yàn)研究。微生物修復(fù)技術(shù)因其操作較為簡(jiǎn)單，修復(fù)效果好，對(duì)環(huán)境影響微弱，幾乎無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到專家學(xué)者的關(guān)注，成為去除PAHs 的主要途徑。

微生物在新陳代謝過(guò)程中，分泌出一種附著于微生物表面及周圍環(huán)境的高分子聚合物質(zhì)，稱為胞外聚合物（Extracellular Polymertic Substances，EPS）。它主要由多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成（兩者在EPS 成分中占比為70% ～ 80%），除此之外還包含少量的核酸、腐殖酸等[3-4]。張穎等[5]在研究Arthrobacter sp.JQ-1 菌株胞外聚合物對(duì)不同濃度酞酸酯類化合物的吸附規(guī)律時(shí)，發(fā)現(xiàn)微生物的EPS 表面有非極性官能團(tuán)，其中包括蛋白質(zhì)中的脂肪族化合物、芳香族化合物及多糖中的疏水區(qū)域，這些組分參與了微生物對(duì)酞酸酯類化合物的降解過(guò)程。PAN Xiang-liang 等[6]研究表明，好氧活性污泥產(chǎn)生的EPS 和菲之間的作用是自發(fā)進(jìn)行的，它們之間的結(jié)合主要依靠于疏水作用。LIU An-bo 等[7]研究表明，細(xì)菌產(chǎn)生的EPS 可促進(jìn)土壤中菲進(jìn)行解吸過(guò)程。甄凱等[8]研究表明，Seudomonas sp.DNBe-S1 產(chǎn)生的EPS 可促進(jìn)土壤中苯并芘的降解。

融合菌株F14 是以菲降解菌Sphingomonas sp.GY2B 和芘降解菌Pseudomomas sp.GP3A 為親本，通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建的一株高效降解多環(huán)芳烴的降解菌[9]。與親本相比，該菌株具有更廣的溫度（20 ～40 ℃）和pH 值適應(yīng)范圍（6.5 ～9），對(duì)菲的降解效率更高，而且具有和親本GY2B 不同的菲降解途徑，融合菌株F14 具有2 條菲代謝途徑并且在降解過(guò)程中較少積累有毒中間代謝產(chǎn)物。

基于此，通過(guò)系統(tǒng)研究不同濃度菲誘導(dǎo)下對(duì)融合菌株F14 胞外聚合物 （Extracellular Polymertic Substances，EPS）的影響，包括EPS 中蛋白質(zhì)和多糖含量的變化、對(duì)降解效率與熒光性能的影響，并通過(guò)FTIR 和SEM 進(jìn)一步分析了EPS 表面官能團(tuán)的變化和微觀形貌的變化，闡示融合菌株F14 降解菲的作用機(jī)理，為融合菌株F14 實(shí)地修復(fù)菲污染提供科學(xué)依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及樣品

研究使用的菲（濃度為98%）、甲醇（色譜純）、正己烷（分析純）、二氯甲烷（色譜純）等試劑，均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其余試劑無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液（MSM）：分別取5 mL 磷酸鹽緩沖液 （KH2PO4，8.5 g/L；K2HPO4·H2O，21.75 g/L；Na2HPO4·12H2O，33.4 g/L；（NH4）Cl，5.0 g/L）、3 mL MgSO4溶液（22.5 g/L），1 mL CaCl2溶液（36.4 g/L），1 mL FeCl3溶液 （0.25 g/L），1 mL 微量元素（MnSO4·H2O，39.9 mg/L；ZnSO4·H2O，42.8 mg/L；（NH4）6Mo7O24·4H2O，34.7 mg/L），然后加入超純水定容至1 L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 值為6.8，在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min 后備用。

含有菲的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液（質(zhì)量濃度分別為0，60，100，230 mg/L）：在滅菌的三角瓶中加入不同量的菲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5 g/L，正己烷為溶劑配制），待正己烷揮發(fā)完畢，加入滅菌后的MSM。

實(shí)驗(yàn)菌種：融合菌株F14 利用原生質(zhì)體融合技術(shù)融合而成[9]。

1.2 菲對(duì)融合菌株F14 的馴化

按照10% 的接種量，將融合菌株F14 菌液接種到含有不同質(zhì)量濃度（0，60，100，230 mg/L）菲的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液（總體積為30 mL）中，將其置于30 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min 的搖床培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 后，提取EPS。

1.3 融合菌株F14 的EPS 的提取

采用加熱法提取EPS。首先，取30 mL 融合菌株F14 菌液，于轉(zhuǎn)速為2 000 r/min 低溫冷凍離心機(jī)中離心10 min，丟棄上清液，補(bǔ)充無(wú)菌水至原體積，再于轉(zhuǎn)速為2 000 r/min 離心3 min，丟棄上清液，補(bǔ)充無(wú)菌水至原體積，將上述步驟重復(fù)2 次。然后，將獲得的溶液放入水浴鍋（60 ℃）加熱30 min，再次放入離心機(jī)中，于8 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min，最后將收集的上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，即為EPS 溶液。同時(shí)將部分溶液在低溫冷凍干燥機(jī)中干燥24 h，所得粉末用于后續(xù)檢測(cè)[10]。

1.4 馴化后的EPS 降解菲

取0.2 mL 質(zhì)量濃度為5 g/L 菲的儲(chǔ)備液于三角瓶中，待正己烷揮發(fā)后，分別加入10 mL 上述提取的EPS 溶液，對(duì)照組為10 mL 水，用保鮮膜密封，置于30 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min 搖床中震蕩24 h 后取樣。每組試驗(yàn)設(shè)3 組平行，并將其進(jìn)行編號(hào)，菲質(zhì)量濃度分別為0，60，100，230 mg/L，對(duì)應(yīng)編號(hào)為a,b,c,d，對(duì)照組編號(hào)為0。

1.5 分析方法

1.5.1 EPS 主要成分分析

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)；采用蒽酮-硫酸分光光度計(jì)法測(cè)定多糖[11]。

1.5.2 菲的提取及含量測(cè)定

采用液相萃取法提取菲，首先向樣品中加入等體積的二氯甲烷，振蕩5 min（30 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min），隨后全部轉(zhuǎn)移至分液漏斗，待靜置分層后，將下層有機(jī)相放入燒杯，上述步驟重復(fù)3 次。再使用氮?dú)獯得搩x將溶液吹至近干，最后過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜后全部移入進(jìn)樣瓶中，并用甲醇定容。

使用島津高效液相色譜（HPLC（20A））測(cè)定菲的剩余量，并計(jì)算菲的降解率。

1.5.3 EPS 三維熒光光譜分析

將提取出來(lái)的EPS 溶液進(jìn)行三維熒光測(cè)定，分析不同濃度菲誘導(dǎo)后產(chǎn)生的EPS 蛋白峰的變化情況。

1.5.4 EPS 傅里葉紅外光譜分析

取凍干后的EPS 粉末，使用紅外光譜儀（Thermo Scientific Nicolet iS5）采用KBr 壓片法進(jìn)行測(cè)試，分析不同濃度菲誘導(dǎo)后產(chǎn)生的EPS 主要成分及官能團(tuán)變化。

1.5.5 EPS 形貌特征分析

利用掃描電鏡（ZEISS MERLIN Compact）觀察不同濃度菲誘導(dǎo)后產(chǎn)生的EPS 表面形貌變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度菲誘導(dǎo)EPS 成分的變化

不同濃度菲誘導(dǎo)產(chǎn)生EPS 成分的變化見(jiàn)圖1。菲對(duì)融合菌株F14 的EPS 的產(chǎn)生及成分變化有一定影響。當(dāng)菲質(zhì)量濃度由0 mg/L 增至230 mg/L 時(shí)，EPS 中的蛋白質(zhì)和多糖呈先增后減的變化規(guī)律。當(dāng)菲質(zhì)量濃度為0 mg/L 時(shí)，EPS 中多糖含量大于蛋白質(zhì)含量，當(dāng)菲質(zhì)量濃度由0 mg/L 增至100 mg/L 時(shí)，蛋白質(zhì)和多糖均有不同程度的增加，推斷原因可能是融合菌株F14 為抵御外界不利因素的影響，提高其耐受性，分泌了大量的EPS。當(dāng)菲質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)，蛋白質(zhì)和多糖的濃度分別達(dá)到最大值。而當(dāng)菲質(zhì)量濃度達(dá)到230 mg/L 時(shí)，蛋白質(zhì)和多糖的含量均降低，這說(shuō)明過(guò)高濃度的菲會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒性，從而抑制其生長(zhǎng)，進(jìn)而影響EPS 的分泌。簡(jiǎn)靜儀等[12]研究發(fā)現(xiàn)，隨著加入Zn2+和Cu2+濃度的增加，死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）產(chǎn)生的EPS 呈增加趨勢(shì)，且不同種類的重金屬，脅迫后產(chǎn)生的EPS 成分變化也存在明顯差異。唐蕊等[13]也在不同濃度的苯并[a]芘馴化毛霉的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)隨著污染物濃度的增加，EPS 中的多糖和蛋白質(zhì)含量呈先增后減的趨勢(shì)。

2.2 不同濃度菲誘導(dǎo)對(duì)EPS 降解能力的影響

融合菌株F14 產(chǎn)生的EPS 對(duì)菲也有一定的降解作用，降解效果見(jiàn)圖2。由圖2 可以看出，隨著時(shí)間的變化，不同濃度菲誘導(dǎo)后EPS 對(duì)菲的降解率均呈先高后低的趨勢(shì)，12 h 時(shí)降解率達(dá)到最大值，且菲的誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)，EPS 的降解效果最好。林治岐等[14]提出EPS 對(duì)菲有吸附，主要是通過(guò)EPS 中的疏水區(qū)與菲發(fā)生疏水作用。JIA Chan-yan等[15]通過(guò)對(duì)Zoogloea sp.和Aspergillus niger 產(chǎn)生的EPS 對(duì)土壤中芘降解效果的研究發(fā)現(xiàn)，EPS 對(duì)芘的降解，前期是在EPS 與芘之間的相互疏水作用下，兩者結(jié)合在一起，隨后EPS 中的酶參與了芘的降解過(guò)程。在12 h 內(nèi)，不同濃度菲誘導(dǎo)后的EPS 降解率均有升高，但是隨著時(shí)間的變化，降解率逐漸降低，推斷原因可能是EPS 降解菲的過(guò)程中，先將菲吸附在EPS 表面的吸附位點(diǎn)上，后再由EPS 中的酶進(jìn)行降解，但是酶的產(chǎn)量不足以將吸附位點(diǎn)上的菲完全降解，隨著時(shí)間的變化，未降解的菲又逐漸回到溶液中，從而導(dǎo)致EPS 降解率降低。在24 h 時(shí)，質(zhì)量濃度為0 mg/L 的菲誘導(dǎo)后的EPS 降解效率明顯高于菲的質(zhì)量濃度分別為60 和230 mg/L 的菲，推斷原因可能是EPS 在前期誘導(dǎo)過(guò)程中已與菲結(jié)合，使得EPS 表面吸附位點(diǎn)減少，且消耗了部分蛋白酶，從而導(dǎo)致生物吸附能力降低。而當(dāng)菲的誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為230 mg/L 時(shí)，降解效果減弱，推斷原因可能是過(guò)高濃度的菲會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，影響EPS 的產(chǎn)生。綜上所述，經(jīng)過(guò)菲誘導(dǎo)后的EPS 降解效果會(huì)提高，且菲的質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)降解效果最佳。

2.3 不同濃度菲誘導(dǎo)下對(duì)EPS 三維熒光光譜的影響

不同濃度菲誘導(dǎo)產(chǎn)生的EPS 三維熒光的圖像見(jiàn)圖1。

不同濃度菲誘導(dǎo)產(chǎn)生的EPS 三維熒光的分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同濃度菲誘導(dǎo)下EPS 三維熒光光譜分析結(jié)果

由表1 可以看出，峰A 為酪氨酸蛋白峰：Ex，Em=280，335 nm；峰B 為色氨酸蛋白峰：Ex，Em=230，（330～335）nm。這2 個(gè)峰在菌體形成聚集體和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[16]，且與EPS 中的芳香環(huán)氨基酸結(jié)構(gòu)有關(guān)[17]。

由圖3 和表1 可以看出，當(dāng)菲質(zhì)量濃度由0 mg/L增至100 mg/L，蛋白峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，色氨酸和酪氨酸的含量也逐漸增加，這說(shuō)明菲對(duì)融合菌株F14 產(chǎn)生胞外蛋白起到了顯著的促進(jìn)作用。當(dāng)菲質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)，峰A 和峰B 強(qiáng)度達(dá)到最大，分別為446.0 和573.9；當(dāng)菲質(zhì)量濃度由100 mg/L 增至230 mg/L 時(shí)，蛋白峰強(qiáng)度明顯減弱。分析原因可能是菲處于低濃度時(shí)，不易與菌體充分接觸，菌體可利用的能源物質(zhì)較少，影響菌體的生長(zhǎng)代謝。隨著菲濃度的增加，菌體的代謝增強(qiáng)，分泌出胞外蛋白增多，所以蛋白峰明顯增強(qiáng)，但是菲濃度過(guò)高則會(huì)影響菌體正常分泌胞外蛋白，從而導(dǎo)致蛋白峰減弱。隨著菲的加入，EPS 的蛋白峰強(qiáng)度發(fā)生了變化，直接影響了EPS對(duì)菲的降解作用。ZHU Liang 等[18]在對(duì)不同種類污泥的EPS 提取過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，酪氨酸和色氨酸蛋白峰強(qiáng)度發(fā)生了改變，這表明蛋白質(zhì)在生物代謝降解過(guò)程中起到了主要作用。ZHANG Jing 等[19]得出結(jié)論，1-羥基芘能與牛血清蛋白中的色氨酸殘基發(fā)生鍵合作用。

2.4 不同濃度菲誘導(dǎo)下對(duì)EPS 紅外光譜的影響

為確定不同濃度菲誘導(dǎo)產(chǎn)生EPS 官能團(tuán)的差異，對(duì)EPS 進(jìn)行了FTIR 光譜分析，結(jié)果見(jiàn)表2 和圖4。由表2 和圖4 可以看出，4 000 到1 000 cm-1之間的吸收峰能夠反映出EPS 的基本組成部分，主要是蛋白質(zhì)和多糖[20]。3 400 ～ 3 200 cm-1區(qū)間的吸收峰強(qiáng)而寬，可歸屬為O-H 拉伸振動(dòng)和蛋白質(zhì)的N-H鍵伸縮振動(dòng)吸收峰；位于1656.51 cm-1處的酰胺（O=CN-H）Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1），是蛋白質(zhì)功能組中具有代表性的重要部分，屬于C=O 伸縮振動(dòng)；位于1 550.97 cm-1處的酰胺Ⅱ帶（1 600～1 500 cm-1），是N-H 彎曲振動(dòng)和C-N 拉伸振動(dòng)的耦合產(chǎn)生；羧基的C=O 和C-O 伸縮振動(dòng)峰分別出現(xiàn)在1 403.28 和1 243.65 cm-1；位于1 104.53 cm-1處的是多糖（1 200～1 000 cm-1）的O-H 和C-O-C 的伸縮振動(dòng)。

表2 FTIR 觀察到的不同濃度菲誘導(dǎo)下EPS 主要基團(tuán)

圖4 不同濃度菲誘導(dǎo)下EPS 紅外光譜

對(duì)比可知，3 378.33 cm-1處的吸收峰發(fā)生了輕微移動(dòng)且峰強(qiáng)度明顯減弱，推斷原因可能是N-H 鍵和O-H 鍵參與了對(duì)菲的降解過(guò)程。1 656.51 cm-1處的酰胺Ⅰ帶誘導(dǎo)前是較為尖銳的吸收峰，誘導(dǎo)后，峰的強(qiáng)度先增強(qiáng)后減弱，推斷原因可能是低濃度的菲刺激生成了蛋白質(zhì)，而后隨著菲濃度的增加，菲與EPS的接觸更加緊密，蛋白質(zhì)中的C=O 參與了降解過(guò)程。多糖區(qū)的吸收峰誘導(dǎo)后發(fā)生輕微移動(dòng)，峰的強(qiáng)度也有所變化，說(shuō)明在融合菌株F14 降解菲時(shí)，EPS 中多糖上的O-H 和C-O-C 鍵參與了反應(yīng)。

很多資料表明，由于EPS 含有大量的負(fù)電荷官能團(tuán)如羧基、羥基等，對(duì)有機(jī)污染物有很強(qiáng)的吸附能力[21]。通過(guò)對(duì)紅外光譜圖的分析可知：在融合菌株F14 降解菲的過(guò)程中，主要起作用的基團(tuán)是羥基、氨基、酰胺基團(tuán)和C-O-C 基團(tuán)。

2.5 不同濃度菲誘導(dǎo)對(duì)EPS 形貌特征的影響

不同濃度菲誘導(dǎo)后EPS 的形貌變化情況見(jiàn)圖5。由圖5（a）可以看出，EPS 呈薄片狀，且有明顯的孔隙結(jié)構(gòu)，隨著菲濃度的增加，孔隙在逐漸變小，表面厚度增大，變得光滑圓潤(rùn)，結(jié)構(gòu)密實(shí)，這說(shuō)明為更好的保護(hù)菌體，避免菲的不利影響，促進(jìn)了EPS 的大量產(chǎn)生。WIENS J R 等[22]研究表明：部分金屬離子可以促進(jìn)大腸桿菌、綠胳桿菌等微生物分泌大量的蛋白質(zhì)與多糖。NIELSEN 等[23]認(rèn)為微生物主要是利用松散結(jié)合型胞外聚合物（LB-EPS）和緊密結(jié)合型胞外聚合物（TB-EPS）來(lái)吸附有機(jī)物，與有機(jī)物結(jié)合后，EPS 會(huì)打破原有結(jié)構(gòu)。由圖5（d）可以看出,EPS表面的孔隙數(shù)明顯減少，這不利于與菲的結(jié)合，降解效果會(huì)減弱。

圖5 不同濃度菲誘導(dǎo)后EPS 掃描電鏡

3 結(jié)論

（1）隨著菲誘導(dǎo)濃度的增加，融合菌株F14 產(chǎn)生的EPS 中蛋白質(zhì)和多糖均呈先大后減的變化趨勢(shì)，且當(dāng)菲誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)達(dá)到最大，推斷原因可能是融合菌株F14 為抵御外界不利因素的影響，提高其耐受性，分泌了大量的EPS，但隨著濃度的不斷增加，毒性加大，抑制其生長(zhǎng)。

（2）隨著時(shí)間的變化，經(jīng)不同濃度菲誘導(dǎo)的EPS降解率均呈先高后低的趨勢(shì)，這說(shuō)明在融合菌株F14 降解菲的過(guò)程中，EPS 先是通過(guò)疏水作用與菲結(jié)合，隨后再利用產(chǎn)生的酶參與降解過(guò)程。菲的誘導(dǎo)有利于提高EPS 的降解效果，且質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)降解效果最佳，在12 h 時(shí)，降解率達(dá)到最大值。

（3）在融合菌株F14 降解菲的過(guò)程中，EPS 中的蛋白質(zhì)和多糖參與了反應(yīng)，羥基、氨基、酰胺基團(tuán)和C-O-C 基團(tuán)也發(fā)揮了重要作用。

（4）隨著菲誘導(dǎo)濃度的增加，EPS 的孔隙逐漸變小，表面也變得光滑密實(shí)，EPS 原有結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，推斷原因可能是為有效阻止菲的污染，分泌了大量物質(zhì)，但濃度過(guò)高，孔隙會(huì)明顯減少，不利于吸附降解，從而降解效果減弱。