下調(diào)IncRNA ZFAS1通過miR-302-3p調(diào)節(jié)CCND1抑制甲狀腺癌的機制研究

陳文靜 翟麗麗 劉惠銘 于兵 崔博舒 曾小軒 郭慧琦 樊偉業(yè)

摘要：目前，甲狀腺癌的治療選擇仍然有限。本研究旨在調(diào)查ZFAS1在癌癥的各種主要特征中的作用以及甲狀腺癌細胞的潛在機制。通過生物信息學預測并通過進行雙熒光素酶測定法研究長鏈非編碼RNA（lncRNA），microRNA（miRs）和靶基因之間的相互作用。通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法測定mRNA和蛋白質(zhì)表達。分別通過Transwell實驗，創(chuàng)傷修復和Cell Counting Kit-8（CCK8）分析評估細胞的侵襲，遷移和增殖活力。結果表明，lncRNA ZFAS1在甲狀腺癌組織，TT和SW579細胞中表達上調(diào)，并且與這兩種細胞系的增殖有關。值得注意的是ZFAS1的下調(diào)降低了細胞的遷移和侵襲能力，并拮抗了miR-302a-3p抑制劑對TT和SW579細胞增殖，遷移和侵襲的促進作用。此外，ZFAS1通過調(diào)控miR - 302a - 3p靶向影響cyclin D1 （CCND1），并且ZFAS1的下調(diào)不僅逆轉(zhuǎn)了miR-302a-3p抑制劑對CCND1表達以及TT和SW579細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的促進作用，而且還靶向并增加了miR-302a- 3p的表達，并進一步降低CCND1的表達，從而抑制甲狀腺癌細胞的增殖，遷移，侵襲和EMT。

【中圖分類號】R736.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）11--04

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一（1），在許多地區(qū)（1，2），例如美國（3）、韓國（4）和南歐國家（5）發(fā)病率最高。根據(jù)美國癌癥協(xié)會的最新數(shù)據(jù)，2019年有甲狀腺癌52，070例新增病例和2170例死亡病例（3）。根據(jù)其病理特征，甲狀腺癌可分為乳頭狀甲狀腺癌，濾泡性甲狀腺癌，甲狀腺髓樣癌和未分化甲狀腺癌（6）。目前，分化型甲狀腺癌的治療方法主要是手術切除，抑制甲狀腺激素，放射性碘治療和分子靶向治療（7）。然而，由于甲狀腺癌的強侵襲性和遷移性及其高度惡性，治療后許多患者經(jīng)常發(fā)生復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移（8）。因此，研究甲狀腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制及甲狀腺癌分子標記和靶標對于癌癥的治療極其重要。

長鏈非編碼（lnc）RNA是長度> 200個核苷酸且沒有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。IncRNA可以調(diào)節(jié)許多生物學過程。lncRNA參與人體生長和發(fā)育以及多種疾病的發(fā)生，例如癌癥（10）及腎小球和腎小管間質(zhì)性腎臟?。?1）。先前的研究表明，lncRNA廣泛轉(zhuǎn)錄和調(diào)控基因組，各種lncRNA在染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄、切割和翻譯等多種生物過程中起著重要作用（12）。腫瘤的基因表達譜表明了lncRNA在腫瘤中的異常表達，說明lncRNA參與了腫瘤發(fā)生的一般機制（13，14）。

ZFAS1在動脈粥樣硬化（15）和卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和肝細胞癌（16-19）等多種癌癥中起作用。 ZFAS1是預測甲狀腺癌預后的可能生物標志物（20）。 Han等人（20）研究表明（hsa）-microRNA（miRNA / miR）-150-5p和hsa-miR-590-3p是甲狀腺癌細胞中與ZFAS負相關的內(nèi)源RNA。ZFAS1通過使miR-590-3p變海綿并增加高遷移率AT-hook 2的表達來促進甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展（21）。 IncRNA使不同的miRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞功能的作用（22）。此外，據(jù)報道m(xù)iR-302a-3p在肝細胞癌（23）和胰腺導管腺癌（24）等多種疾病中起作用。長基因間非蛋白編碼RNA（LINC）01016通過調(diào)節(jié)miR-302a-3p / miR-3130-3p /核轉(zhuǎn)錄因子Y亞基α/ SATB同源盒1軸來促進子宮內(nèi)膜癌細胞的發(fā)生（25）。另外，miR-302a-3p通過抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲來抑制肝細胞癌的發(fā)展（23）。但是， miR-302a-3p在甲狀腺癌中的作用尚未報道過。

本研究調(diào)查了ZFAS1在甲狀腺癌細胞的增殖，遷移，侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）中的作用，并探索了下游miRNA和靶基因，通過該基因ZFAS1對甲狀腺癌細胞發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用。

1材料和方法

本研究得到齊齊哈爾市第一醫(yī)院倫理委員會批準（批準號：QR20180503112）。從患者（年齡范圍：28-65歲;男性，11;女性：19）中提取癌及鄰近組織（距癌組織≥5 cm）的樣本（n = 30）。本研究的患者納入標準如下：通過病理檢查確定為甲狀腺癌的患者;以及術前未接受放療或化療的患者。根據(jù)ZFAS1的中位表達值，將患者分為低表達組和高表達組。

1.細胞培養(yǎng)

Nthy-ori3-1（上海亞吉生物科技有限公司）（26），MDA-T68 [American Type Culture Collection（ATCC）]（27），SW579（ATCC）（28），B-CPAP（中國科學院細胞庫）（29）和TPC-1（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏庫）（30）細胞系將其在RPMI 1640（目錄號21875091; Thermo Fisher Scientific，Inc）中培養(yǎng)。 TT細胞（ATCC）（28）在DMEM（目錄號D0819; Sigma-Aldrich; Merck KGaA）中培養(yǎng)。培養(yǎng)基均含有10%FBS（目錄號F8192; Sigma-Aldrich; Merck KGaA），37°C，5%CO2孵箱下孵育。

2.實驗設計

研究使用小干擾（si）RNA下調(diào)ZFAS1表達的效果，將TT和SW579細胞分為以下幾組：1）對照（無轉(zhuǎn)染）;2）si-Control（用50 nM si-Control轉(zhuǎn)染）;3）si-ZFAS1（用50 nM si-ZFAS1轉(zhuǎn)染）。 si-Control（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）和si-ZFAS1（5'-CUAACUGCCUACCUGCAUATT-3'）購自上海基因制藥有限公司，并用Lipofectamine?3000（目錄號：No. L3000015; Thermo Fisher Scientific，Inc.）。為了在甲狀腺癌的特征上明確miR-302a-3p和ZFAS1之間的聯(lián)系，將TT和SW579細胞分為以下幾組：1）對照（無轉(zhuǎn)染）; 2）抑制劑陰性對照（NC;轉(zhuǎn)染50 nM miR-302a-3p抑制劑-NC; 3）抑制劑（轉(zhuǎn)染50 nM miR-302a-3p抑制劑）;4）抑制劑+ si-ZFAS1（用50 nM miR-302a-3p抑制劑和50 nM si-ZFAS1轉(zhuǎn)染）; 5）si-ZFAS1（用50 nM si-ZFAS1轉(zhuǎn)染）。 miR-302a-3p抑制劑-NC（5'- CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'）和miR-302a-3p抑制劑（5'- UCACCAAAACAUGGAAGCACUUA-3'）購自上?；蛑扑幱邢薰?，細胞（2x104個細胞）使用Lipofectamine?3000（目錄號L3000015; Thermo Fisher Scientific，Inc.）轉(zhuǎn)染/孔; 96孔板）。細胞培養(yǎng)24小時。

3.逆轉(zhuǎn)錄定量（RT-q）PCR

使用試劑（目錄號15596018;賽默飛世爾科技公司）從組織樣品和細胞（1x106個細胞）中提取總RNA。對于miRNA分析，使用TaqMan?MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（目錄號4366597; Thermo Fisher Scientific，Inc.）根據(jù)制造商的規(guī)程，對200 ng總RNA進行cDNA合成。逆轉(zhuǎn)錄條件包括：42℃30分鐘和85℃5分鐘。使用2μlcDNA溶液，5μlTaqMan 2X Perfect Master Mix（Takara Biotechnology Co.，Ltd。），0.25μl基因特異性引物和2.75μl無核酸酶的水進行定量PCR反應，最終體積為10μl。一個Bio-Rad IQ5熱循環(huán)儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.）在以下條件下：在95°C下初始變性3分鐘，然后在95°C下進行40循環(huán)30秒，在62°C下進行30秒和72次?C25秒。 U6基因用作內(nèi)部對照。為了進行mRNA分析，使用PrimeScript RT試劑盒（Takara Biotechnology Co.，Ltd。）將mRNA模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37°C 30分鐘和85°C 5分鐘。根據(jù)FastStart?Universal SYBR Green Master的協(xié)議（Rox;目錄號4913850001; Roche Diagnostics），14μl2X SYBR Green主混合物，1μl正向引物（10μM），1μl反向引物（10μM），將3μlcDNA模板和6μl雙重蒸餾的H2O混合并在Bio-Rad IQ5熱循環(huán)儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.）中在以下條件下反應：95°C持續(xù)90秒，95°C持續(xù)25秒，65 ?C持續(xù)20秒，72 30C持續(xù)30秒，持續(xù)40個循環(huán)。 GAPDH用作內(nèi)部對照。 mRNA表達水平通過2-ΔΔCq法計算（31）。

4.Transwell分析

收集對數(shù)生長期TT和SW579細胞（1x106），并吸移到預先涂有Matrigel（BD Bioscience; 37°C）的Transwell插入物（8-μm）的上腔室（含無血清培養(yǎng)基）中。（持續(xù)4小時）。在下腔室中添加了在400μl培養(yǎng)基中混合的10%FBS。 Transwell在37°C和5%CO2中孵育24小時。接下來，用棉簽除去保留在上腔室表面上的細胞，將侵襲的細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定15分鐘，然后在室溫下用0.2%結晶紫染色10分鐘。在光學顯微鏡下（放大倍數(shù)，×200）觀察下腔室中的細胞，并使用Image J軟件（1.8.0版;美國國立衛(wèi)生研究院）對細胞進行計數(shù)。

5. 生物信息學和雙熒光素酶報告基因分析

ZFAS1和miR - 302a - 3p以及cyclin D1 （CCND1）和miR - 302a - 3p之間的相互作用是由Starbase（版本2.0;http：//starbase.sysu.edu.cn）預估。ZFAS1和CCND1的突變體是使用快速改變位點定向突變試劑盒（安捷倫技術公司）構建的。編碼熒光素酶報告基因的質(zhì)粒pGL3購自Promega公司。構建了含有野生型（WT） ZFAS13，未翻譯區(qū)（UTR）、野生型CCND13，UTR或相應突變序列的重組質(zhì)粒。TT和SW579細胞（1 × 105細胞/孔）接種在24孔板中，并用miR - 302a - 3p mimic （40 nM;5' uaa gug cuu cca ugu uuu ggu ga ';上?；蛑扑幱邢薰荆┗騧iRNA對照（40 nM;5' uuc ucc gaa cgu guc acg utt 3';重組質(zhì)粒（20 ng）或相應的突變體（20 ng）使用Lipofectamine 3000。質(zhì)粒pRL胸腺嘧啶激酶;作為熒光素酶的內(nèi)參。在使用Dual - Glo熒光素酶檢測試劑盒（Promega Corporation）檢測熒光素酶活性之前，細胞培養(yǎng)48小時。熒光素酶活性歸一化為Renilla熒光素酶活性。

6.傷口愈合試驗

在對數(shù)生長期收集TT和SW579細胞（1 × 106）。用無菌的200?l移液管尖端在單層細胞上劃痕，在細胞層中間形成一個間隙。洗滌后，用無血清培養(yǎng)基處理細胞48小時，并在37?C的5% CO2中孵育。使用光學顯微鏡（放大率，x100）捕捉圖像，并通過ImageJ軟件1.8.0（美國國立細胞計數(shù)試劑盒- 8 （CCK - 8）檢測。si - ZFAS1或miR - 302a - 3p抑制劑轉(zhuǎn)染TT和SW579細胞（1 × 106），分成組（對照、si -對照、si - ZFAS1、抑制劑- NC、抑制劑、抑制劑+ si - ZFAS1）培養(yǎng)24、48和72小時。通過CCK - 8檢測細胞活力Cat.no.96992 - 100測試- F;σ-奧爾德里奇;默克公司（Merck KGaA）。采用Multiskan酶標儀（Thermo Fisher Scientific， Inc.）在450 nm處測定吸光度。

7.Western-blotting

細胞轉(zhuǎn)染24小時后，獲得1 × 106個細胞，并用RIPA裂解液裂解與蛋白酶抑制劑測定總蛋白濃度。用12% SDS - PAGE將蛋白（25?g/lane）分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用5%脫脂乳封閉膜1小時，并與抗周期蛋白D1 （1：10000）; MMP2 （1：1000）;E - cadherin （1：10000;N -鈣粘蛋白（1?g/ml）;和GAPDH （1：10，000）（全部購自Abcam）一抗，在4?C過夜。然后用TBS - Tween 20 （0.1% Tween - 20）洗滌膜，并與山葵過氧化物標記的山羊抗兔二抗（1：2000）在室溫下保存1小時。蛋白印跡是使用SignalFire?ECL試劑（cat.no.6883;Cell Signaling Technology， Inc.），并使用ImageJ軟件（version 1.46）進行分析。

8.統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)表示為三個獨立實驗的平均值±SD。配對和未配對的兩組之間的統(tǒng)計學差異通過t檢驗分析，多組之間的差異則是通過單向或雙向方差分析（針對CCK-8數(shù)據(jù)）進行分析，然后進行Tukey事后檢驗。Pearson相關系數(shù)檢驗用于相關性分析，F(xiàn)isher精確檢驗和X2檢驗用于分析不同變量之間的關聯(lián)。 使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，Inc.）分析所有結果。 P <0.05認為統(tǒng)計學上顯著差異。

2結果

甲狀腺癌組織和細胞系中ZFAS1表達水平上調(diào)，并與甲狀腺癌細胞的增殖呈正相關。為了研究ZFAS1在甲狀腺癌中的表達和作用，檢測了ZFAS1在腫瘤組織和細胞系中的表達水平。此外，測定了沉默表達ZFAS1的TT和SW579細胞的細胞活力。結果表明，與鄰近組織相比，甲狀腺癌組織中ZFAS1表達水平上調(diào)，與Nthy-ori3-1細胞相比，MDA-T68，TT，SW579，B-CPAP和TPC-1細胞中ZFAS1表達水平上調(diào)（P <0.01;圖1A和B）。此外，分析了ZFAS1表達與臨床特征之間的關聯(lián)，結果表明ZFAS1表達水平與腫瘤大小，淋巴結狀態(tài)和腫瘤分期顯著相關（表I）。

在si-ZFAS1組中，相比于si-對照組，在TT和SW579細胞中ZFAS1表達水平顯著降低（P <0.01;圖1C和D）。值得注意的是，在24、48和72小時后，si-ZFAS1組的TT和SW579細胞的細胞活力明顯低于si-對照組（P <0.05或P <0.01;圖1E和F）。這些結果表明ZFAS1的表達水平在甲狀腺癌中升高并且與甲狀腺癌的增殖有關。

ZFAS1表達水平的降低會降低甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力。 si-ZFAS1轉(zhuǎn)染了TT和SW579細胞，與si-對照組相比，si-ZFAS1組在24 h后TT和SW579細胞的遷移和侵襲率顯著降低（P <0.01;圖2），表明ZFAS1表達與甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力正相關。

生物信息學預測，miR-302a-3p是ZFAS1的靶基因（圖3A）。與ZFAS1-WT +空白組相比，TT和SW579細胞中ZFAS1-WT +模擬組的相對熒光素酶活性顯著降低（P <0.01;圖3B和C）。 miR-302a-3p是ZFAS1的靶標。此外，結果表明與鄰近組織相比，甲狀腺癌組織中的miR-302a-3p表達水平顯著降低（P <0.01;圖3D），并且ZFAS1與miR-302a-3p的表達水平之間存在負相關關系（圖3E）。另外，抑制劑組中miR-302a-3p的表達水平與抑制劑-NC組相比明顯降低，但在抑制劑+ si-ZFAS1組中，與TT中的抑制劑組相比，其表達水平顯著更高，SW579細胞（P <0.01;圖3F和3G）。另外，與抑制劑+ si-ZFAS1組相比，si-ZFAS1組中的miR-302a-3p表達水平顯著增加（P <0.01;圖3F和3G）。這些結果表明ZFAS1可能靶向miR-302a-3p來調(diào)節(jié)甲狀腺癌細胞的活性。

ZFAS1表達下調(diào)消除了miR-302a-3p抑制對甲狀腺癌細胞的增殖，遷移和侵襲的積極作用。為了研究ZFAS1和miR-302a-3p在甲狀腺癌進展中的作用，研究了使用或不使用si-ZFAS1和miR-302a-3p抑制劑處理的甲狀腺癌細胞的細胞活力，遷移和侵襲的變化。結果表明，與抑制劑-NC組相比，TT和SW579細胞抑制劑組的細胞活力以及遷移和侵襲率顯著提高，而與+ Zi-ZFAS1組相比，它們顯著降低。抑制劑組的那些（P <0.01;圖4）。此外，與抑制劑+ si-ZFAS1組相比，si-ZFAS1組的細胞活力以及遷移和侵襲率顯著降低（P <0.01;圖4）。這些結果表明ZFAS1的下調(diào)可能會減弱miR-302a-3p在甲狀腺癌中表達的降低。

miR-302a-3p靶向CCND1。通過生物信息學分析確定了ZFAS1和miR-302a-3p在甲狀腺癌中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的基因。生物信息學分析預測，miR-302a-3p將CCND1靶向甲狀腺癌的發(fā)生（圖5A）。此外，雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，與CCND1-WT +空白組相比，CCND1-WT +模擬組中TT和SW579細胞系的相對熒光素酶活性明顯較低（P <0.01;圖5B和C）。

ZFAS1表達水平的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了miR-302a-3p抑制劑對甲狀腺癌細胞CCND1表達的促進作用。探討了CCND1表達是否受ZFAS1和miR-302a-3p在TT和SW579細胞中的調(diào)控。結果表明，與抑制劑-NC組相比，抑制劑組的TT和SW579細胞中CCND1表達水平顯著增加（P <0.01;圖6）。另外，抑制劑+ si-ZFAS1組的CCND1表達水平與抑制劑組相比顯著降低，但與si-ZFAS1組的CCND1表達水平顯著升高（P <0.01;圖6）。這些結果表明miR-302a-3p和CCND1的表達水平呈負相關，而ZFAS1和CCND1的表達水平呈正相關。

3討論

本研究表明，在甲狀腺癌組織和細胞系中ZFAS1表達增加，而ZFAS1表達的下調(diào)（可能通過影響CCND1的表達）通過抑制miR-302a-3p的表達降低了腫瘤細胞的增殖，遷移，侵襲和EMT。這些關于調(diào)節(jié)途徑的新發(fā)現(xiàn)可能有助于甲狀腺癌的干預措施。

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項目：齊齊哈爾市科技計劃創(chuàng)新激勵項目 項目編號 CSFGG-2021016