液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血清中尿素含量

唐強(qiáng)

摘 要：針對(duì)傳統(tǒng)血清中尿素含量測(cè)定方法操作困難，準(zhǔn)確度低的問(wèn)題，提出液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定尿素中血清含量。分別對(duì)兩種濃度水平下水清中尿素濃度定值，精準(zhǔn)測(cè)試盲樣中尿素含量。全面分析了影響血清中尿素含量的因素，并根據(jù)分析結(jié)果對(duì)其不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血清中尿素含量相對(duì)偏差（RSD）均小于1%。對(duì)兩種濃度水平的血清進(jìn)行測(cè)定，不確定度分別為1.2%和0.84%，這就證明本文所建立的方法測(cè)量血清中尿素含量比較準(zhǔn)確，且原理比較可靠，定量比較準(zhǔn)確，前處理簡(jiǎn)單，可以當(dāng)做血清中尿素含量測(cè)定的候選參考方法。

關(guān)鍵詞：血清;尿素;同位素稀釋質(zhì)譜法;液相色譜

中圖分類(lèi)號(hào)：R446.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? 文章編號(hào)：1001-5922（2021）10-0033-04

Determination of Urea in Serum by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Tang Qiang

（Hunan College of Foreign Studies， Changsha 410116， China）

Abstract：Aiming at the problems of difficult operation and low accuracy of traditional methods for the determination of urea in serum， a liquid chromatography tandem mass spectrometry method was proposed to determine the content of urea in serum. Determine the concentration of urea in the water at two concentration levels， and accurately test the urea content in the blind sample. The factors affecting the content of urea in the serum were comprehensively analyzed， and the uncertainty was evaluated based on the analysis results. The results showed that the relative deviation （RSD） of urea content in serum determined by liquid chromatography tandem mass spectrometry was less than 1%. The uncertainty of urea in two concentrations of serum was 1.2% and 0.84% respectively， which prove that the method established in this paper is more accurate in measuring serum urea content， and the principle is more reliable， the quantification is more accurate， and the pretreatment is simple， it can be used as a candidate reference method for the determination of urea content in serum.

Key words：serum; urea; isotope dilution mass spectrometry; liquid chromatographypounds

尿素是人體內(nèi)氨基酸分解代謝的產(chǎn)物，受肝臟功能和蛋白質(zhì)攝入量影響。在臨床醫(yī)學(xué)中，尿素代謝是反映腎功能情況的非特異性性指標(biāo)，也是在正常人普通飲食的情況下，一項(xiàng)較為敏感的指標(biāo)。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)血清中尿素含量是臨床醫(yī)學(xué)中，非常重要的一項(xiàng)研究。目前較為常見(jiàn)的血清中尿素測(cè)定方法有脲酶速率法[1]、離子電導(dǎo)法[2]、二乙酰肟法[3]，這些方法雖然能夠檢測(cè)出血清中尿素的含量，但精準(zhǔn)度還需要進(jìn)一步提高。針對(duì)以上方法存在的問(wèn)題，張鵬[4]提出氣相色譜/同位素稀釋質(zhì)譜法，為病人血清提供了一個(gè)高度準(zhǔn)確的測(cè)定工具。但該方法存在測(cè)試過(guò)程困難，衍生化試劑使用條件嚴(yán)格，衍生化反應(yīng)所需時(shí)間長(zhǎng)，步驟繁瑣的問(wèn)題，使得尿素的測(cè)定出現(xiàn)新的難題?；诖?，文章嘗試對(duì)氣相色譜/同位素稀釋質(zhì)譜法進(jìn)行改進(jìn)，將液相色譜作為分離系統(tǒng)，以串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)血清中尿素含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其不確定度因素進(jìn)行分析，為血清中尿素含量測(cè)定提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

本試驗(yàn)主要材料為：人血清干粉（上海極威生物科技有限公司，GR）、尿素標(biāo)記物（內(nèi)蒙鄂爾多斯聯(lián)合化工，純度>99%）、尿素純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，純度99.9%，不確定度0.2%，k=2）、甲醇（武漢強(qiáng)松精細(xì)化學(xué)品有限公司，高效液相色譜級(jí)）、乙腈（泉州市一海三路科技有限公司，高效液相色譜級(jí)）。

本試驗(yàn)主要設(shè)備為：電子天平（濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司，BSA124S）、超低溫冰箱（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，BDF-86V50）、移液器（河北慧采科技有限公司，C9722）、旋渦振蕩器（濟(jì)南愛(ài)來(lái)寶儀器設(shè)備有限公司，88882010）、液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀（上海佐明機(jī)械設(shè)備貿(mào)易有限公司，6410B）。

1.2 試驗(yàn)原理

試驗(yàn)主要使用液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）檢測(cè)血清中尿素含量。將液相色譜作和串聯(lián)質(zhì)譜分別作為分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。在分析血清中尿素含量時(shí)，提前對(duì)血清樣品進(jìn)行相關(guān)處理，然后將其導(dǎo)入液相色譜部分，讓處理過(guò)的血清樣品在液相色譜中完成流動(dòng)相分離的過(guò)程。樣品被離子化后，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器按質(zhì)量數(shù)將離子碎片分開(kāi)，然后再由檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖[5]。液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在熱不穩(wěn)定化合物的分析測(cè)定、機(jī)型化合物的分析測(cè)定、不揮發(fā)性化合物分析測(cè)定和大分子量化合物的分析方面進(jìn)行測(cè)定。液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具體組成如圖1所示[6]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 血清樣品的制備

（1）從超低溫冰箱中取出經(jīng)過(guò)處理的血清樣品，在室溫條件下靜置，待其達(dá)到平衡。將5ml高純?nèi)嗡c血清干粉混合均勻，稱(chēng)量記錄水的質(zhì)量。

（2）將一定體積的13C和15N2尿素標(biāo)記物放入待測(cè)樣品中，13C和15N2的加入量需要根據(jù)尿素濃度確定。加入標(biāo)記物后，其余尿素含量比值大約為1∶1。準(zhǔn)確稱(chēng)量血清重量并記錄。

（3）將血清震蕩混合均勻后，置于室溫環(huán)境下平衡1h，加入血清1/3體積的乙腈試劑，混合均勻靜置，等待蛋白質(zhì)沉淀后，將上層清液取出，用乙腈試劑將上層清液稀釋至1μg/g后，用有機(jī)相濾膜進(jìn)行過(guò)濾，用ID-LC/MS/MS進(jìn)行分析。尿素測(cè)量條件如表1、表2所示[7-8]。

1.3.2 分析過(guò)程

（1）將4個(gè)校準(zhǔn)比值混合溶液進(jìn)行進(jìn)樣，進(jìn)樣順序?yàn)閺牡蜆?biāo)到高標(biāo)。對(duì)混合溶液中尿素含量進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取其平均值為最終結(jié)果。將尿素和尿素標(biāo)記物質(zhì)量比值作為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)RSD確定其準(zhǔn)確度，若結(jié)果RSD大于1%，則該結(jié)果不可用，試驗(yàn)數(shù)據(jù)舍去，全部重新開(kāi)始。將尿素與尿素標(biāo)記物質(zhì)量比對(duì)峰面積作圖，考查曲線線性回歸方程平方，根據(jù)考察結(jié)果判斷其準(zhǔn)確度，若考查結(jié)果比0.999小，則試驗(yàn)數(shù)據(jù)舍棄，重新進(jìn)行試驗(yàn)。

（2）血清樣品和其對(duì)應(yīng)校準(zhǔn)比值混合溶液一起進(jìn)行分析測(cè)定，進(jìn)樣次序?yàn)闃悠窊诫s在高低標(biāo)之間，若結(jié)果RSD大于1%，則該結(jié)果不可用，試驗(yàn)數(shù)據(jù)舍去，全部重新開(kāi)始。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，將平均值作為最終結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 血清測(cè)定結(jié)果

表3、表4分別為兩種濃度血清（血清A和血清B）括號(hào)法動(dòng)量測(cè)試結(jié)果。以此結(jié)果進(jìn)行不確定度的分析。

2.2? 不確定度分析

通過(guò)計(jì)算公式可以知道影響血清中尿素含量測(cè)試結(jié)果的因素，主要由隨機(jī)因素和系統(tǒng)因素構(gòu)成。在此對(duì)影響血清中尿素含量因素的影響進(jìn)行詳細(xì)分析。

2.2.1 隨機(jī)因素不確定度分析

隨機(jī)因素產(chǎn)生的不確定度主要是由測(cè)量變動(dòng)引起的，因此可用測(cè)量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差表示隨機(jī)因素不確定度，為簡(jiǎn)化計(jì)算過(guò)程，這里的標(biāo)準(zhǔn)偏差為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差[9-10]。

2.2.2非隨機(jī)因素不確定度分析

（1）稱(chēng)量的不確定度。在分析過(guò)程中，主要有校準(zhǔn)物、校準(zhǔn)溶液、標(biāo)記物、標(biāo)記物溶液、血清樣品稱(chēng)量，在稱(chēng)量的過(guò)程中，都有可能造成一定不確定度。

工作標(biāo)記物溶液和工作校準(zhǔn)溶液的稱(chēng)量比100mg高，電子天平最大不確定度為0.05mg，則工作標(biāo)記物和校準(zhǔn)溶液相對(duì)不確定度為0.05/100=0.05%;純品校準(zhǔn)物重量比20mg多，天平最大不確定度為5.0μg，則純品校準(zhǔn)物不確定度為0.005/20=0.025%;標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液重量大于1g，天平不確定度為0.05mg，則標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液不確定度為0.005/100=0.005%;血清樣品重量超過(guò)100mg，天平不確定度為0.05mg，則血清樣品不確定度為0.05/300=0.17%。

（2）校準(zhǔn)物純度不確定度。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)給出校準(zhǔn)物質(zhì)純度不確定度。

2.3? ?不確定度計(jì)算

2.3.1 尿素測(cè)定不確定度

（1）校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度帶來(lái)的不確定度UB1。尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為GBW09201，濃度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度和標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為99.9%，0.2%和0.1%（由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心給出）。

（2）天平稱(chēng)量帶來(lái)的不確定度UB2。天平稱(chēng)量帶來(lái)的不確定度與稱(chēng)量的不確定度一致。用2點(diǎn)校準(zhǔn)法對(duì)該不確定度進(jìn)行確定，在本研究中，所有天平稱(chēng)量皆為對(duì)不確定度最大貢獻(xiàn)合成，則該工作校準(zhǔn)溶液貢獻(xiàn)為3次，工作標(biāo)記物貢獻(xiàn)為4次。天平稱(chēng)量不確定度為：

（3）隨機(jī)因素不確定度 UA。隨機(jī)因素帶來(lái)的不確定度由測(cè)量結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，具體計(jì)算為：

血清中尿素A：

其擴(kuò)展不確定度為：U=k×uc=0.59%×2≈1.2%

血清中尿素B：

其擴(kuò)展不確定度為：U=k×uc=0.42%×2≈0.84%

2.4 對(duì)比樣品定值結(jié)果

由上述公式計(jì)算結(jié)果，確定樣品定值結(jié)果為：

血清中尿素-水平A：556.45μg/g，不確定度為1.2%，K=2。

血清中尿素-水平B：1123μg/g，不確定度為0.84%，K=2。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用13C，15N2-尿素為內(nèi)標(biāo)，乙腈為沉淀蛋白， 建立了液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血清中尿素含量。以兩種濃度水平的血清樣品為指標(biāo)進(jìn)行定值，測(cè)定盲樣中血清含量，分析了盲樣測(cè)定結(jié)果中的不確定度。結(jié)果表明，兩種水平血清中尿素不確定度分別為1.2%和0.84%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均不大于1%，證實(shí)了文章建立的液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法的可靠性。

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