12種花生品種黃曲霉毒素B1污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

李 廣林秋君吳限鑫郭春景王建忠

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(沈陽) /遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,遼寧 沈陽 110161)

花生(ArachisHypogaeaL.)是世界上最重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物,在亞洲、北美洲等地區(qū)均有分布,是人類重要的蛋白質(zhì)和食用油來源[1]。花生在我國具有悠久的栽植歷史,在對(duì)外貿(mào)易重占有重要的比重[2]。遼寧是我國重要的花生種植區(qū)域,遼寧省花生向來以口感好、品質(zhì)佳、且無黃曲霉毒素等諸多優(yōu)點(diǎn)著稱,在國內(nèi)外市場(chǎng)上均有很高盛譽(yù)[3]。近年來,隨著國家供給側(cè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及花生價(jià)格持續(xù)走高,遼寧省花生種植面積逐年加大,已成為繼玉米和水稻之后的第三大主栽作物[4]。

花生含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),在收獲前和收獲后的貯藏加工過程易遭受黃曲霉侵染而導(dǎo)致黃曲霉毒素污染,從而影響花生生產(chǎn)、加工和出口貿(mào)易,危害人們的健康[5]。黃曲霉(Aspergillusflavus)是一種腐生型好氧真菌,也是研究報(bào)道最多的黃曲霉毒素產(chǎn)生菌[6]。黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的致癌力最強(qiáng)的天然物質(zhì),主要包含黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)等類型,對(duì)人和動(dòng)物肝臟具有較強(qiáng)破壞作用,可誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌等疾病,具有劇毒性、致突變性、強(qiáng)致癌性等特點(diǎn),其中AFB1毒性和致癌性最強(qiáng)[7]。黃曲霉毒素污染問題一直深受世界各國關(guān)注,并制定了一系列限量標(biāo)準(zhǔn),歐盟規(guī)定直接食用的花生中AFB1限量為2.0 μg/kg,日本規(guī)定所有食品中AFB1含量不得超過10 μg/kg[8]。我國也對(duì)食品中AFB1含量制定了限量標(biāo)準(zhǔn)[9],見表1。

本研究通過將黃曲霉接種于12種常見花生品種,在接種后檢測(cè)不同花生品種對(duì)黃曲霉抗性,并通過高效液相色譜—柱后衍生法檢測(cè)不同花生品種黃曲霉毒素B1含量,以期為不同花生品種黃曲霉污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試花生品種

LH20、LH29、LH940、LH744,由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院風(fēng)沙地改良利用研究所提供;HH15、HH22、HH40、HH9102,由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;SH9、SH14、SH33、SH48,由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.2 供試菌株

黃曲霉sy15,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉13～15 g、蒸餾水1 000 ml。

1.1.4 供試設(shè)備及試劑

安捷倫1200型高效液相色譜儀、C18色譜柱(250mm×4.6 mm,5 μm)、AURA光化學(xué)柱后衍生器、黃曲霉毒素免疫親和柱。

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 μg/ml)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、超純水。

1.2 方法

1.2.1 黃曲霉孢子懸浮液制備

將黃曲霉種接種PDA平板上,置于恒溫培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)48 h,向其中加入無菌水(含0.1 g/100 ml吐溫80和0.1 g/100 ml瓊脂粉),震蕩混勻,調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度為1×105cfu/ml。

1.2.2 黃曲霉室內(nèi)接種

花生莢果手工去殼,每個(gè)品種選取大小一致、成熟、飽滿、健康、無破損的花生種子50粒,70%酒精表面消毒1 min,無菌ddH2O沖洗3次,將花生種子置于無菌培養(yǎng)皿中,加入5 ml黃曲霉孢子懸浮液,輕搖培養(yǎng)皿,將黃曲霉孢子懸浮液均勻分布在花生種子上,封口膜封口,以加入5 ml無菌水(含0.1 g/100ml吐溫80和0.1 g/100 ml瓊脂粉)的處理作為空白對(duì)照,每個(gè)處理3次重復(fù)。接種后的花生種子置于培養(yǎng)箱中,28 ℃,濕度80%～90%黑暗培養(yǎng)7 d,測(cè)定侵染率并計(jì)算侵染指數(shù)。

1.2.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

花生種子感染程度(N)分5級(jí)[6]:0級(jí),種子表面無黃曲霉;1級(jí),種子表面黃曲霉覆蓋率15%以下;2級(jí),種子表面黃曲霉覆蓋率16%～30%;3級(jí),種子表面黃曲霉覆蓋率31%～50%;4級(jí),種子表面黃曲霉覆蓋率50%以上。

N0、N1、N2、N3、N4分別代表0、1、2、3、4級(jí)花生種子數(shù),N代表花生種子總數(shù)。

抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]:免疫(I),不發(fā)病;高抗(HR),侵染指數(shù)<20%;中抗(MR),20%≤侵染指數(shù)<30%;中感(MS),30%≤侵染指數(shù)<50%;高感(HS),侵染指數(shù)≥50%。

1.2.4 HPLC-柱后衍生法檢測(cè)花生中黃曲霉毒素B1含量

1.2.4.1 色譜條件

流動(dòng)相甲醇—乙腈—水(40∶18∶42),進(jìn)樣量20 μl,流速1.0 ml/min,熒光檢測(cè)器激發(fā)波長360 nm,發(fā)射波長450 nm。

1.2.4.2 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋

將2 μg/ml黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液加入甲醇稀釋成100 ng/ml的溶液,備用。

1.2.4.3 待測(cè)樣品制備

分別稱取未接種花生和感病后花生各10 g,分別加入NaCl 2 g,80%乙腈溶液50 ml,高速勻質(zhì)攪拌器(25 000 r/min)攪拌5 min,過濾,量取濾液10 ml,加入磷酸鹽緩沖液40 ml混勻,玻璃纖維濾紙過濾。取濾液20 ml,以自然重力通過免疫親和柱,以30 ml超純水加壓洗脫親和柱,棄去洗脫液,再用2 ml甲醇洗脫,收集洗脫液。

1.2.4.4 樣品檢測(cè)

將黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液與待測(cè)樣品洗脫液氮吹干,1 ml流動(dòng)相復(fù)溶,玻璃纖維濾紙過濾,轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶,以1.2.3.1的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 24軟件進(jìn)行差異顯著性分析(Duncan’s test);Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉室內(nèi)接種

黃曲霉sy15可不同程度侵染12份花生品種,如表2所示,侵染率均大于50%,但侵染率與侵染指數(shù)無明顯相關(guān)性。12份供試花生品種對(duì)黃曲霉的抗性水平表現(xiàn)為:高抗品種2份,分別為LH744和SH9,占供試品種的16.7%;中抗品種3份,分別為LH29、LH940和SH33,占供試品種的25%;中感品種5份,分別為HH15、HH40、HH9102、SH14、SH48,占供試品種的41.7%;高感品種2份,分別為LH20和HH22,占供試品種的16.7%,未發(fā)現(xiàn)免疫品種。

表2 不同品種花生的侵染率與侵染指數(shù)Table 2 Infection rate and infection index of different peanut varieties

2.2 黃曲霉毒素B1檢測(cè)

采用HPLC-柱后衍生法檢測(cè)花生中黃曲霉毒素B1含量,結(jié)果顯示12份花生品種接種黃曲霉后,黃曲霉毒素B1含量差異顯著,其中HH22花生品種黃曲霉毒素B1含量最高,達(dá) 378.14 μg/kg,其次是 LH29,達(dá)365.10 μg/kg,SH48花生品種黃曲霉毒素B1含量最低,為27.92 μg/kg。

圖1 不同品種花生黃曲霉毒素B1含量Figure 1 AFB1content of different peanut varieties

3 討論

花生是最容易受黃曲霉侵染的作物之一,黃曲霉污染嚴(yán)重威脅花生制品的安全和消費(fèi)者的健康,是制約花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展最重要的因素之一[10]。供試的12份花生品種均可受到黃曲霉侵染,但不同品種侵染率和侵染指數(shù)不同,且侵染率與侵染指數(shù)無顯著相關(guān)性,即有些品種容易受黃曲霉侵染,但發(fā)病程度較低,有些品種相對(duì)不易受黃曲霉侵染,但一旦侵染,發(fā)病程度較高?；ㄉ鷮?duì)黃曲霉抗性存在兩種類型:一是對(duì)侵染的抗性,主要依靠種皮的特性及完整度等特點(diǎn)抵御黃曲霉菌的入侵和定殖[11];另一種是對(duì)產(chǎn)毒的抗性,主要是抑制黃曲霉侵染后產(chǎn)生毒素,這種抗性與黃曲霉的侵染率無相關(guān)性[12]。本研究證實(shí)了不同花生品種抗黃曲霉的侵染性和抗產(chǎn)毒性不同,且提供了一種花生黃曲霉毒素的檢測(cè)方法,為不同花生品種黃曲霉污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定基礎(chǔ)。