核黃素磷酸鈉的合成研究進(jìn)展

劉 潔，徐詩(shī)琦，巨修練

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢430205

核黃素（riboflavin）也稱維生素B2，化學(xué)名稱為6，7-二甲基-10-（1'-D-核糖醇基）-異咯嗪，其結(jié)構(gòu)式中核糖醇部分含有三個(gè)不對(duì)稱碳原子，如圖1所示，是維持生命所必需的一種水溶性維生素，是機(jī)體內(nèi)許多酶系統(tǒng)的重要輔基—黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）與黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）的構(gòu)成成分，參與機(jī)體的能量與物質(zhì)代謝［1］。鑒于核黃素具 有 廣 泛 而 重 要 的 生 理 功 能［2］，WHO（Word Health Organization）將其列為評(píng)價(jià)人體生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)狀況的六大指標(biāo)之一。

核黃素的生理生化功能主要是由于核黃素分子中異咯嗪上1，5 位氮原子上存在的活潑共軛雙鍵有關(guān)，既可做供氫體，又可做遞氫體。在人體內(nèi)以FAD 和FMN 兩種形式參與體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，起到供氫、遞氫的作用，是組成機(jī)體中非常重要的氧化還原酶的輔基，其主要參與的生化反應(yīng)［3-5］有呼吸鏈的能量產(chǎn)生過程，氨基酸及脂類氧化，嘌呤堿轉(zhuǎn)化為尿酸的代謝，芳香族化合物的羥基化代謝，蛋白質(zhì)與某些激素的合成，鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存及活化，參與葉酸、吡多醛、尼克酸等的代謝，對(duì)機(jī)體而言具有非常重要的作用。

由于在體內(nèi)實(shí)際參與反應(yīng)和起作用的是FMN，且與核黃素相比，黃素單核苷酸鈉的水溶性遠(yuǎn)超過核黃素，故將核黃素磷酸化制成核黃素磷酸鈉，不僅大大提高了核黃素在機(jī)體內(nèi)的吸收，還增加了其生物利用度。核黃素磷酸鈉［6］別名維生素B2 磷酸鈉，核黃素-5'-（二氫磷酸酯）單鈉鹽，是核黃素的重要衍生物之一，其結(jié)構(gòu)式如圖1 所示，該產(chǎn)品為橙黃色結(jié)晶性粉末含2 個(gè)結(jié)晶水；無(wú)臭，味微苦；有吸濕性，在水中溶解度較大，在有機(jī)溶劑中幾乎不溶。用于口角炎［7-9］、唇炎、舌炎［10-12］、眼結(jié)膜炎及陰囊炎［13-15］等疾病的治療。與核黃素相比，核黃素磷酸鈉在水中的溶解度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于核黃素，容易被機(jī)體吸收利用，且效價(jià)遠(yuǎn)高于核黃素，解決了核黃素只能口服不能制成注射劑的問題［16-18］。在臨床上可被制成核黃素復(fù)合制劑、性質(zhì)穩(wěn)定的注射液［19-20］等，在使用上更加便利，應(yīng)用范圍廣泛提高［21-23］。

圖1 核黃素及核黃素磷酸鈉結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of riboflavin and riboflavin sodium phosphate

將一些水溶性較差的藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造、引用親水基團(tuán)或成鹽，使其水溶性提高是現(xiàn)有新藥研發(fā)常用的一項(xiàng)技術(shù)方法。在不改變其藥效作用的前提下，增加藥物水溶性、提高藥物在機(jī)體內(nèi)的吸收利用，具有良好的市場(chǎng)前景。因此，將核黃素磷酸化制成核黃素磷酸鈉，大大改善了核黃素水溶性差的問題，較大程度上解決了人們對(duì)于核黃素額外補(bǔ)給的需求，大幅度預(yù)防了由于核黃素缺乏而引起的一些疾病的發(fā)生，適應(yīng)市場(chǎng)需求。核黃素磷酸鈉主要有生物發(fā)酵發(fā)及化學(xué)合成法生產(chǎn)，但生物發(fā)酵發(fā)未見工業(yè)化的報(bào)道。本文主要介紹核黃素磷酸鈉的化學(xué)法生產(chǎn)研究進(jìn)展，在分析、總結(jié)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，提出了黃素磷酸鈉化學(xué)合成的展望。

1 生物發(fā)酵

2008 年日本專利報(bào)道了核黃素-5'-磷酸的制造方法［24］，在短波桿菌（Brevundimonas diminuta）存在條件下，以多聚磷酸、焦磷酸等含磷酸及其鹽作為磷酸供體，加入一定量的核黃素，培養(yǎng)基，緩沖溶液，在適當(dāng)?shù)臏囟燃皃H 條件下發(fā)酵可以得到核黃素-5'-磷酸，含量可以達(dá)到98% 以上。核黃素-5'-磷酸在NaOH 作用下很容易得到核黃素-5'-磷酸鈉。該方法得到的核黃素-5'-磷酸鈉含量高，產(chǎn)品質(zhì)量高，但分離純化復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，未見工業(yè)化大生產(chǎn)報(bào)道。

2 化學(xué)合成

最早報(bào)道核黃素磷酸鈉的化學(xué)制備是20 世紀(jì)50 年代［25］，隨后核黃素磷酸鈉及其衍生物的合成也有報(bào)道［26-28］。目前，黃素磷酸鈉的制備研究及工業(yè)化生產(chǎn)均采用化學(xué)合成法，主要合成工藝如圖2。核黃素在縛酸劑如吡啶條件下與三氯氧磷反應(yīng)或核黃素在耗酸劑如磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、γ-丁內(nèi)酯等條件下與三氯氧磷反應(yīng)，水解得到核黃素-5'-磷酸酯，然后在NaOH 作用下中和得到目標(biāo)產(chǎn)物核黃素-5'-磷酸鈉，由于核黃素分子內(nèi)2'、3'、4'、5'位均有羥基存在，只有5'磷酸化為有效體。因此如何提高核黃素5'位磷酸化是化學(xué)合成核黃5'磷酸鈉的關(guān)鍵。

2.1 核黃素/三氯氧磷/吡啶/乙腈體系

孫文敬等［29］研究磷酸化反應(yīng)中核黃素與POC13及H2O 的配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)核黃素磷酸鈉合成的影響。結(jié)果表明，在吡啶作為縛酸劑及乙腈作為溶劑的體系中，用4 倍摩爾的三氯氧磷比核黃素的量在35 ℃左右條件下反應(yīng)2 h，然后水解反應(yīng)混合物，再用NaOH 溶液中和調(diào)節(jié)pH，核黃素磷酸鈉的收率可以達(dá)到75%以上。魏轉(zhuǎn)等［30］在吡啶和乙腈的混合體系中，使用核黃素粗品與其4 倍摩爾量的三氯氧磷在35 ℃左右條件下反應(yīng)2 h，然后水解反應(yīng)混合物，再用NaOH 溶液中和調(diào)節(jié)pH 值，核黃素磷酸鈉的收率可達(dá)68.5%以上，產(chǎn)品質(zhì)量符合美國(guó)藥典的各項(xiàng)要求。通過單因素試驗(yàn)，初步優(yōu)化了核黃素粗品磷酸化反應(yīng)的條件，即摩爾比：m（三氯氧磷）∶n（核黃素）= 4.6，m（三氯氧磷）∶n（水）= 1.65，反應(yīng)時(shí)間2 h，反應(yīng)溫度（35±1）℃。研究結(jié)果表明，利用核黃素粗品制備核黃素5'-磷酸鈉方法可行，具備工業(yè)化條件，特別是成本顯著降低。在此方法的基礎(chǔ)上，巨修練等專利報(bào)道［31］以核黃素/三氯氧磷/吡啶/水/乙腈體系進(jìn)行了核黃素磷酸鈉的制備研究，以核黃素、三氯氧磷、吡啶、純化水為起始原料經(jīng)過核黃素磷酸化反應(yīng)生成核黃素環(huán)磷酸酯，核黃素環(huán)磷酸酯水解生成核黃素磷酸酯，核黃素磷酸酯與NaOH 成鹽生成核黃素磷酸酯鈉，該方法已工業(yè)化。利用該工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品核黃素5'位的磷酸化有待于進(jìn)一步提高。另外，張龍霞等［32-33］利用云計(jì)算技術(shù)研究了該體系的生產(chǎn)技術(shù)，提高了工藝參數(shù)的篩選效率。

2.2 核黃素/三氯氧磷/γ-丁內(nèi)酯體系

2007 年，天津大學(xué)藥學(xué)院代金玲［34］以三氯氧磷為起始原料，用γ-丁內(nèi)酯作為耗酸劑代替縛酸劑吡啶，按n（核黃素）∶n（γ-丁內(nèi)酯）∶n（三氯氧磷）=l∶4.5∶1.5 的摩爾投料比，在50 ℃下攪拌反應(yīng)4 h，然后將上述反應(yīng)液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% 的NaOH 調(diào)至pH 9～9.5，攪拌30 min 后，過濾，降溫到30 ℃以下用鹽酸回調(diào)至pH 5～6，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件，制得核黃素磷酸鈉，總收率為72.9%。與用吡啶為縛酸劑的工藝比較，利用γ-丁內(nèi)酯作為耗酸劑收率提高了2.9%，操作簡(jiǎn)單，工藝可行，從成本核算來(lái)看，由于γ-丁內(nèi)酯既為溶劑又為磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生的氯化氫消耗劑，反應(yīng)產(chǎn)生的鹽不容易回收，消耗大，價(jià)格又貴，其遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了用乙腈作溶劑的成本。但由于收率的提高，且γ-丁內(nèi)酯的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于乙腈和吡啶，降低了對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)人體的不良影響。因此，該工藝路線相對(duì)吡啶為縛酸劑的工藝來(lái)講更適用于工業(yè)生產(chǎn)，但5'位的磷酸化率較低，產(chǎn)品質(zhì)量有待于進(jìn)一步提高。

2.3 核黃素/三氯氧磷/磷酸三甲酯或磷酸三乙酯體系

參 考YOSHIKAWA 等［35］，Haile 等［36］及Lin等［37］合成糖苷的文獻(xiàn)，進(jìn)行了核黃素/三氯氧磷/磷酸三甲酯或磷酸三乙酯體系的研究［38］。將核黃素加入到10～15 倍的磷酸三甲酯中懸浮，然后將懸浮液冷卻至0 ℃以下。劇烈攪拌下，向反應(yīng)體系中緩慢滴加2 倍量的三氯氧磷，-5～0 ℃條件下反應(yīng)4 h。然后用NaOH 溶液成鹽，靜置過濾得到核黃素磷酸鈉成品。該方法相對(duì)于其它體系來(lái)講，當(dāng)反應(yīng)溶劑換為磷酸三乙酯后，收率較高、副產(chǎn)物較少，產(chǎn)品純度有明顯提升，這對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)更有利，更具實(shí)際利用價(jià)值，目前該工藝在進(jìn)一步研究中。

3 展 望

核黃素以發(fā)酵發(fā)工業(yè)化生產(chǎn)，但核黃素磷酸鈉工業(yè)生產(chǎn)以化學(xué)合成為手段，隨著有機(jī)化學(xué)合成方法的不斷發(fā)展，核黃素磷酸鈉的合成方法也在不斷發(fā)展中，如何提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低排放，降低成本是產(chǎn)品具有競(jìng)爭(zhēng)力的主要指標(biāo)，本文介紹的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，由于核黃素分子內(nèi)2'、3'、4'、5'位均有羥基存在，由于位阻作用，2'位磷酸化比較困難，從核黃素磷酸鈉的HPLC 分析結(jié)果可以看出3'、4'、5'位均有不同程度的磷酸化，3'磷酸化在10% 以下，4'位在15% 以下，5'位在80% 左右，要提高產(chǎn)品質(zhì)量，首先要考慮提高核黃素5'位磷酸化率，可以考慮在核黃素磷酸化以前保護(hù)核黃素分子內(nèi)3'、4'位的兩個(gè)羥基，這樣磷酸化就只能在5'位磷酸化，然后水解脫保護(hù)就可能得到高質(zhì)量的核黃素磷酸酯，將其與NaOH 成鹽就可以生產(chǎn)出高質(zhì)量的核黃素磷酸鈉。黃素磷酸鈉是核黃素的升級(jí)產(chǎn)品，水溶性好，生物活性更高，具有更廣泛的用途，特別是對(duì)抗癌藥物化療引起的副作用具有較好的保護(hù)作用［39-40］，市場(chǎng)發(fā)展前景較好，對(duì)其合成工藝應(yīng)不斷改進(jìn)，以適應(yīng)市場(chǎng)的需求。