口腔菌群及血炎性因子、T細(xì)胞亞群水平在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者病情中變化及意義

徐劍波 王丹丹 彭旭霖 宋飛翔 王春笛

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍屬常見的一種口腔黏膜潰瘍疾病，其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生、發(fā)展可能與局部創(chuàng)傷、微生物感染、精神狀態(tài)、微循環(huán)障礙、維生素缺乏、免疫、化合物和藥物、遺傳及不良生活習(xí)慣等有關(guān)［2］。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍反復(fù)發(fā)作不僅造成持續(xù)性疼痛，且會(huì)造成咀嚼吞咽困難，嚴(yán)重影響患者食欲和進(jìn)食［3］。因此，采取及時(shí)有效的診斷和治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍方法尤為重要。有研究結(jié)果顯示，口腔菌群、體內(nèi)炎性因子水平及免疫功能狀態(tài)等均與口腔疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4-6］。本文研究探討了口腔菌群及血炎性因子、T 細(xì)胞亞群水平在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者病情中的變化及意義，旨在為診斷和治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇于2019年3月至2021年3月期間在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院口腔科就診的復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者91 例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《口腔黏膜病學(xué)》［7］中口腔潰瘍的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②至少3 次口腔潰瘍發(fā)病史；③年齡≥18 歲；④患者及家屬簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他口腔疾病者；②合并急慢性感染疾病者；③重要臟器嚴(yán)重異常者。納入91 例中，男性53 例，女性38 例；年齡平均（49.83±5.45）歲；病程平均（4.19±1.25）年；體質(zhì)指數(shù)平均（23.07±1.85）kg/m2；文化程度：小學(xué)及以下28 例，初中～高中25 例，高中以上38 例；根據(jù)病情進(jìn)展情況分為愈合期49 例和發(fā)作期42 例。另選擇同期健康體檢者80 例作為對(duì)照組，其中男性47 例，女性33 例；年齡平均（49.34±7.48）歲；體質(zhì)指數(shù)平均（22.76±1.89）kg/m2。2 組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)和文化程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 口腔菌群檢測(cè)

1.2.1.1 標(biāo)本收集：受試者均于禁飲禁食2 h 后，用生理鹽水輕微漱口，收集1mL 唾液，用無菌移液器分裝500 μL 于無菌EP 管中，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primerprimer 5.0 設(shè)計(jì)鏈球菌、韋榮氏菌16s rRNA 基因特異性引物（見表1），由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1 鏈球菌、韋榮氏菌的引物序列及產(chǎn)物片段Table 1 Primers and product fragments of Streptococcus and Vironella

1.2.1.3 標(biāo)本DNA 提取：500 μL 標(biāo)本中加入十二烷基硫酸鈉（10%）87 μL 和蛋白酶K（20 mg/mL）3 μL，振蕩混勻，65℃孵育10 min。在混合液中加入NaCl 溶液（5 mol/L）125 μL 和CTAB/NaCl 溶液125 μL，振蕩混勻，65℃孵育10 min。在混合液中加入氯仿840 μL，12 000 r/min 離心5 min。將上清液移置另一無菌EP 管中，加入0.6倍體異丙醇，-20℃下靜置30 min。12 000 r/min離心30 min，棄上清液，沉淀室溫下風(fēng)干20 min，加入100 μL 滅活超純水或滅菌TE 重懸，20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：按照TIANGEN 公司熒光定量PCR 試劑盒操作說明進(jìn)行操作，取25 μL 反應(yīng)體系，包括2.5 μL 的10×PCR Buffer，2 μL 的dNTP Mixture，2.5 μL 的DNA 模板，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，0.2 μL 的Taq 酶，16.8 μL 的ddH2O。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3 min；94℃30 s、55℃30 s、72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min結(jié)束反應(yīng)。

1.2.2 血炎性因子檢測(cè)

采集受試者清晨空腹外周靜脈血5 mL，以10 cm 半徑，3 000 r/min，離心10 min，收集血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-2（Interleukin-2，IL-2）和白介素-8（Interleukin-8，IL-8）水平，人TNF-α ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司），人IL-2 ELISA 試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司），人IL-8 ELISA 試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司），嚴(yán)格依據(jù)試劑盒檢測(cè)中說明書的內(nèi)容進(jìn)行操作。

1.2.3 T 細(xì)胞亞群水平檢測(cè)

采集受試者清晨空腹外周靜脈血5 mL，取每份標(biāo)本100 μL 血分別加入異硫氰基熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的免疫球蛋白G1（Immunoglobulin G1，IgG1），藻紅蛋白熒光素（PE）標(biāo)記的CD3，F(xiàn)TTC 標(biāo)記的CD4 和FTTC 標(biāo)記的CD8 各20 μL，充分混勻后，放置于37℃孵育15 min，制備密度為1×105個(gè)/mL 的單個(gè)核細(xì)胞懸液，上美國(guó)BD 公司流式細(xì)胞儀檢測(cè)，測(cè)定T 細(xì)胞亞群水平，采用配套軟件CyView 實(shí)時(shí)獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析，計(jì)算CD4+/CD8+。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組口腔菌群比較

觀察組鏈球菌和韋榮氏菌的DNA 濃度低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組口腔菌群比較（±s）Table 2 Comparison of oral flora between 2 groups（±s）

表2 兩組口腔菌群比較（±s）Table 2 Comparison of oral flora between 2 groups（±s）

組別觀察組對(duì)照組t 值P 值n 91 80鏈球菌DNA 7.93±0.54 9.17±0.68 13.275＜0.05韋榮氏菌DNA 7.10±0.45 8.29±0.54 15.714＜0.05

2.2 兩組血清TNF-α、IL-2 和IL-8 水平比較

觀察組血清TNF-α、IL-2 和IL-8 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組血清TNF-α、IL-2 和IL-8 水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum TNF-α，IL-2 and IL-8 levels between 2 groups（±s）

表3 兩組血清TNF-α、IL-2 和IL-8 水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum TNF-α，IL-2 and IL-8 levels between 2 groups（±s）

組別觀察組對(duì)照組t 值P 值n 91 80 TNF-α（pg/mL）16.74±2.38 9.82±1.86 20.975＜0.05 IL-2（pg/mL）39.74±5.43 21.23±3.28 26.526＜0.05 IL-8（ng/L）76.83±7.65 52.14±5.89 23.403＜0.05

2.3 兩組T 細(xì)胞亞群比較

觀察組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組T 細(xì)胞亞群比較（±s）Table 4 Comparison of T cell subsets between 2 groups（±s）

表4 兩組T 細(xì)胞亞群比較（±s）Table 4 Comparison of T cell subsets between 2 groups（±s）

組別觀察組對(duì)照組t 值P 值n 91 80 CD3+（%）65.23±3.71 76.72±4.65 17.953＜0.05 CD4+（%）34.38±3.12 40.92±2.97 13.987＜0.05 CD4+/CD8+（%）1.29±0.31 1.82±0.27 11.844＜0.05

2.4 不同病情口腔菌群比較

急性發(fā)作期組鏈球菌和韋榮氏菌DNA 濃度低于愈合期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 不同病情口腔菌群比較（±s）Table 5 Comparison of oral flora in different conditions（±s）

表5 不同病情口腔菌群比較（±s）Table 5 Comparison of oral flora in different conditions（±s）

組別急性發(fā)作期組愈合期組t 值P 值n 49 42鏈球菌DNA 7.47±0.59 8.36±0.47 7.866＜0.05韋榮氏菌DNA 6.48±0.46 7.76±0.39 14.183＜0.05

2.5 不同病情血炎性因子比較

急性發(fā)作期組血清TNF-α、IL-2 和IL-8 水平高于愈合期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 不同病情炎性因子比較（±s）Table 6 Comparison of inflammatory factors in different conditions（±s）

表6 不同病情炎性因子比較（±s）Table 6 Comparison of inflammatory factors in different conditions（±s）

組別急性發(fā)作期組愈合期組t 值P 值n 49 42 TNF-α（pg/mL）21.02±2.89 12.07±2.03 16.820＜0.05 IL-2（pg/mL）51.27±6.95 27.38±4.26 19.367＜0.05 IL-8（ng/L）91.28±8.98 61.07±6.20 18.364＜0.05

2.6 不同病情T 細(xì)胞亞群比較

急性發(fā)作期組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+低于愈合期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表7。

表7 不同病情T 細(xì)胞亞群比較（±s）Table 7 Comparison of T cell subsets in different conditions（±s）

表7 不同病情T 細(xì)胞亞群比較（±s）Table 7 Comparison of T cell subsets in different conditions（±s）

組別急性發(fā)作期組愈合期組t 值P 值n 49 42 CD3+（%）61.42±3.26 70.82±3.98 12.384＜0.05 CD4+（%）30.96±3.14 37.89±2.97 10.760＜0.05 CD4+/CD8+（%）1.02±0.35 1.59±0.23 9.014＜0.05

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)生率較高，且容易復(fù)發(fā)［8-9］?？谇痪旱姆€(wěn)定對(duì)口腔內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性維持尤為重要，通?？谇徽＞号c宿主間保持動(dòng)態(tài)平衡，從而發(fā)揮保護(hù)宿主作用，若菌群失調(diào)，則會(huì)損傷宿主而產(chǎn)生相應(yīng)疾病。唾液菌群（如鏈球菌、韋榮氏菌等）為口腔黏膜與口腔中的正常菌群［10-11］。研究顯示，口腔菌群變化參與了口腔潰瘍發(fā)生、發(fā)展。當(dāng)唾液菌群中鏈球菌、韋榮氏菌含量下降時(shí)，將不利于口腔黏膜穩(wěn)定性的維護(hù)，故而可導(dǎo)致復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生［12］。

機(jī)體免疫功能維持主要依賴于各種免疫因子、免疫細(xì)胞及免疫細(xì)胞亞群間的平衡。T 細(xì)胞亞群是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能重要指標(biāo)，分為CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞，所有T 淋巴細(xì)胞CD3+均陽性，按功能分為CD4+和CD8+以及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，而CD4+、CD8+是機(jī)體重要的免疫調(diào)控細(xì)胞，CD4+細(xì)胞分為Th1 和Th2 兩個(gè)細(xì)胞亞群，分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和輔助體液免疫應(yīng)答。而CD8+細(xì)胞主要功能是特異性直接殺傷靶細(xì)胞，其能夠作為監(jiān)測(cè)機(jī)體免疫功能的指標(biāo)［13-14］。CD4+是誘導(dǎo)性和輔助性T 細(xì)胞，是調(diào)控免疫反應(yīng)最重要的樞紐細(xì)胞。CD8+是抑制性和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，是免疫反應(yīng)中的直接殺傷性細(xì)胞。通常情況下，CD4+和CD8+細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，而其中CD4+細(xì)胞的輔助作用以及CD8+細(xì)胞的免疫抑制作用對(duì)機(jī)體正常免疫功能的維持具有重要作用。而當(dāng)CD4+/CD8+比值降低時(shí)，說明機(jī)體免疫功能處于失衡狀態(tài)，從而容易引起多種疾?。?5］。本研究結(jié)果說明復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者細(xì)胞免疫功能下降，且與患者病情進(jìn)展密切相關(guān)。

炎性因子與口腔潰瘍發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［16］。TNF-α 主要由肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其水平的過度釋放是潰瘍病的特異性病理因素。TNF-α 能夠?qū)χ行粤＜?xì)胞發(fā)揮顯著的趨化作用，將其趨化至病損部位，發(fā)揮顯著的免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)作用［17］。當(dāng)TNF-α 介導(dǎo)的炎性反應(yīng)作用于口腔黏膜上皮時(shí)，可導(dǎo)致組織溶解、水腫、破潰。IL-2 是具有多種生物活性的一種細(xì)胞因子，主要是Th1 類細(xì)胞分泌的一種促炎因子，由活化的CD4+T 細(xì)胞分泌。IL-8 作為一種抗炎因子，屬炎癥和損傷時(shí)的主要抗炎因子，同時(shí)也是參與復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)病的病理過程。在早期口腔潰瘍損傷處的炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及角化細(xì)胞可能分泌大量的IL-8，活化炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)T 細(xì)胞游離到病損處，共同作用，從而形成口腔潰瘍［18］。本研究結(jié)果說明復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者存在明顯炎性反應(yīng)。

綜上所述，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者存在口腔菌群紊亂，炎性反應(yīng)及細(xì)胞免疫功能紊亂，且與患者病情密切相關(guān)。