大氣顆粒物暴露兒童血清多環(huán)芳烴加合物與白細胞miR-638的劑量-效應(yīng)關(guān)系

林楊，尹京晶，孟慶玉，王振杰，吳難，張麗雅，王婷，王艷華，段化偉

中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050

最近的世界衛(wèi)生組織研究報告指出，空氣污染每年可導(dǎo)致全球約380 萬人過早死亡［1］。在全球大多數(shù)地區(qū)，大氣顆粒物（particulate Matter，PM）仍然是主要的空氣污染物［2］。兒童的呼吸系統(tǒng)發(fā)育還不夠完善，是大氣顆粒物的敏感人群［3］。流行病學(xué)研究表明，顆粒物及其富集的多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH）組分可致兒童哮喘、肺部感染和過敏風(fēng)險增加［4］。PM 組分復(fù)雜，其中附著在表面的PAH是毒性較為明確且含量高的組分，大部分人群流行病學(xué)研究通過監(jiān)測其在體內(nèi)的代謝物，如羥基PAH代謝物和多環(huán)芳烴加合物，用于評估PM暴露水平［5-7］。苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）是致癌性最強的一種多環(huán)芳烴，經(jīng)機體代謝產(chǎn)生活性產(chǎn)物二羥環(huán)氧苯并芘（benzo[a]pyrene diol epoxide，BPDE），結(jié)合血液中的白蛋白后，形成穩(wěn)定且容易被檢測的BPDE-白蛋白加合物，可作為多環(huán)芳烴長期暴露生物標志物［8］。

表觀遺傳學(xué)在環(huán)境暴露和健康相關(guān)事件之間扮演著重要角色。微小RNA（microRNA，miRNA）屬于表觀遺傳學(xué)中的非編碼RNA分子，約有21～22個核苷酸，是基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，靶向結(jié)合mRNA的3’端非翻譯區(qū)，改變基因表達［9］。miRNA調(diào)控相關(guān)靶基因介導(dǎo)PM暴露引起不良健康損害如炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷和心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生，具有成為PM暴露生物標志物潛力［10］。miR-638位于染色體19p13.2上，參與調(diào)控氧化應(yīng)激、DNA損傷和衰老等損傷相關(guān)靶基因的表達，在心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病中起重要作用［11-13］。有研究表明PAH可異常調(diào)控兒童外周血白細胞miRNA表達，減弱機體炎癥反應(yīng)［5］，目前關(guān)于PM及PAH組分與兒童miR-638表達改變的流行病學(xué)研究較少。本研究通過測定大氣顆粒物暴露兒童血清中BPDE-白蛋白加合物與外周血白細胞miR-638表達水平，探討多環(huán)芳烴與白細胞miR-638的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象及顆粒物暴露情況

1.1.1 研究對象于2016年秋季，在華東地區(qū)某市兩所寄宿制學(xué)校招募符合標準的學(xué)齡兒童，詳細信息可以參考課題組已發(fā)表的文獻［5，14］。兒童納入研究標準：（1）本地常住人口，居住年限≥6 個月；（2）選取住宿制學(xué)生，每周住校至少5 d；（3）無免疫功能缺陷和感染性疾病；（4）調(diào)查期間一個月內(nèi)無抗生素藥物接觸史。低暴露組學(xué)校在高暴露組學(xué)校上風(fēng)向至少30 km 以外區(qū)域，高暴露組學(xué)校附近有耐火材料公司、鋼鐵公司、石油公司等。本次研究最終納入273 名學(xué)齡兒童，其中高暴露組163 人，低暴露組110 人。由于有3 人的白細胞RNA 質(zhì)量和完整性不符合質(zhì)控要求，最終納入分析的高暴露組162 人，低暴露組有108人。本研究通過了中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所倫理委員會審查（倫理編號：NIOHP 201809），體檢開始前告知學(xué)生家長并簽署知情同意書。

1.1.2 環(huán)境暴露評估收集2016年兩學(xué)校附近監(jiān)測站點的全年顆粒物暴露數(shù)據(jù)，包括PM2.5、PM10數(shù)據(jù)。在學(xué)校內(nèi)進行固定點采樣，使用空氣總懸浮微粒采樣器（TH150D Ⅱ，中國武漢）收集顆粒物。稱重法測定PM2.5濃度，氣相色譜-質(zhì)譜儀（450-320，美國Bruker公司）測定BaP濃度。

1.2 問卷調(diào)查

對調(diào)查員進行培訓(xùn)和統(tǒng)一標準后，由學(xué)生家長填報調(diào)查信息，調(diào)查兒童年齡、性別、被動吸煙等情況，身高和體重由專業(yè)人員按照統(tǒng)一標準進行測量。

1.3 生物樣本采集

體檢當天上午采集血液和尿液樣本，采樣前學(xué)生至少空腹8 h，由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的護士采集前臂靜脈乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝血和不抗凝血約5 mL，中段尿30～50 mL，向用于提取RNA 的血液中加入適量的RNAlater（AM7021，美國賽默飛公司），分裝后放于-80℃冰箱儲存。

1.4 實驗室檢測

1.4.1 白細胞計數(shù)使用血細胞分析儀（Sysmex XE 5000，日本Sysmex株式會社）對白細胞進行計數(shù)。

1.4.2 尿可替寧測定煙草是BaP 的來源之一，測定尿可替寧水平是為了評估煙草暴露水平。使用氣相色譜-質(zhì)譜儀（450-320，美國Bruker 公司）檢測尿中可替寧濃度，檢出限為20 ng·mL-1，樣品濃度低于檢出限的用1/2檢出限代替。

1.4.3 血清BPDE-白蛋白加合物檢測使用BPDE-白蛋白試劑盒（美國Trevigen 公司），ELISA 法檢測血清中BPDE-白蛋白加合物濃度。按照說明書操作，使用多功能酶標儀（VICTORTMX3，美國Perkin Elmer 公司）在450 nm波長檢測微孔板并進行讀數(shù)。每塊板中保證均有質(zhì)控樣本、低暴露組和高暴露組樣本，每個樣本設(shè)置2個復(fù)孔。血清BPDE-白蛋白加合物檢出限為5 nmol·L-1，批內(nèi)差異在0.47%～3.55%之間，批間差異為14.61%。

1.4.4 白細胞RNA提取將血液樣本從-80℃取出后置于4℃融化，吸取含有200 μL血液的樣本放入管中，加入750 μL PBS 緩沖液，7 253×g離心3 min 后，棄上清，加入1 mL Trizol（美國賽默飛公司）吹打混勻，再加入2.5×10-4nmol miRNA 檢測外參應(yīng)用液（CR100，北京天根生化科技有限公司）；加入氯仿后離心，經(jīng)異丙醇和75%乙醇處理后，加入無RNA 去離子水溶解RNA。分光光度計（NanoDrop 2000c，美國賽默飛公司）測定RNA濃度，使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。

1.4.5 實時熒光定量PCR 檢測miR-638 表達使用miRcute plus miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR211，北京天根生化科技有限公司）將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用miRcute 增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）（FP411，北京天根生化科技有限公司）定量檢測。外參引物（CD200-01）和miR-638（引物序列：AGGGAUCGCGGGCGGGUGGCGGCCU）購于北京天根生化科技有限公司。使用熒光定量 PCR 儀（Quant Studio 12K，美國賽默飛公司）檢測miR-638 表達，PCR反應(yīng)程序：95℃、15 min；94℃、20 s；60℃、34 s，擴增40個循環(huán)。樣本定量設(shè)置重復(fù)孔，復(fù)孔間Ct值標準差＜0.5；去離子水做空白對照，無非特異性擴增；板間設(shè)置同一質(zhì)量控制樣本，板間質(zhì)控CV＜15%；否則重做。采用2-ΔΔCt法計算miRNA 的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用R 4.0.3 統(tǒng)計軟件。正態(tài)性數(shù)據(jù)采用±s表示，年齡、血清BPDE-白蛋白加合物兩組間比較采用t檢驗。非正態(tài)性資料采用M（P25，P75）表示，兩組間PM2.5、PM10、白細胞計數(shù)、miR-638表達比較采用Wilcox 秩和檢驗。根據(jù)世界衛(wèi)生組織頒布的兒童生長標準將體重指數(shù)（body mass index，BMI）z-評分＞1 劃為超重，反之為正常體重［15］。按照尿可替寧是否高出檢出限（＞20 ng·mL-1）分為尿可替寧檢出組和非檢出組，反映煙草暴露情況。計數(shù)資料如性別、BMIz-評分、尿可替寧檢出率的比較采用χ2檢驗。白細胞miR-638、血清BPDE-白蛋白加合物、白細胞計數(shù)經(jīng)自然對數(shù)（ln）轉(zhuǎn)換后納入線性回歸模型分析。以組別為自變量，miR-638 表達水平為應(yīng)變量，調(diào)整年齡、性別、BMIz-評分，血清BPDE-白蛋白加合物、尿可替寧和白細胞計數(shù)協(xié)變量后，分析兩組兒童白細胞miR-638 表達差異；以血清BPDE-白蛋白加合物為自變量，白細胞miR-638 為應(yīng)變量，采用線性回歸分析血清BPDE-白蛋白加合物與miR-638 表達劑量-效應(yīng)關(guān)系。在體重、尿可替寧水平和性別分層分析中，線性回歸分析選擇不同的協(xié)變量進行校正。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童顆粒物暴露水平和基本特征

高暴露組區(qū)域PM2.5、PM10年平均暴露水平（環(huán)境監(jiān)測站）均高于低暴露組，分別是低暴露組的1.7和2.1倍（P＜0.001）。大氣顆粒物高暴露組區(qū)域（學(xué)校定點采樣）PM2.5（98.79 μg·m-3）均比低暴露組（54.20 μg·m-3）高（P=0.025），且PM2.5與BaP濃度（r=0.691，P＜0.001）呈正相關(guān)。未發(fā)現(xiàn)兩組兒童間年齡、性別、尿可替寧檢出比例、白細胞計數(shù)有差異（P＞0.05）；高暴露組兒童血清BPDE-白蛋白加合物水平［（82.41±20.12）nmol·L-1］高于低暴露組［（64.84±14.26）nmol·L-1］（P＜0.001）；高暴露組兒童BMIz-評分超重比例（34.57%）高于低暴露組（23.15%）（P=0.045）。見表1。

表1 顆粒物暴露組兒童人群基本情況Table 1 General characteristics of children exposed to particulate matter

2.2 顆粒物暴露與兒童白細胞miR-638表達改變

線性回歸模型分析結(jié)果顯示，校正年齡、性別、BMIz-評分、尿可替寧和白細胞計數(shù)水平后，大氣顆粒物高暴露組兒童白細胞miR-638 表達升高，是低暴露組的1.4 倍（P＜0.001）。亞組分析發(fā)現(xiàn)，校正協(xié)變量后，在男生中，高暴露組白細胞miR-638 表達水平高于低暴露組（P=0.002）；在正常體重兒童中，高暴露組miR-638 表達水平高于低暴露組（P=0.011）；在尿可替寧未檢出兒童中，高暴露組miR-638 表達水平高于低暴露組（P=0.006）。見表2。

表2 兩組兒童外周血白細胞miR-638 水平比較Table 2 Comparison of miR-638 expression in peripheral blood leukocytes between low- and high-PM exposed groups

2.3 血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638 相關(guān)性分析

如圖1所示，全人群、高暴露組兒童中血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638 表達水平呈正相關(guān)（r值分別為0.25、0.22，P＜0.05）。

圖1 全人群（A）、高暴露組（B）和低暴露組（C）血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638 相關(guān)分析Figure 1 Correlation between serum BPDE-albumin adducts and leukocyte miR-638 expression among total population (A),high-PM exposure group (B),and low-PM exposure group (C)

2.4 血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638 劑量-效應(yīng)關(guān)系分析

線性回歸模型分析結(jié)果顯示，校正年齡、性別、尿可替寧、BMIz-評分和白細胞數(shù)目等變量后，兒童血清BPDE-白蛋白加合物每增加一個IQR（27.09 nmol·L-1），外周血白細胞miR-638表達增加24.56%（P＜0.001）；高暴露組兒童血清BPDE-白蛋白加合物每增加一個IQR（25.95 nmol·L-1），其白細胞miR-638 表達增加19.28%（P=0.003）。亞組分析中，男生和女生血清BPDE-白蛋白加合物每增加一個IQR（27.34 nmol·L-1和28.84 nmol·L-1），白細胞miR-638表達增加20.60%和34.57%（P＜0.05）；正常體重兒童組，血清BPDE-白蛋白加合物每增加一個IQR（24.74 nmol·L-1），miR-638 表達增加26.89%（P＜0.001）；在尿可替寧未檢出組中，兒童血清BPDE-白蛋白加合物每增加一個IQR（25.06 nmol·L-1），miR-638表達增加23.78%（P＜0.001）。詳見表3。

表3 不同人群中BPDE-白蛋白加合物與miR-638 劑量-效應(yīng)關(guān)系分析Table 3 Dose-effect relationship between BPDE-albumin adducts and miR-638 in different groups of children

3 討論

大氣顆粒物可以引發(fā)兒童體內(nèi)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)改變，進而導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾?。?6-17］。大氣顆粒物中較為關(guān)注的有機類有害組分是PAH，其中BaP 經(jīng)機體代謝產(chǎn)生BPDE-白蛋白加合物，在血液中半衰期較長，可反映多環(huán)芳烴的長期暴露［18-19］。結(jié)合暴露評估和表觀遺傳學(xué)生物標志物分析，本研究發(fā)現(xiàn)高水平顆粒物暴露組兒童中，血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638正相關(guān)，并表現(xiàn)出較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這提示在兒童等敏感人群中，顆粒物中PAH 組分可以通過調(diào)控miRNA 等分子改變，誘導(dǎo)機體的有害效應(yīng)。

暴露于環(huán)境污染物時，外周血白細胞miR-638 表達失調(diào)，可調(diào)控相關(guān)靶基因參與DNA 損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)［11，20-23］。本研究結(jié)果顯示，大氣顆粒物高暴露組兒童外周血白細胞miR-638高于低暴露組，并與PAH組分具有暴露-反應(yīng)關(guān)系。Li等［22］研究發(fā)現(xiàn)miR-638在16HBE細胞中表達與BaP呈劑量-效應(yīng)依賴式增加，人群研究驗證發(fā)現(xiàn)與對照組相比，暴露于PAH 的焦爐工人外周血白細胞miR-638 表達增加了72%，這與本研究結(jié)果相一致。體外研究發(fā)現(xiàn)，亞砷酸鹽染毒后，人Jurkat 細胞miR-638 表達水平也升高［23］。Christenson等［13］發(fā)現(xiàn)miR-638 隨著肺氣腫的嚴重程度增加而表達上調(diào)，提示 miR-638 靶向調(diào)控細胞外基質(zhì)修復(fù)相關(guān)基因，導(dǎo)致修復(fù)能力下降，引起氧化損傷并進一步加重肺氣腫的進程。

暴露于PM2.5中的PAH 組分時，無論是成人還是兒童，男性的吸入率和暴露時間均高于女性［24］。本研究發(fā)現(xiàn)男生和女生體內(nèi)的血清BPDE-白蛋白加合物水平與miR-638 水平存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，但是兩組間比較時發(fā)現(xiàn)高暴露組男生白細胞miR-638 水平高于低顆粒物暴露組，這可能是男生較女生暴露較多的顆粒物及有害組分。

環(huán)境煙草暴露是大氣顆粒物研究中的主要混雜因素，也會影響兒童的健康［25］。本研究采用尿可替寧水平評估兒童煙草暴露情況，研究發(fā)現(xiàn)在尿可替寧未檢出組，高顆粒物暴露組兒童白細胞miR-638 水平升高。而尿可替寧檢出組卻沒有發(fā)現(xiàn)該差異。提示不存在煙草暴露時，兒童外周血白細胞miR-638 表達水平升高，可能是顆粒物PAH組分致兒童血清BPDE-白蛋白加合物升高所致；煙草中其他成分暴露可能干擾了白細胞miR-638表達，顆粒物是否與香煙產(chǎn)生協(xié)同作用影響miR-638表達的機制尚不清楚，值得進一步研究。本研究中，正常體重兒童中高暴露組miR-638表達水平高于低暴露組，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，而超重兒童兩組間沒有差異。Iacomino 等［26］也發(fā)現(xiàn)兒童超重/肥胖是血液中miRNA 改變的危險因素，可引起外周血中大部分miRNA表達降低。

本研究的主要優(yōu)勢為：（1）研究人群為寄宿制學(xué)校的兒童，選擇學(xué)校附近監(jiān)測站數(shù)據(jù)能夠反映兒童長期暴露水平，兩個學(xué)校食堂不提供燒烤類食品，孩子的家庭中均使用清潔燃料，減少了大部分飲食和室內(nèi)污染多環(huán)芳烴來源的影響；（2）檢測了尿可替寧水平評估煙草暴露，作為協(xié)變量納入統(tǒng)計模型，排除了煙草混雜因素的影響，從而增加血清BPDE-白蛋白加合物評估顆粒物暴露水平的可靠性；（3）據(jù)了解這是第一個研究兒童顆粒物暴露與白細胞miR-638表達水平關(guān)系，分析血清BPDE-白蛋白加合物與白細胞miR-638的劑量-效應(yīng)關(guān)系。本研究也存在一定的局限性：（1）作為一項橫斷面調(diào)查研究，不足以進行因果關(guān)系的推斷，還需要進一步深入研究；（2）由于學(xué)齡兒童上課、體育運動等特殊性，較難開展個體暴露監(jiān)測，只能通過定點采樣結(jié)果評估兩組兒童PM暴露水平。

綜上所述，大氣顆粒物暴露可致兒童外周血白細胞miR-638水平升高，顆粒物中的多環(huán)芳烴組分可能是引起白細胞miR-638表達改變的主要有害因素。兒童血清中的多環(huán)芳烴-白蛋白加合物與miR-638存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。研究提示，在兒童等敏感人群的環(huán)境健康保護工作中，不僅要監(jiān)測和控制顆粒物水平，更要關(guān)注其中多環(huán)芳烴等有害組分的控制和標志物研究。