3D生物打印在牙再生領(lǐng)域的研究進(jìn)展

宋春艷 馬思佳 孟宇鵬 孫耕天 錢明

摘 要：牙周牙髓疾病嚴(yán)重影響人們正常工作和生活。常規(guī)治療方法是牙周潔治、刮治、根面平整和根管治療。由于其在恢復(fù)正常牙體組織方面存在一定的局限性，因此基于組織工程的牙再生技術(shù)應(yīng)運而生。牙再生是通過干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化，并最終形成部分或完整牙齒結(jié)構(gòu)的過程，在實際臨床應(yīng)用中意義非凡。近年來，3D生物打印技術(shù)受到國內(nèi)外研究學(xué)者的青睞，其可跳過細(xì)胞接種程序，直接將細(xì)胞和生物材料精確放置在三維結(jié)構(gòu)內(nèi)的預(yù)定位置，在組織工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前，越來越多的學(xué)者將3D生物打印用于牙再生領(lǐng)域的研究中?；诖耍恼職w納總結(jié)了3D生物打印在牙再生領(lǐng)域中的應(yīng)用，希望對今后的相關(guān)研究提供一些理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：生物打印;牙再生;組織工程

中圖分類號：R78? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? 文章編號：1001-5922（2021）10-0081-05

The Research Progress of 3D Bioprinting in Tooth Regeneration

Song Chunyan， Ma Sijia， Meng Yupeng， Sun Gengtian， Qian Ming

（Department of Prosthodontics， Stomatological Hospital of Jilin University， Changchun 130021， China ）

Abstract：Periodontal pulp disease seriously affects peoples normal work and life. The conventional treatment methods are periodontal cleansing， curettage， root planing and root canal treatment. Due to its limitations in restoring normal tooth tissues， tooth regeneration techniques based on tissue engineering have emerged. Tooth regeneration is the process of separating， culturing， and inducing differentiation of stem cells， and finally forming a partial or complete tooth structure， which is of great significance in practical clinical applications. In recent years， 3D bioprinting technology has been favored by research scholars at home and abroad. It can skip the cell seeding procedure and directly place cells and biological materials at predetermined positions within the three-dimensional structure. It is widely used in the field of tissue engineering. At present， more and more scholars are using 3D bioprinting for research in the field of tooth regeneration. Based on this， this paper summarizes the application of 3D bioprinting in the field of tooth regeneration， hoping to provide some theoretical guidance for related research in the future.

Key words：bioprinting;tooth regeneration;tissue engineering

牙齒在人的一生中承擔(dān)著重要功能，不僅可以維持美觀，還參與咀嚼、消化、營養(yǎng)吸收等活動。而感染、外傷、先天疾病常常導(dǎo)致牙周牙髓疾病，前者可引起牙齦出血、牙槽骨吸收，甚至牙齒松動、脫落，而后者可造成牙齒變色、疼痛。有研究表明，牙周疾病還與多種全身疾病相關(guān)，包括糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系統(tǒng)疾病、癌癥等[1-2]。傳統(tǒng)治療方法存在一定的不足：常規(guī)牙周治療只能阻止疾病的發(fā)生發(fā)展，不能再生牙周組織;而根管治療會導(dǎo)致牙齒失去營養(yǎng)支持，脆性增加，進(jìn)而造成牙折的發(fā)生率大大上升。近年來出現(xiàn)了牙髓血運重建（Pulp revascularization）、引導(dǎo)組織再生（Guide tissue regeneration，GTR）、引導(dǎo)骨再生（Guided bone regeneration，GBR）等[3]新方法，但其適應(yīng)癥嚴(yán)格且效果有限。因此，如何恢復(fù)正常的牙體組織成為近年來的研究熱點。研究顯示，基于組織工程的牙再生是解決這一問題的有效手段。而3D生物打印作為一項新技術(shù)，在組織工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如皮膚、神經(jīng)、肝臟、心血管、骨或軟骨系統(tǒng)等[4-8]。近年來，通過3D生物打印進(jìn)行牙再生受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本文就3D生物打印在牙再生領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 3D生物打印的概述

3D生物打印是由計算機(jī)科學(xué)、組織工程、再生醫(yī)學(xué)等多學(xué)科交叉所組成的一種新興技術(shù)。與傳統(tǒng)3D打印相比，其優(yōu)勢在于可加載細(xì)胞，并控制不同種類的細(xì)胞在打印體的密度和分布，更好地模擬體內(nèi)過程[4]。其中，生物墨水是3D生物打印的“原始材料”，主要由細(xì)胞和水凝膠組成。理想的生物墨水應(yīng)具有以下特征[9]：一定的機(jī)械性能，良好的生物相容性，適宜的流變特性以及可生物降解性等。

3D生物打印的基本原理主要包括：生物自組裝、微型組織單元、仿生學(xué)。生物自組裝是指分子在沒有外部因素指導(dǎo)的情況下通過非共價相互作用締合來形成高度有序的三維結(jié)構(gòu)的能力;微型組織單元是3D生物打印的最小復(fù)合組織單位，可以是球形的組織球或圓柱形的組織束[10];仿生學(xué)是指3D生物打印體是通過模擬體內(nèi)生物體的結(jié)構(gòu)和功能來完成的，通常是通過打印載有細(xì)胞的水凝膠來實現(xiàn)的[11-12]?；具^程如下：首先通過用戶界面進(jìn)行設(shè)計或計算機(jī)斷層掃面/核磁共振成像/超聲成像技術(shù)獲取目標(biāo)組織的結(jié)構(gòu)特征，然后利用計算機(jī)輔助設(shè)計/計算機(jī)輔助制造技術(shù)生成復(fù)雜的3D圖像，最后通過在基板上自動沉積載有細(xì)胞的生物墨水來形成復(fù)雜的3D仿生組織結(jié)構(gòu)[13-14]。

2 3D生物打印的分類

2.1 噴墨生物打印

噴墨生物打印是第一個生物打印技術(shù)，與傳統(tǒng)的二維噴墨打印十分相似，通過噴射細(xì)胞和水凝膠的小液滴來構(gòu)建組織[15]。其優(yōu)勢在于低打印成本，高打印速度以及高細(xì)胞存活率。但是其在粘度和細(xì)胞密度方面存在一定的局限性。此外，該技術(shù)中的液體沉降效應(yīng)可能會堵塞噴頭[15]。

2.2 激光輔助生物打印

激光輔助生物打印源自激光直接寫入和激光誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)印技術(shù)，使用激光蒸發(fā)供體層中的區(qū)域形成氣泡，推動懸浮的生物墨水掉落到基材上[15]。其可避免分配器與生物墨水的直接接觸[2]，獲得高細(xì)胞活力和分辨率[16-17]。此外，其可打印高粘度和多種類型的生物墨水。但是，其價格高昂且控制系統(tǒng)復(fù)雜，在一定程度上限制了該技術(shù)的使用。

2.3 擠壓式生物打印

擠壓式生物打印是噴墨式打印的一種改進(jìn)，通過使用氣動或手動力連續(xù)擠壓細(xì)胞-水凝膠溶液，形成不間斷的圓柱線[15]。其打印范圍廣泛，幾乎各種粘度和細(xì)胞密度的生物墨水均可打印。但是，其在細(xì)胞活力、分辨率以及打印速率方面不甚理想[17]。

2.4 其他

以上3種是組織工程領(lǐng)域生物打印最常用的類型，除此之外，立體光刻技術(shù)、微流體技術(shù)、數(shù)字光處理技術(shù)、多噴頭系統(tǒng)、核殼針系統(tǒng)等被用于多種材料的生物打印當(dāng)中來制造多材料異質(zhì)仿生組織[15-18]。

3 3D生物打印在牙再生中的應(yīng)用

3.1 牙髓-牙本質(zhì)的再生

牙髓是一種富含神經(jīng)、血管的軟組織，具有營養(yǎng)、感覺和防御各種病原體的功能。此外，它還可以產(chǎn)生牙本質(zhì)并保持牙本質(zhì)的生物學(xué)和生理活力。牙髓炎是與牙髓有關(guān)的最常見疾病之一，通常由齲病和外傷引起。傳統(tǒng)的根管治療無法再生牙髓組織。研究顯示，已經(jīng)有學(xué)者通過3D生物打印進(jìn)行牙髓-牙本質(zhì)的再生。牙髓干細(xì)胞（Dental pulp stem cells，DPSC）、來自根尖乳頭的干細(xì)胞（Apical papilla stem cells，SCAP）、來自人類脫落乳牙的干細(xì)胞（Human exfoliated deciduous teeth，SHED）等干細(xì)胞都已經(jīng)用于牙髓-牙本質(zhì)的再生。但目前為止，僅DPSC和SCAP用于3D生物打印的牙髓-牙本質(zhì)的再生中。

生物墨水作為3D生物打印的關(guān)鍵，需要具備適宜的物理、化學(xué)以及生物學(xué)性能。國內(nèi)外學(xué)者在探索適合牙再生的生物墨水方面進(jìn)行了一些研究，并取得了部分成果，主要包括纖維蛋白、膠原蛋白、海藻酸鈉/明膠水凝膠、甲基丙烯酸明膠（Gelatin methacrylate，GelMA）以及一些新型生物墨水。薛世華等[19]和Yu等[20]都對DPSC/海藻酸鈉/明膠混合物的生物打印進(jìn)行初步探索。前者發(fā)現(xiàn)DPSC在三維結(jié)構(gòu)體內(nèi)生長狀態(tài)較好，具有87%左右的細(xì)胞活力，為3D生物打印在牙再生的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。而后者發(fā)現(xiàn)，與單純水凝膠裝載細(xì)胞相比，通過3D生物打印方式裝載細(xì)胞更能促進(jìn)DPSC在水凝膠的生長、粘附、增殖和分化，證明了3D生物打印在構(gòu)造三維結(jié)構(gòu)體方面的優(yōu)越性。

為促進(jìn)細(xì)胞向牙源性分化，有學(xué)者開發(fā)了新型生物墨水，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）模擬肽生物墨水、牙本質(zhì)衍生的生物墨水以及基于核苷酸脂質(zhì)的生物墨水。BMP是整形外科領(lǐng)域常用的生長因子，已獲得美國FDA的批準(zhǔn)。于是，Park等[21]將硫醇化的BMP模擬肽偶聯(lián)到基于GelMA的生物墨水進(jìn)行3D生物打印，檢測細(xì)胞活力和分化情況。結(jié)果顯示，DPSC的活力超過90%，且與對照組相比，BMP模擬肽組鈣化程度更高，牙本質(zhì)唾液磷蛋白和骨鈣素表達(dá)更穩(wěn)定。有研究顯示，牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白保留了天然細(xì)胞粘附精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸和基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)合位點，對于細(xì)胞的生存、增殖、分化都至關(guān)重要。基于此，Athirasala等[22]開發(fā)了牙本質(zhì)衍生的水凝膠生物墨水用于牙再生的生物打印，用小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞系進(jìn)行初始細(xì)胞相容性研究，SCAP用于細(xì)胞活力和分化的檢測。結(jié)果顯示，該新型生物墨水在各種濃度下均可以顯示出高的細(xì)胞活力，且當(dāng)海藻酸鈉和牙本質(zhì)基質(zhì)為1∶1時，至少5d內(nèi)的活細(xì)胞百分比高于90%，且可以增強細(xì)胞的牙源性分化。Dessane等[23]還報道了一種基于核苷酸脂質(zhì)的生物墨水，通過擠壓式生物打印，可獲得適宜的機(jī)械性能和生物學(xué)特性，其裝載的牙齦成纖維細(xì)胞和SCAP活力和增殖均較理想。

除了生物墨水的探索之外，也有學(xué)者利用3D生物打印促進(jìn)了真正的牙髓-牙本質(zhì)的再生。Khayat等[24]用GelMA水凝膠封裝DPSC/人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，植入牙齒根管內(nèi)并在動物體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，細(xì)胞附著在牙根內(nèi)牙本質(zhì)的表面，并向牙本質(zhì)小管延伸，最終形成了牙髓樣組織和修復(fù)性牙本質(zhì)基質(zhì)。Han等[25]通過3D生物打印，基于含DPSC的不同濃度的纖維蛋白生物墨水分別模擬牙髓和牙本質(zhì)，以可生物降解的聚己內(nèi)酯重現(xiàn)牙齒三維整體形狀，最終得到了具有特定形狀和大小的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。而Campos等[26]還開發(fā)了手持式生物打印技術(shù)，使用具有適當(dāng)生物學(xué)特性的膠原蛋白生物墨水進(jìn)行生物打印，最終實現(xiàn)了體外根管內(nèi)的血管生成。由于該技術(shù)操作簡單又方便，在實際臨床工作中實用性強。

綜上所述，選擇合適的干細(xì)胞和水凝膠組成生物墨水，通過3D生物打印技術(shù)可以促進(jìn)牙髓-牙本質(zhì)的再生，在今后的臨床應(yīng)用中具有巨大潛力。

3.2 牙周組織再生

牙周組織也叫牙齒支持組織，包括牙齦、牙周膜、牙骨質(zhì)、固有牙槽骨，對于支持、穩(wěn)定、營養(yǎng)牙齒具有重要作用。牙周炎是牙周組織發(fā)生的慢性感染性疾病，是成年人牙齒脫落的主要原因。傳統(tǒng)的潔治、刮治不能再生牙周組織，3D生物打印或許可以成為牙周組織再生的一種策略。研究顯示，DPSC、SHED、SCAP、牙周膜干細(xì)胞（Periodontal Ligament Stem Cells，PDLSC）、牙囊干細(xì)胞（Dental follicle stem cells，DFSC）等均可以進(jìn)行牙周組織的再生[3]。但據(jù)目前的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，僅DPSC、PDLSC已經(jīng)用于3D生物打印牙周組織的再生。

優(yōu)化生物打印系統(tǒng)是利用三維構(gòu)建體治療牙周疾病的第一步。于是，Raveendran等[27]探討了PDLSC在3D生物打印中的優(yōu)化，該研究基于微擠壓式生物打印系統(tǒng)，研究了明膠/GelMA水凝膠前體的可印刷性，并評估了不同打印參數(shù)如壓力、打印針頭直徑、GelMA及光引發(fā)劑濃度、紫外線暴露時間等對PDLSC活力的影響。結(jié)果表明，使用25號針頭以135kPa的壓力擠出具有0.05%光引發(fā)劑的12.5%GelMA溶液，并進(jìn)行20s的紫外交聯(lián)可獲得最佳打印效果，且PDLSC可維持至少14d的細(xì)胞活力。通過選擇最佳打印條件，實現(xiàn)PDLSC在3D生物打印的高分辨率、尺寸穩(wěn)定性和細(xì)胞活力，在今后3D生物打印在牙周病的應(yīng)用具有很大潛力。徐娟等[28]探討了PDLSC作為種子細(xì)胞，聚己內(nèi)酯作為支架材料，進(jìn)行3D生物打印的可行性。其將聚己內(nèi)酯支架和種子細(xì)胞分期打印，并與海藻酸鈉-明膠水凝膠進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，聚己內(nèi)酯組PDLSC活性更好，且得到的特定形狀和大小的3D打印體與缺損尺寸完全匹配。Ma等[29]基于3D生物打印，通過控制GelMA和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的體積比來生成具有ECM梯度的并裝載細(xì)胞的3D水凝膠陣列，并研究陣列中PDLSC的變化，發(fā)現(xiàn)體積比為4/1的水凝膠對于維持細(xì)胞活力最佳，且在體內(nèi)可促進(jìn)骨缺損修復(fù)。Xin等[30]利用包括PDLSC在內(nèi)的6種細(xì)胞懸液作為生物墨水，并通過電噴霧技術(shù)進(jìn)行生物打印，結(jié)果顯示，該技術(shù)未對細(xì)胞活力和增殖產(chǎn)生明顯負(fù)面影響，為其在牙再生的應(yīng)用提供了希望。

骨再生是牙周組織再生的難點之一。有學(xué)者通過3D生物打印促進(jìn)牙周組織的骨再生。Dubey等[31]建立了一種新型的生物墨水配方，將細(xì)胞外基質(zhì)基水凝膠與非晶態(tài)磷酸鎂（AMP）顆粒結(jié)合，并分析其中DPSC的細(xì)胞狀態(tài)和成骨分化水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，含有AMP的生物墨水中細(xì)胞生長狀態(tài)更佳，細(xì)胞活力在90%左右，且成骨基因的表達(dá)和礦化水平更為顯著。Dubey等[32]開發(fā)了一種纖維增強的水凝膠，通過將聚（ε-己內(nèi)酯）纖維網(wǎng)融合到具有生物活性的AMP的明膠中，制備了機(jī)械性能和治療功能均可調(diào)的GelMA水凝膠。其中，AMP和聚（ε-己內(nèi)酯）的多孔結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)機(jī)械性能并改善成骨效果，有利于GBR。體內(nèi)和體外結(jié)果表明，通過生物打印制備的聚（ε-己內(nèi)酯）網(wǎng)絡(luò)可以延遲水凝膠的降解，防止軟組織的侵入，并提供機(jī)械屏障，使遷移較慢的具有成骨分化能的細(xì)胞參與骨骼再生。

綜上，通過優(yōu)化生物墨水以及打印條件，并利用3D生物打印進(jìn)行牙周組織的再生是行之有效的策略，為牙周炎的患者帶來了新希望。

4 結(jié)語

綜上所述，3D生物打印技術(shù)為牙髓-牙本質(zhì)以及牙周組織的再生開辟了一條嶄新的道路，在實際臨床工作中具有重要意義。目前，傳統(tǒng)的3D打印在牙再生領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[33]，并取得了較為理想的成果。而更先進(jìn)的3D生物打印由于可以控制細(xì)胞的分布和密度，在牙再生領(lǐng)域擁有更多優(yōu)勢和更廣闊的應(yīng)用前景，為牙再生提供了新思路。但該技術(shù)仍處于初期的探索階段，在微環(huán)境的構(gòu)造和干細(xì)胞的來源方面仍存在局限性，未來的發(fā)展可集中于這兩個方面進(jìn)行?？偠灾ㄟ^3D生物打印進(jìn)行牙再生兼具希望與挑戰(zhàn)。

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