牛磺熊去氧膽酸對DSS誘導大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用及可能機制＊

蔡達興 黃思付 房太勇

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，隨著國民生活方式日趨西化，近年來我國UC的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。但其病因和發(fā)病機制尚不明確，目前多認為該病的發(fā)生是由遺傳、環(huán)境、微生物和免疫等多種因素相互作用所致。而近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在UC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2]。目前臨床上治療UC的常用藥物為氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及單克隆抗體。然而這些藥物存在著不良反應多、價格昂貴等缺點，使臨床應用受到限制。國外文獻[3]報道，?；切苋パ跄懰崮軌驕p輕腸道炎癥反應和氧化應激，抑制類似炎癥性腸病的腸炎。本實驗采用?；切苋パ跄懰幔═UDCA）干預DSS誘導的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠，比較疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分、結(jié)腸組織損傷指數(shù)（histological index，HI）評分，評判療效。研究ERS相關(guān)指標的變化，探討其可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，清潔級，體重300～350 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號：SCXK（滬）2012-0002]，飼養(yǎng)于泉州醫(yī)學高等?？茖W校實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2016-0001]。

葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulphate Sodium，DSS）購自美國MP biomedicals公司（批號Q8356），?；切苋パ跄懰幔═auroursodeoxycholic Acid，TUDCA）購自美國 Sigma公司（批號102382735），GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、GAPDH一抗、羊抗兔二抗購自美國Abcam公司（批號ab20735、ab229742、ab182412、ab21735、ab176813、ab9536、ab160047）。

1.2 方法

健康成年雄性SD大鼠30只，稱重編號，隨機均分為正常組、模型組、治療組，每組10只。正常組自由飲水，其余兩組大鼠自由飲用5%DSS溶液，7 d建立大鼠實驗性潰瘍性結(jié)腸炎模型。

造模后，正常組、模型組予0.9%氯化鈉注射液灌胃，治療組予用200 mg/kg TUDCA灌胃，藥物溶于0.9%氯化鈉注射液中，1次/d，連續(xù)7 d。第8天深度麻醉處死大鼠，留取結(jié)腸標本。

1.3 觀察指標及評價標準

1.3.1 一般情況及DAI評分 每天固定時間觀察大鼠一般情況，包括飲食、活動、體質(zhì)量改變、大便性狀、便血情況等，并在第7天根據(jù)Wirtz等[4]的標準行DAI評分，具體為，（1）體質(zhì)量下降：無、＜5%、5%～10%、11%～15%分別記分為0、1、2、3、4分；（2）大便形狀：正常大便、不成形松散大便、糊狀大便分別記分為0、2、4分；（3）便血情況：無、隱血便、肉眼血便分別積分為0、2、4分。DAI=（體質(zhì)量下降分數(shù)＋大便性狀分數(shù)＋便血分數(shù)）/3。

1.3.2 病理表現(xiàn)及HI評分 取病變最明顯處結(jié)腸組織，10%甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，參考Dieleman等[5]的標準行HI評分，具體為，（1）潰瘍：無潰瘍、小潰瘍＜3 mm、大潰瘍＞3 mm分別記分為0、1、2分；（2）炎癥：無、輕度、重度分別記分為0、1、2分；（3）肉芽腫：無、有分別記分為0、1分；（4）病變深度：無、黏膜下層、肌層、漿膜層分別記分為0、1、2、3分；（5）纖維化：分別記分為0、1、2分。HI=各分值總和。

1.3.3 結(jié)腸組織 GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP基因蛋白水平檢測 Western-blot檢測大鼠結(jié)腸組織GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP基因蛋白水平。所得蛋白條帶經(jīng)掃描所得灰度值經(jīng)內(nèi)參基因標準化后所得灰度比值。

1.4 統(tǒng)計學處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析和處理，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，組間比較，采用LSD檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠一般情況比較

正常組大鼠飲食、活動正常，體質(zhì)量逐步增加，肛周無黏液便、肉眼血便。模型組大鼠在造模后第2～3天癥狀達高峰，飲食、活動明顯減少，伴毛發(fā)稀疏凌亂，體質(zhì)量下降，部分大鼠肛周出現(xiàn)黏液便、肉眼血便。治療組大鼠在藥物干預后第2天開始，飲食、活動逐步增加，體質(zhì)量逐步回升，大便由黏液便逐漸變?yōu)檐洷悖瑹o肉眼血便。

2.2 三組大鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)、病理表現(xiàn)比較

正常組大鼠結(jié)腸黏膜面光滑，無糜爛、潰瘍。光鏡下，結(jié)腸黏膜上皮細胞排列整齊，腺體完整，隱窩結(jié)構(gòu)正常，杯狀細胞豐富，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠結(jié)腸糜爛、潰瘍，部分增厚粘連，腸管變形。光鏡下，黏膜各層大量中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，腺體破壞，隱窩結(jié)構(gòu)缺失，杯狀細胞明顯減少。治療組大鼠糜爛、潰瘍基本愈合。光鏡下，腺體排列較規(guī)則，見少到中量炎性細胞浸潤，隱窩結(jié)構(gòu)及杯狀細胞較模型組明顯增多，見圖1、圖 2。

圖1 三組大鼠結(jié)腸大體標本

圖2 三組大鼠結(jié)腸組織HE染色（×100）

2.3 三組DAI評分及HI評分比較

模型組、治療組DAI評分均明顯高于正常組（P＜0.05），而治療組低于模型組（P＜0.05）。模型組、治療組HI評分均明顯高于正常組（P＜0.05），而治療組低于模型組（P＜0.05），見表1。

表1 三組DAI評分及HI評分比較 [分，（±s）]

表1 三組DAI評分及HI評分比較 [分，（±s）]

*與正常組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05。

組別 DAI評分 HI評分正常組（n=10） 0.00±0.00 0.00±0.00模型組（n=10） 2.87±0.65* 6.90±1.52*治療組（n=10） 1.13±0.39*# 3.10±1.37*#

2.4 三組大鼠結(jié)腸組織GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP基因蛋白水平表達

模型組、治療組結(jié)腸組織GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平均明顯高于正常組（P＜0.05）；而治療組低于模型組（P＜0.05），見圖3、表 2。

圖3 三組大鼠結(jié)腸組織GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達

表2 三組大鼠結(jié)腸組織GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達 （±s）

表2 三組大鼠結(jié)腸組織GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達 （±s）

*與正常組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05。

組別 GRP78 PERK eIF2α ATF4 CHOP正常組（n=10） 0.201 8±0.041 6 0.258 4±0.065 4 0.291 3±0.079 6 0.190 5±0.081 8 0.324 7±0.073 0模型組（n=10） 0.448 9±0.148 9* 0.497 2±0.115 5* 0.578 5±0.150 5* 0.391 7±0.122 4* 0.658 7±0.131 5*治療組（n=10） 0.317 5±0.119 2*# 0.325 6±0.081 8*# 0.368 9±0.117 1*# 0.267 1±0.069 8*# 0.414 5±1.137 0*#

3 討論

ERS是指細胞受到內(nèi)外因素的刺激時，如缺血、低氧、毒素等，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)、功能的平衡狀態(tài)受到破壞后發(fā)生分子生化的改變，蛋白質(zhì)加工運輸受阻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)累積大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)，細胞會通過一系列信號轉(zhuǎn)導途徑，對其進行應答，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能的恢復。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂持續(xù)，細胞將最終啟動Caspase-12依賴的細胞凋亡程序，這些反應被統(tǒng)稱為未折疊蛋白質(zhì)反應（unfolded protein response，UPR）。UPR主要包括跨膜蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白激酶-1α（inostitol requiring enzyme 1，IRE-1α，又稱核酸內(nèi)切酶）、激活作用轉(zhuǎn)錄因子（activating transcription factor 6，ATF6）和胰真核細胞翻譯起始因子2激酶（pancreatic elF-2 kinase，PERK）在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的三條不同信號通路。當細胞處于穩(wěn)態(tài)時，這三種應激感受蛋白都與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose reg- ulatory protein 78，GRP78）結(jié)合。ERS出現(xiàn)時，GRP78從這三種感受器上解離而去結(jié)合錯誤折疊的蛋白，GRP78表達升高，因而GRP78被廣泛地用作ERS激活的標志物[6]。而這三條信號通路中，PERK所啟動的PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路是十分重要的凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑。與GRP78解離后的PERK通過同源二聚化而磷酸化激活自身，隨后催化底物真核翻譯起始因子2α發(fā)生磷酸化，eIF2α磷酸化后一方面抑制蛋白質(zhì)的翻譯和合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力；另一方面選擇性的誘導轉(zhuǎn)錄活化因子4（the activating transcription factor 4，ATF4）的翻譯表達，最終激活ERS獨特的凋亡標志蛋白CHOP的基因轉(zhuǎn)錄，后者通過調(diào)控死亡受體途徑和線粒體途徑兩大經(jīng)典方式激活凋亡效應子Caspase-3執(zhí)行細胞凋亡發(fā)生[7]。

近年來，越來越多的證據(jù)支持ERS對炎癥性腸?。↖BD）的介導地位。Cao等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導的小鼠結(jié)腸炎實驗中，野生型結(jié)腸炎小鼠發(fā)生ERS，GRP78、ATF4、CHOP表達增加。Hino等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)，DSS誘導的結(jié)腸炎小鼠腸上皮細胞中，ERS標記蛋白GRP78和CHOP表達明顯增加，提示小鼠腸炎中存在著ERS。除動物模型外，在人體研究中也發(fā)現(xiàn)了ERS與UC聯(lián)系的相關(guān)證據(jù)。一項研究表明，UC患者的結(jié)腸標本中，eIF2α通路控制蛋白質(zhì)的翻譯和細胞應激反應[10]。

本研究選用GRP78作為ERS的標志蛋白，用于檢測ERS的程度。研究顯示，與正常組相比，DSS誘導潰瘍性結(jié)腸炎模型組結(jié)腸組織中GRP78蛋白水平明顯升高，提示潰瘍性結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織中存在ERS。并且，模型組大鼠結(jié)腸組織較正常組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平明顯升高，提示PERK通路與UC的發(fā)生發(fā)展可能存在相關(guān)性。這說明DSS誘導的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中ERS起著重要作用。

TUDCA是一種天然膽汁酸酰胺化合物，在體內(nèi)是熊去氧膽酸（UDCA）與牛磺酸結(jié)合形成的一種親水性膽汁酸。同時TUDCA是細胞凋亡的抑制劑，通過干擾細胞凋亡的線粒體上游通路，抑制氧自由基的產(chǎn)生，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應力，穩(wěn)定未折疊蛋白反應[11]。已被證明TUDCA在肥胖，外傷性腦損傷、心臟病、急性腎損傷中是潛在的治療靶點[12-15]。

最近的相關(guān)研究證實，作為分子伴侶，TUDCA可以起到降低體外培養(yǎng)IESs的ERS的作用，而且在動物實驗中，通過TUDCA干預可以改善IBD小鼠模型的腸黏膜炎癥，其機制之一正是由于TUDCA對ERS的調(diào)節(jié)[16]。

本研究通過DSS誘導大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，予TUDCA進行藥物干預，結(jié)果顯示，治療組大鼠一般情況明顯優(yōu)于模型組，其組織病理嚴重程度明顯減低，DAI、HI評分降低，并且治療組大鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平較模型組明顯降低，證明TUDCA對DSS誘導的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型具有治療作用，其機制可能是通過抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路發(fā)揮分子生物學作用，這對于臨床使用TUDCA治療潰瘍性結(jié)腸炎具有重要指導意義。

綜上所述，TUDCA能夠改善DSS誘導的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎，其機制可能是通過抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路發(fā)揮分子生物學作用。這為其臨床應用價值提供一定的理論依據(jù)，但仍需進行大量臨床試驗以進一步證實。