草莓菠蘿復合酵素成分及其體外生物活性研究

段曉宇，曾 莉，樊 睿，趙治巧，萬玉軍，陳 惠，王 剛，唐自鐘*

1四川農業(yè)大學生命科學學院，雅安 625014；2四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，成都 611130

草莓(FragariaxananassaDuch.)為薔薇科薔薇亞科草莓屬宿根性多年生常綠草本植物，其果肉富含維生素和微量元素，具有很高的營養(yǎng)經濟價值，栽培面積和產量僅次于葡萄。菠蘿又稱鳳梨(Ananascomosus(L.) Merr.)，屬于鳳梨科鳳梨屬植物，其主要生長在南美洲等熱帶地區(qū)，屬于世界第三大熱帶水果之一。但他們含水量較高，不宜保存，從而通過一定技術延長其貨架期顯得極為重要。

酵素最初起源于日本，現(xiàn)今日日本酵素一年可達到1 000億日元以上的市場量[1]。酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等為原材料，與多種益生菌混合培養(yǎng)，最終發(fā)酵而成一種具有特定藥理功能的液體或固體，因其發(fā)酵產物具有較好的抗氧化能力、大分子物質分解能力、抗衰老作用，而受到眾多研究者的關注[2]。而水果酵素因其較好的生物活性逐漸成為熱點，在果蔬發(fā)酵中微生物的選擇尤為重要，如酵母菌(yeast)它能夠提高食品營養(yǎng)價值，而且在生長過程中能夠產生一些保健調理的物質，因此深受食品生產者的喜愛。而乳酸菌在發(fā)酵過程中能夠產生大量的有機酸和醇類及各種氨基酸等代謝物，具有抑制雜菌生長、促進消化吸收、防癌等生理功效[3,4]。水果果汁的濃度對發(fā)酵過程中產生酸性物質也有重要影響，有研究表明，當果汁加入量由30%增加到50%時，其發(fā)酵產酸性物質效率明顯增強。酸度過高會對味覺和口腔產生較大刺激，而酸度過低則會影響酵素給人帶來的愉悅感，酸度作為衡量酵素發(fā)酵的一個重要指標，將酸度控制在一定的范圍內，能有效提高酵素的風味。使用多種益生菌混合發(fā)酵可以進一步改善酵素的口感風味，考慮用乳酸菌與酵母菌共同對進行發(fā)酵，酵母菌發(fā)酵可以產生醇，醇與酸反應會轉化為酯，從而改變飲品的風味，提高飲品給人帶來的舒適感。所以本研究采用保加利亞乳桿菌和果酒酵母復合菌種來發(fā)酵草莓菠蘿，以獲得對人體具有更高營養(yǎng)價值的水果酵素。

近年來，酵素制品已成為國際市場的主流，目前我國酵素制品主要在河南一帶發(fā)展較好，但我國的酵素制品主要以單種蔬菜或者水果發(fā)酵占據(jù)主導。草莓和菠蘿單獨發(fā)酵獲得的酵素產品已出現(xiàn)[5,6]，但對其復合酵素筆者尚未見到。并且由于水果具有含較多檸檬酸和易上火等特點，所以筆者建議，比起單一使用某種水果，將不同種類的水果混合搭配。合理的搭配，可以更加全面的改善身體狀況。所以開發(fā)新型獨特的菠蘿草莓復合酵素制品具有良好的市場前景。因此，本研究以草莓菠蘿混合果汁為原料，同時添加酵母菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵制備酵素，并對其發(fā)酵前后的化學成分含量、功效酶活力、抗氧化活性和抑菌能力進行初步研究，旨在提高草莓和菠蘿的附加值并生產一種具有更高營養(yǎng)價值的復合酵素產品。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮草莓和菠蘿市售；果酒酵母、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、大腸桿菌(Bacilluscoli)(四川農業(yè)大學生命科學學院發(fā)酵工程實驗室)。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)(上海源葉生物有限公司)；水楊酸(成都科龍化工試劑有限公司)；鄰苯三酚(四川西隴化工有限公司)；酚酶試劑盒和總超氧化物歧化酶試劑盒(南京建成生物工程研所)。其他試劑均為國產分析純。

LB培養(yǎng)基(液體)：蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1 g，水100 mL，121 ℃滅菌30 min；固體培養(yǎng)基在每100 mL液體培養(yǎng)基中加1.7 g瓊脂粉。

1.3 儀器與設備

DK-8D電熱恒溫水槽(上海三發(fā)科學儀器有限公司)；XZ18K-T高速冷凍離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)；Multiskan Sky酶標儀(上海合商科學儀器有限公司)；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司)。其他均為實驗室常規(guī)儀器。

1.4 方法

1.4.1 酵素制作工藝

挑選新鮮無壞的草莓和菠蘿。在無菌條件下取其果肉，對果肉進行切塊處理，將處理好的果肉裝入已滅菌的榨汁機中榨汁，將榨汁完成的果肉按照1∶1的比例的裝入無菌發(fā)酵瓶中，再往發(fā)酵瓶中依次加入無菌水、白砂糖、酵母菌、保加利亞乳桿菌，密封復合發(fā)酵6個月后獲得草莓菠蘿復合酵素。

1.4.2 草莓菠蘿復合酵素化學成分研究

1.4.2.1 草莓菠蘿復合酵素總糖研究

參考文獻[7]，吸取2 mL不同濃度梯度(0～0.7 mg/mL)葡萄糖標準溶液，分別置入8只已標號的25 mL比色管中，加1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸(DNS)溶液，混合均勻后于100 ℃水浴鍋中水浴加熱5 min，取出，冷卻至室溫，用水稀釋至25 mL，采用酶標儀于520 nm處測定吸光度，0號管為空白。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線為y=0.769 6x-0.007 8，R2=0.995 5。

取0.5 mL酵素液，加入2 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，沸水浴15 min，冷卻后加入1.8 mL 6 mol/L氫氧化鈉溶液，取2 mL液體于25 mL容量瓶中，后續(xù)步驟同標曲測定一樣。按照標準曲線線性方程y=0.769 6x-0.007 8，R2=0.995 5計算出總糖含量。

1.4.2.2 草莓菠蘿復合酵素總酚研究

參考文獻[7]，取8支已標號的20 mL比色管，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的沒食子酸標準液，用蒸餾水稀釋至比色管10 mL刻度線，每管加1 mL Folin試劑及2 mL 20% NaCO3，于100 ℃水浴鍋中水浴加熱1 min，冷卻并用水稀釋至20 mL刻度線，室溫放置30 min，采用酶標儀在波長為650 nm時，測定吸光度A為橫坐標，濃度為縱坐標，繪制標準曲線為y=15.899 1x-0.202 1，R2=0.993 5。

取0.5 mL酵素液，后續(xù)步驟同標曲測定一樣。總酚含量以沒食子酸計，按標準曲線方程y=15.899 1x-0.202 1，R2=0.993 5計算總酚含量。

1.4.2.3 草莓菠蘿復合酵素總黃酮研究

參考文獻[8]，吸取0.2 mg/mL蘆丁標準液0～0.50 mL于6 支干凈試管中，分別加入2.5 mL 70%乙醇，0.15 mL 5%的NaNO2溶液，混合均勻在室溫下靜置6 min；隨后加入0.3 mL 10%的AlCl3溶液搖勻靜置5 min；再加入1.00 mL的1 mol/L的NaOH溶液；最后補水至總體積為5.00 mL，振蕩均勻；于370 nm測定各管的吸光值。以吸光度(A)作為縱坐標，蘆丁濃度作為橫坐標，繪制標準曲線y=1.350 5x-0.004 41，R2=0.995 2。

準確吸取0.5 mL酵素液；后續(xù)步驟同標曲測定一樣。按標準曲線方程y=1.350 5x-0.004 41，R2=0.995 2計算總黃酮含量。

1.4.2.4 蛋白質的測定

參照Chen等方法[9]測定草莓菠蘿復合酵素發(fā)酵液中蛋白質含量。以牛血清蛋白濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制線性方程y=0.005 5x+0.064，R2=0.999 4。

1.4.3 功效酶活力的測定

1.4.3.1 淀粉酶和T-SOD活力測定

淀粉酶和T-SOD分別嚴格參照碘-淀粉比色法的試劑盒和總超氧化物歧化酶活力測定試劑盒的操作步驟進行。

1.4.3.2 蛋白酶活力測定

借鑒酪蛋白消化法測定酶活性[10]，使用公式(1)計算蛋白酶活力值。

蛋白酶活力(U/mL)=AK×4/10×N

(1)

式中：A為實驗組酵素液的吸光度；K為吸光度等于1時酪氨酸的量；4為反應溶液的總體積，mL；10為反應時間，min；N酶液稀釋總倍數(shù)。

1.4.3.3 脂肪酶活力測定

參考Dong等[11]的方法測定脂肪酶活力，使用公式(2)計算脂肪酶活力值。

X=(B-A)×C/0.05×50×1/15×n=

200/3×(B-A)×C×n

(2)

式中：X為樣品的酶活力，U/mL；B為滴定樣品時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；A為滴定空白時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；C為氫氧化鈉標準溶液濃度，mol/L；0.05為氫氧化鈉標準溶液濃度換算系數(shù)；50為0.05 mol/L氫氧化鈉溶液1.00 mL相當于脂肪酸50 μmol；1/15為反應時間15 min，以1 min計；n為稀釋倍數(shù)。

1.4.4 草莓菠蘿復合酵素抗氧化活性測定

1.4.4.1 對DPPH自由基清除能力的測定

在酶標板上，按樣品稀釋倍數(shù)梯度，分別加入0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液100 μL和梯度樣品溶液100 μL混勻，室溫避光靜置30 min后，于λ=517 nm處測OD值，以無水乙醇作調零。每組做三個平行組，使用公式(3)計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[(A1-A2)/A1]×100%

(3)

式中：A1為對照組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.4.4.2 對OH自由基清除能力的測定

參照Yao等[12]的方法測定酵素對OH自由基清除能力，使用公式(4)計算OH自由基清除率。

OH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(4)

式中：A1為樣品組吸光度；A2為本底吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.4.4.3 對ABTS自由基清除能力的測定

實驗前用無水乙醇稀釋ABTS儲備液至吸光度A為7±0.02。取10 mL EP管編號，分別加入1 mL ABTS溶液和100 μL梯度樣品溶液混勻，靜置6 min，吸取上清液200 μL在酶標板上進行點樣，以無水乙醇作為空白對照，在λ=734 nm處測量各實驗組的吸光度。每組做三個平行組，使用公式(5)計算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率=[(A1-A2)/A1]×100%

(5)

式中：A1為對照組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.4.4.4 對超氧陰離子自由基清除能力的測定

取10 mL EP管編號，分別加入3 mL的濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)和不同稀釋濃度的酵素樣品1 mL，充分混合均勻在25 ℃的恒溫水浴鍋中水浴20 min后，加入同樣預溫至25 ℃的25 mmol/L的鄰苯三酚0.4 mL，混合均勻后反應4 min，最后加入0.5 mL濃鹽酸終止反應，在325 nm處測吸光度值A1，以蒸餾水代替樣品，同樣條件反應測A2，蒸餾水調零。每組作三個平行，使用公式(6)計算超氧陰離子自由基清除率。

超氧陰離子自由基清除率=

[1-(A1-A2)/A0]×100%

(6)

式中：A1為樣品組吸光度；A2為本底吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.4.5 草莓菠蘿復合酵素體外抑菌活性研究

本研究以枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌四種病原菌為指示菌，根據(jù)實驗測量得到的抑菌圈直徑大小來評估樣品對不同病原菌的抑菌能力。取直徑85.00 mm左右平板，每個平板倒入15 mL完成配置的LB瓊脂備用。取200 μL病原菌菌懸液，用無菌曲玻棒使之均勻鋪于培養(yǎng)基表面，然后將滅菌牛津杯(內徑6.00 mm，外徑7.80 mm，高10.00 mm)置于平板內，每板3只。用滅菌移液器分別將200 μL樣品液、200 μL 10 mg/mL氨芐青霉素工作液(陽性對照)和200 μL無菌水(陰性對照)注入牛津杯內，將平碟蓋好，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后用游標卡尺(精度為0.02 mm)量取抑菌圈大小，觀察抑菌效果。平行實驗三次，測量實驗抑菌圈的直徑，取三次平行實驗結果的平均值作為最終結果。

2 結果與分析

2.1 草莓菠蘿復合酵素功能營養(yǎng)成分

酵素品質的好壞與其內所含的化學成分密切相關。如圖1所示，發(fā)酵6個月后獲得的草莓菠蘿酵素中總糖、總酚和蛋白質的含量分別從起初的0.65±0.044、0.06±0.002和0.10±0.005 mg/mL降低了75%、50%和80%。發(fā)酵過程中，微生物一般利用原料中的蔗糖、葡萄糖和果糖等單糖或雙糖作為碳源。在發(fā)酵初期，微生物會利用水果自身的糖類和外源糖類進行生理活動，在適宜的發(fā)酵條件下微生物繁殖較快，并通過一系列代謝反應消耗了大量的可溶性糖，從而使總糖含量下降。從理論上講，作為抗氧化物質的總酚，其在發(fā)酵過程中的含量應該表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。因為發(fā)酵前期原料中酚類物質溶出，而隨著發(fā)酵的進行，在有氧情況下被發(fā)酵液中酚類會被多酚氧化酶氧化，從而使酵素中總酚含量的降低。Yang等[13]在蘋果酵素的研究中發(fā)現(xiàn)，總酚含量在發(fā)酵第21天達到最大值，之后持續(xù)下降。總酚含量的減少的可能是因為酚類化合物與發(fā)酵液中的蛋白質結合或吸附起來形成沉淀，導致離心后的酵素液中總酚含量變少或者是因為酚類化合物可以和發(fā)酵液中的有機酸發(fā)生反應，生成其他物質[14]。研究也表明，在發(fā)酵過程中一定濃度的酚類物質會抑制微生物的生長代謝，而微生物為了維持自身生長會降解酚類，從而使總酚含量降低[13]。發(fā)酵后期蛋白質對微生物的生理活動極為重要，此時糖類基本已耗盡，蛋白質作為氮源被微生物利用，也有可能在發(fā)酵過程中，微生物通過代謝活動產生蛋白酶，從而導致蛋白質含量的降低。在微生物的生長過程中，時常伴隨著活性肽、短鏈脂肪酸和多糖等物質生成，糖類物質和營養(yǎng)物質減少，酚類物質被分解利用，最終轉化為具有附加生物價值的物質如黃酮等具有良好生物活性的物質[15]，所以復合酵素中用來表征酵素抗氧化活性的一個重要指標黃酮類化合物從最初的0.07±0.004 mg/mL提高了63%。黃酮類化合物因結構的不同而具有不同的生理功能，當作為抗氧化劑時，可以提高機體清除自由基能力，減少組織細胞的氧化損傷并且可以調節(jié)DNA、蛋白質等物質的合成，免受衰老因子的損傷；當作為信號因子時，可以調節(jié)基因表達，改善衰老機體代謝情況[15]。因此，在草莓菠蘿復合酵素中黃酮類化合物含量的上升的情況下，我們可以初步推測其具有清除體內自由基、延緩衰老的潛能。

圖1 草莓菠蘿復合酵素化學成分Fig.1 Chemical constituents of strawberry-pineapple complex Jiaosu注：未發(fā)酵指草莓菠蘿混合果汁；發(fā)酵指草莓菠蘿酵素，下同。 Note:Unfermented means strawberry and pineapple mixed juice; Fermentation refers to strawberry-pineapple Jiaosu.The same below.

2.2 草莓菠蘿復合酵素的功效酶

蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶可以將大分子的蛋白質、脂肪和淀粉分解為小分子物質，從而更有利于腸胃消化吸收；而具有抗氧化作用的一種金屬酶SOD可以清除機體產生的超氧陰離子，使后者發(fā)生歧化反應產生對機體無害的氧氣和過氧化氫。由圖2可知，發(fā)酵6個月后，草莓菠蘿復合酵素中的淀粉酶、T-SOD和脂肪酶分別由起初的0.076±0.005、53.86±1.52和1.31±0.214 U/mL增加至0.086±0.006、95.57±4.58和6.24±1.781 U/mL。與Wang[16]、Zhang[17]等對青梅酵素和市售酵素的SOD活性測定分別為75.64 U/mL和41.7 U/mL相比，草莓菠蘿復合酵素的SOD酶活力更高。并且在發(fā)酵后，T-SOD活力接近增加了一倍，因此本研究所得的復合酵素在體內具有很好的清除自由基的能力，具有很好的保健和美容功效；與Dong等[11]對火龍果酵素的脂肪酶活力測1.8±0.3U/mL相比，草莓菠蘿復合酵素的脂肪酶活力較高，這說明草莓菠蘿復合酵素對脂肪的消化能力更強。所以草莓菠蘿復合酵素在醫(yī)藥、美容行業(yè)具有很大的推廣應用價值。但其蛋白酶活力由起初的57.14±4.45 U/mL降低到2.67±0.57 U/mL，這便與前面蛋白質含量變化所一致，即蛋白酶活力的下降減少了對樣品中蛋白質的分解能力，從而使其含量增加。分析原因可能是發(fā)酵過程中加入的酵母菌與乳酸菌大規(guī)模生長導致酵素pH值急劇下降，最終導致蛋白酶活力大幅度降低。

圖2 草莓菠蘿復合酵素功效酶活力Fig.2 Efficacy enzyme activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu

2.3 草莓菠蘿復合酵素的體外生物學活性研究

2.3.1 草莓菠蘿復合酵素對DPPH自由基的清除能力

本研究將發(fā)酵前后的樣品用溶劑稀釋成一定的體積濃度梯度(0.8%～10.4%)，由圖3可知，各樣品隨著其體積濃度的增加對DPPH自由基(DPPH·)的清除能力也有所增加。發(fā)酵前樣品對DPPH自由基的清除能力從6.44%±0.88%增加至96.24%±0.305%，發(fā)酵后的草莓菠蘿酵素對DPPH自由基的清除能力從61.18%±0.23%降低至14.14%±3.08%。因此我們發(fā)現(xiàn)在微生物的生長過程中，樣品中對DPPH自由基具有清除能力的物質被分解或消耗。Chen等[5]研究草莓酵素的抗氧化性變化發(fā)現(xiàn)酵素液對DPPH自由基清除率與發(fā)酵液中總酚含量具有相似的變化趨勢，說明酵素對DPPH自由基的清除能力與酚酸類化合物之間有一定的相關性。所以發(fā)酵降低了樣品對DPPH自由基的清除能力可能與發(fā)酵過程中酵素液中總酚含量下降有關。

圖3 草莓菠蘿復合酵素對DPPH自由基的清除能力Fig.3 Scavenging activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu on DPPH·

2.3.2 草莓菠蘿復合酵素對OH自由基的清除作用

OH自由基(·OH)是活性氧中化學性質最活潑的自由基，它能夠與活細胞中大多數(shù)具有還原性的生物大分子發(fā)生劇烈反應，是對機體危害最大的自由基。由圖4可知，在實驗濃度范圍內(2%～14%)，樣品對·OH的清除率呈濃度依賴性。發(fā)酵前樣品對·OH的清除能力從34.10%±0.46%增加至59.99%±2.16%，發(fā)酵后的草莓菠蘿酵素對·OH的清除能力26.74%±3.04%增加至85.91%±2.69%。Ng等[18]研究表明，黃酮類化合物對·OH有較好的清除能力，其清除能力的強弱取決于芳香環(huán)上羥基的數(shù)目和位置。由圖1可知草莓菠蘿酵素發(fā)酵后總黃酮含量提升為發(fā)酵前的三倍，在發(fā)酵過程中可能由于微生物的生長使發(fā)酵液中的酚類物質轉化為黃酮類物質，同時導致了黃酮類化合物芳香環(huán)上羥基的數(shù)目和位置發(fā)生相應改變，最終使發(fā)酵后酵素對·OH的清除率變高。

圖4 草莓菠蘿復合酵素對OH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu on ·OH

2.3.3 草莓菠蘿復合酵素對ABTS自由基的清除作用

ABTS自由基(ABTS+·)清除法被廣泛用于生物樣品的總抗氧化能力測定。在反應體系中，ABTS經氧化后生成相對穩(wěn)定的藍綠色的ABTS水溶性自由基，當其遇到自由基清除劑時，ABTS的顏色變淺，特征吸光度降低，吸光度越低。因此，通過測定吸光度的變化來體現(xiàn)對ABTS自由基的清除效果，結果見圖5。

圖5 草莓菠蘿復合酵素對ABTS自由基的清除能力Fig.5 Scavenging activity of strawberry-pineapple complex Jiaosu on ABTS+·

由圖5可知，在ABTS測試體系中未發(fā)酵的樣品和發(fā)酵后的草莓菠蘿復合酵素清除ABTS自由基能力的差異顯著。當體積濃度為2%時，未發(fā)酵的樣品對ABTS自由基清除率為9.74%±1.60%，而發(fā)酵后的草莓菠蘿復合酵素對ABTS自由基的清除率為4.28%±1.63%；且當體積濃度為14%時，未發(fā)酵樣品的清除率65.32%±1.06%仍強于草莓菠蘿酵素的清除能力23.52%±0.75%。Jiang等[19]對葡萄酵素天然發(fā)酵過程中體外抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，總酚含量與ABTS自由基清除能力具有顯著的相關性。發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力的變化可能與總酚含量的變化有關。由圖1可知，未發(fā)酵樣品中總酚含量為發(fā)酵后樣品的兩倍，且未發(fā)酵樣品對ABTS自由基的清除能力約為發(fā)酵后樣品的兩倍，所以發(fā)酵后酵素對ABTS自由基清除能力下降可能是由于微生物的生長使發(fā)酵液中的酚類物質被分解，導致酚類物質的產量小于消耗量，最終體現(xiàn)為發(fā)酵后樣品對ABTS自由基清除能力下降。

2.3.4 草莓菠蘿復合酵素對超氧陰離子自由基的清除作用

由圖6知，發(fā)酵后草莓菠蘿復合酵素對超氧陰離子清除能力遠遠強于未發(fā)酵的樣品。當體積濃度為10%時，未發(fā)酵樣品對超氧陰離子的清除率為26.75%±1.54%，而此時草莓菠蘿復合酵素的清除率已達到79.72%±1.17%。隨著體積濃度的增加(20%～70%)，未發(fā)酵樣品對自由基的清除率與體積濃度呈正相關，而復合酵素對超氧陰離子的清除能力趨于平穩(wěn)狀態(tài)。當體積濃度達到最大(70%)時，兩者的清除率分別為45.58%±1.77%和98.34%±0.57%。Zhang等[20]研究表明，隨著苯環(huán)上羥基數(shù)目的增加，黃酮類化合物抑制超氧陰離子的能力增強，并且SOD對清除超氧陰離子自由基也有著重要作用。由圖2可知發(fā)酵后草莓菠蘿復合酵素中T-SOD活力增加了近一倍，所以樣品發(fā)酵后對超氧陰離子自由基的清除能力大幅提升可能與發(fā)酵過程中微生物產生大量SOD和多羥基取代或3羥基取代的黃酮類化合物的大量合成有關。

圖6 草莓菠蘿復合酵素對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.6 Scavenging activity of strawberry-pineapple

本研究采用常見的四種自由基體系對發(fā)酵前后的草莓菠蘿復合酵素體外抗氧化能力進行較為全面的研究。結果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，草莓菠蘿酵素對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力增強，對DPPH和ABTS自由基的清除能力減弱。復合酵素對不同自由基清除效果表現(xiàn)出差異，這是因為抗氧化劑化合物可以通過不同的機制，在反應基質中每個有其特定的目標。因此，在各種化學測試不同的化學反應活性可能導致不同程度的抗氧化能力[21]。

2.4 草莓菠蘿復合酵素的抑菌活性

如圖7所示，發(fā)酵前的樣品對四種病原菌均無抑菌能力而發(fā)酵后的草莓菠蘿復合酵素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制效果，且抑菌效果為金黃色葡萄球菌(29.60±1.41 mm)>大腸桿菌(29.33±1.66 mm)>綠膿桿菌(27.67±1.34 mm)>枯草芽孢桿菌(14.63±2.11 mm)。發(fā)酵后樣品抑菌能力增加可能與發(fā)酵過程中醋酸、皂苷和硫化物等物質的產生有關[22,23]，而且也可能與乳酸菌合成具有抗菌性能的代謝產物如乳酸和乙酸、脂肪酸、過氧化氫或雙乙酰以及抗菌蛋白如細菌素肽聚糖水解酶等發(fā)揮抗菌作用有關[24]；而對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)的抗菌活性較強，主要是由于有機酸中存在乙酸所致[25]。枯草芽孢桿菌細胞壁表面附有莢膜且能產生孢子，由此推測，具有抑菌特性的生物活性物質很難穿過莢膜作用于細菌內部，所以草莓菠蘿復合酵素對枯草芽孢桿菌的抑制效果最弱。

圖7 發(fā)酵前后草莓菠蘿復合酵素的抑菌實驗Fig.7 Inhibition experiment of strawberry-pineapple complex Jiaosu on bacteria注：A：10 mg/mL氨芐青霉素；S：樣品液；H：無菌水。Note:A:10 mg/mL ampicillin;S:Sample solution;H:Sterile water.

3 結論

本實驗通過乳酸菌和酵母菌復合發(fā)酵讓發(fā)酵過程中產生的酸類物質和醇類物質盡量中和，使復合酵素口味和風味都得到了改善。復合發(fā)酵后草莓菠蘿復合酵素中總黃酮含量提升1.5倍，對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均有較大提升，10.4%的草莓菠蘿復合酵素對DPPH自由基的清除率達到58%，與Chen[5]報道的發(fā)酵30天后的草莓酵素對DPPH自由基的清除率相當，14%的草莓菠蘿復合酵素對·OH的清除率高達88%，而Zhao[6]報道的56%菠蘿酵素對·OH的清除率僅有60%左右，與Chen[5]對草莓酵素發(fā)酵后的羥自由基清除作用測定為除率達到最高值76.44%相比，草莓菠蘿復合酵素的羥自由基清除率更高，20%的草莓菠蘿酵素對超氧陰離子自由基的清除率已達100%，而Zhao[6]報道的70%的菠蘿酵素對超氧陰離子自由基的清除率不到90%，并且在發(fā)酵后其T-SOD活力接近增加了一倍，脂肪酶活力大幅度提升。以上說明草莓菠蘿復合酵素與草莓酵素和菠蘿酵素相比具有更好的清除自由基的能力，能夠在保健和美容方面發(fā)揮較好功效。草莓菠蘿復合酵素融合了草莓和菠蘿這兩種水果各自的特性，取長補短，可以更全面地調理使用者身體。因此這種新型功能性酵素飲料不僅對人體清除自由基、分解大分子物質上具有一定的效果，而且在醫(yī)藥研發(fā)和化妝品等領域具有一定的推廣應用價值，除此之外其還有助于加深人們對于天然功能性食品的進一步認識。