植入前胚胎的短期酒精暴露對植入后胚胎發(fā)育的影響

李歡歡，周鑫，王秋月，于芳芳，王榮，李文雍，張迪

（阜陽師范大學 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037）

過量飲酒會導致酒精中毒、酒精依賴及相關疾病的發(fā)生，并對機體的各個系統(tǒng)產生損傷作用。此外，酒精還具有較強的致畸作用，可使發(fā)育中胚胎的神經細胞發(fā)生凋亡，是導致神經系統(tǒng)發(fā)生缺陷的重要因素之一[1]。隨著近年來孕產期婦女飲酒比例的升高，胎兒罹患胎兒酒精綜合征（FAS）的比例不斷增加，并導致不可逆的胎兒生長發(fā)育損害，表現(xiàn)為一系列病理、生理、行為和智力缺陷，這些缺陷被歸類為“胎兒酒精譜系異常疾病”（FASD）[2-3]。

酒精在人體內在乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的催化下氧化脫氫并產生大量的氧化應激物，升高細胞的氧化應激水平并參與細胞癌變[4-5]。而妊娠期的氧化應激水平升高還會導致胎兒的表觀遺傳發(fā)生改變，影響胎兒的生長發(fā)育[6]。此外，酒精可以通過母胎屏障直接進入子宮及胎兒體內，由于胎兒體內缺少乙醇脫氫酶，導致酒精在胎兒體內富集，對胎兒造成直接的損傷。研究表明，酒精對胎兒的損傷作用具有時間和劑量依賴性[7-8]，由于酒精在日常生活中被廣泛應用，尤其增加了早期胚胎接觸酒精的風險，從而引起嚴重的后果，包括早期胚胎發(fā)育顯著受到抑制和基因組甲基化的改變[9]。胚胎著床是胎生哺乳類動物的胚泡和母體子宮壁結合，建立母子間聯(lián)系并進行物質交換的過程。在前期研究中也已經發(fā)現(xiàn)酒精暴露會顯著影響胚胎的植入[10]。因此，為研究早期胚胎的酒精暴露對胚胎植入的影響，本研究采用體外受精的方法獲得胚胎，在胚胎培養(yǎng)液中添加酒精，采用體外培養(yǎng)的方式建立小鼠早期胚胎酒精暴露模型。通過免疫熒光技術對囊胚期胚胎的譜系分化進行檢測；以及胚胎移植技術對13.5 d 的胎兒和胎盤的生理病理狀態(tài)進行分析，來評價早期胚胎酒精暴露對胚胎著床后的發(fā)育的的影響。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物

實驗動物采用SPF 級的8 周齡以上昆明白雌性小鼠和8～10 周齡ICR 雄性小鼠，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。保持12 小時光周期調控，溫度控制在22～26℃，相對濕度60%～70%。

1.2 實驗試劑

實驗中主要試劑有：小鼠胚胎體外培養(yǎng)液（KSOM，美國Sigma 公司），小鼠胚胎操作液（M2，美國Sigma 公司），小鼠胚胎獲能夜（HTF，美國Sigma 公司），Cdx2、Oct4 一抗（Abcam 公司），山羊抗鼠二抗（Abcam 公司）。

1.3 實驗設備和儀器

實驗中主要的實驗儀器和設備有：體式顯微鏡（日本尼康，SMZ745T），三氣培養(yǎng)箱（Themo，3141），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica，TCS SP5Ⅱ），超凈工作臺（蘇州凈化，SW-CJ-2E）等。

1.4 實驗方法

1.4.1 體外胚胎的獲得

選取8-10 周齡性昆明白雌鼠，腹腔注射10 IU 的PMSG，48 小時后腹腔注射10IU 的HCG 進行超數(shù)排卵，12 小時后采用頸椎脫臼法處死雌鼠，取其輸卵管，在體式顯微鏡下用眼科鑷撕開膨大的壺腹部獲得成熟的MⅡ卵母細胞，將其置于孵育了4-6 小時的小鼠HTF 獲能液中獲能。半小時后采用頸椎脫臼法處死正常交配一周內的雄鼠，取附睪尾放入HTF 中，在附睪尾中段剪開，使精子流出并在HTF 中獲能，卵子獲能1 小時后，加入60-70μL 獲能后的精子懸液，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6 小時后挑出有雙原核的受精卵進行培養(yǎng)。

1.4.2 胚胎培養(yǎng)

將具有雙原核的受精卵分別移至對照組和1.0%酒精組的胚胎培養(yǎng)液中，其中，對照組即為未添加無水乙醇的正常1mL KSOM 培養(yǎng)液；1.0%酒精組即為吸取10 μL 無水乙醇加入到990 μL 正常KSOM 培養(yǎng)液中并吹打均勻后的胚胎培養(yǎng)液，并在5%CO2，37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚，觀察兩組胚胎在各個時期的發(fā)育情況并做好統(tǒng)計。

1.4.3 假孕鼠準備

進行IVF 實驗的當天，選取健康且處于發(fā)情期狀態(tài)的性成熟昆明白雌性小鼠與輸精管切除的雄性小鼠進行交配，并于12 小時后檢查雌鼠陰道栓，見栓的雌鼠作為假孕鼠進行標記備用。

1.4.4 胚胎移植

根據(jù)假孕鼠體重注射麻醉藥（10-15 μL/g），夾腳趾測試麻醉度，待深度麻醉后，找到其子宮所在位置，剪去毛發(fā)，酒精棉球消毒后，剪開皮肉，拉出卵巢和子宮，在子宮角處用移卵針將胚胎移入，每側子宮各10 枚胚胎，縫合傷口并消毒，禁水禁食24 小時觀察其生理狀態(tài)。

1.4.5 免疫熒光

每組選取20 枚形態(tài)相似囊胚，在4%多聚甲醛中室溫固定30 min 以上，0.1%PVA 洗去殘留多聚甲醛，然后用0.5%的TritonX-100 室溫通透30min，0.1% PVA 洗去殘留溶液后在2% BSA 中室溫封閉2 小時，直接轉移至Cdx2 和Oct4 的一抗混合液（1∶200，封閉液稀釋）中，4℃孵育過夜（12-16h），然后用0.1% PVA 清洗3 次，每次5 min，之后轉移至二抗混合液（1∶500，封閉液稀釋）中，37℃孵育1 小時，1% PVA 清洗3 次，每次5 min，Hoechest33342（1∶200，0.1%PVA 稀釋）室溫染核10 min，最后用0.1%PVA 清洗6 次洗去多余染料，將胚胎轉移至含有抗熒光淬滅劑的載玻片上進行壓片，使用共聚焦顯微鏡來獲得輕微壓縮的囊胚中每個熒光團的圖像，其中Hoechst33342激發(fā)波長為405 nm，Cdx2 激發(fā)波長為647 nm，Oct4 激發(fā)波長為488 nm，通過掃描染色后的囊胚調整到飽和熒光強度，同時保持參數(shù)：像素值102 4x1 024，物鏡40x，line3，frame1，Zoom Factor2-3，在同一參數(shù)下獲取不同組別染色后的圖片，使用Image Pro-Plus6.0 及SPASS 軟件進行熒光強度分析。

1.4.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS16.0 對各期胚胎形成率差異進行分析，單因素方差分析，p＜0.05，差異顯著；p＜0.01，差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 E13.5 胚胎發(fā)育情況

在假孕母鼠子宮兩側分別移植10 枚正常組與1.0%酒精組囊胚，避免小鼠后代數(shù)量不因移植囊胚數(shù)量不同而產生顯著性差異。胚胎移植后第10 天剖取胎盤及胎兒，與正常組相比，酒精暴露的早期胚胎移植后難以發(fā)育為成型的胎兒和胎盤（圖1），對兩組胚胎移植后的成型胎兒獲得率進行統(tǒng)計分析（圖2 A B）發(fā)現(xiàn)，相較于正常組，植入前酒精處理的胚胎的植入率顯著降低（p＜0.01）,胎兒獲得率也顯著降低（p＜0.01）。接下來對所得兩組胎兒和胎盤進行稱重統(tǒng)計，結果顯示（圖2 C），與正常組相比，酒精組的胎兒體重顯著降低（p＜0.01）；隨后根據(jù)胎盤形態(tài)和質量對所得胎盤進行分類，其中形態(tài)較好、質量大于0.9 g 的胎盤記為Ⅰ類胎盤，形態(tài)一般、質量小于0.9 g 的胎盤記為Ⅱ類胎盤，在Ⅰ類胎盤中，酒精組胎盤質量顯著低于正常組（p＜0.01）,在Ⅱ類胎盤中，兩組的胎盤質量無顯著差異，酒精組的Ⅱ類胎盤數(shù)量明顯多于正常組。由此說明植入前胚胎的短期酒精暴露會影響胚胎植入后的生長發(fā)育，對其造成損傷。

圖1 正常組與1.0%酒精組E13.5 解剖觀察。A.子宮解剖圖,B.胎兒胎盤解剖圖,C.胎盤解剖圖。

2.2 囊胚分化檢測

胚胎細胞命運決定和分化是胚胎發(fā)育的基礎,其調控機制是發(fā)育生物學重要的研究領域。內細胞團（Inner cell mass,ICM）和滋養(yǎng)層（Trophectoderm,TE）的形成是哺乳動物胚胎發(fā)育命運決定的關鍵。在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中，Cdx2 是TE細胞的標記基因之一，在TE 形成過程中，Cdx2 是TE 發(fā)育所必需的同源盒轉錄因子，Cdx2 敲除胚胎因為無法形成成熟的TE 導致植入失敗，而滋養(yǎng)層的缺失則會導致胚胎無法擴大成腔[11]；Oct4 是內細胞團的標記基因，也是維持胚胎干細胞多能性的關鍵因子，在沒有Oct4 存在的情況下胚胎無法形成ICM,桑葚胚內部細胞被驅動進入滋養(yǎng)層細胞分化。Cdx2 和Oct4 在譜系分化的角色扮演中維持相對地表達平衡，是維持ICM 和ES 所必需的[12]。我們通過檢測Cdx2 和Oct4 在囊胚期細胞中的表達來評價酒精暴露對小鼠早期胚胎發(fā)育和胚層分化的影響。

圖2.E13.5 解剖結果統(tǒng)計。A.胚胎植入率，B.胚胎植入后獲得胎兒比率，C.13.5d 胎兒稱重，D.13.5dⅠ類、Ⅱ類胎盤稱重。使用單向ANOVA 檢驗分析組間差異。其中，*表示p＜0.05,差異顯著；**表示p＜0.01，差異極顯著。誤差線顯示標準偏差（SD）。

圖3 正常組，1.0%酒精組囊胚細胞免疫熒光染色圖

我們前期的研究已經證明酒精暴露會導致早期胚胎的囊胚率降低，且對胚胎發(fā)育的損傷具有劑量依賴性[8]，為弄清酒精暴露對早期胚胎譜系分化的影響，分別對囊胚期細胞的TE 和ICM 的標記基因Cdx2 和Oct4 進行免疫熒光染色觀察，并應用Imagepro Plus 6 對其結果進行分析。結果顯示，1.0%酒精組的囊胚細胞的總染色細胞數(shù)顯著低于正常組（圖4.A，P＜0.01），1.0%酒精組Cdx2染色細胞數(shù)顯著低于正常組（圖4.B，P＜0.01），1.0%酒精組Cdx2 染色細胞數(shù)占總細胞數(shù)目之比顯著低于正常組（圖4.C，p＜0.01）。接下來對Cdx2 和Oct4 的單位熒光強度進行分析，發(fā)現(xiàn)兩種轉錄因子的單位熒光強度呈現(xiàn)不同的結果，酒精組的Oct4 的單位熒光強度顯著高于正常組（圖5.A，p＜0.05）而Cdx2 的單位熒光強度則顯著低于正常組（圖5.B，P＜0.01）,且相較于Oct4，Cdx2 的熒光變化更顯著，酒精組Cdx2 與Oct4 單位熒光強度比值顯著低于正常組（圖5.C,p＜0.01）。兩種轉錄因子Cdx2 和Oct4 作為譜系分化的標志物，在正常胚胎中存在相互抑制平衡[13]，從本研究結果來看，這種平衡在酒精暴露的早期胚胎中明顯被打破，導致其基因表達的改變，而這種改變必然對胚胎的發(fā)育產生嚴重影響。

圖4 正常組，1.0%酒精組囊胚細胞計數(shù)。A.囊胚總細胞數(shù)；B.Cdx2 染色細胞數(shù)；C.Cdx2 染色細胞數(shù)占總細胞數(shù)比例.

圖5 正常組，1.0%酒精組免疫熒光強度分析。A.Oct4 單位熒光強度；B.Cdx2 單位熒光強度；C.Cdx2/Oct4 單位熒光強度比值。

討論

妊娠期間酒精暴露導致的胎兒發(fā)育異常統(tǒng)稱為胎兒酒精綜合征（FAS），包括胎兒中樞神經系統(tǒng)（CNS）功能障礙和可識別的面部異常[14]。近年來，女性妊娠期飲酒比例大幅度上升，而早期胚胎的短期酒精暴露將對植入后胚胎發(fā)育產生怎樣的影響尚不清楚。因此，我們選擇植入前胚胎體外暴露于酒精，觀察其植入后的發(fā)育情況來探索短期的酒精暴露對植入后胚胎發(fā)育的影響。

妊娠期間不良的宮內環(huán)境也會造成胎兒的宮內發(fā)育遲緩，對其相應基因的全血甲基化分析發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變從而導致胎兒的生長發(fā)育受到影響[15]。植入前胚胎受到外界環(huán)境的毒性效應也會對植入后胚胎的宮內發(fā)育造成損傷。胚胎移植后10 天的小鼠胚胎解剖結果顯示，酒精組胚胎的植入率和胎兒發(fā)育率顯著降低，胎盤的發(fā)育也呈現(xiàn)出明顯的改變。酒精組胎盤重量顯著減少，且胎盤成型率降低。胎盤作為胎兒和母體聯(lián)系的紐帶，在胎兒發(fā)育過程中負責向胎兒輸送養(yǎng)料以及運輸廢物，胎盤發(fā)育受損將直接影響胎兒在母體子宮內的發(fā)育,胎盤結構和功能的損傷直接影響胎兒以及出生后的后代的生長發(fā)育[16-17]。然而植入前酒精暴露的胚胎在植入后的胎兒和胎盤損傷的具體機制以及胎兒和胎盤間是否存在相互作用尚不清楚，需要進一步探究。

在小鼠胚胎中，Cdx2 被認為是TE 的特異性轉錄因子，Oct4 被認為是ICM 的特異性轉錄因子[18]。細胞譜系的正確建立決定著細胞命運，研究發(fā)現(xiàn)，Cdx2 和Oct4 的表達具有拮抗作用，Cdx2可以結合到Oct4 基因的啟動子區(qū)抑制其表達，同樣Oct4 也可以結合到Cdx2 基因的啟動子區(qū)抑制其表達，這種相互作用決定了早期胚胎中ICM/TE譜系的分化[19-20]。在暴露于酒精的早期胚胎中，囊胚期細胞的免疫熒光染色結果顯示，Cdx2 和Oct4的表達平衡改變，酒精暴露的早期胚胎的譜系分化發(fā)生改變，我們推測，早期胚胎酒精暴露可能通過影響譜系分化而影響植入后胚胎在子宮內的生長發(fā)育。

結論

胚胎發(fā)育是一個神秘而又復雜的過程，環(huán)境的微小改變都會對其造成不可逆轉的影響。本研究探究了早期胚胎酒精暴露對植入后胚胎在母體子宮內的發(fā)育的影響，研究發(fā)現(xiàn)早期胚胎酒精暴露后會造成植入后胎兒和胎盤的發(fā)育損傷，導致囊胚期細胞譜系分化改變，對胚胎發(fā)育產生極大的影響。