二氧化硅染塵小鼠肺纖維化相關炎癥和氧化應激因子的響應及關鍵基因表達

呂達，楊慧楠，劉春城，b，王樂，趙宏宇，b，蔡祿，b

內(nèi)蒙古科技大學 a.生命科學與技術學院 b.內(nèi)蒙古自治區(qū)功能基因組生物信息學重點實驗室，內(nèi)蒙古 包頭 014010

塵肺病是因為患者長期接觸生產(chǎn)性粉塵，呼吸系統(tǒng)的清除和防御機制受到損害，進而引起肺組織纖維化［1］。目前塵肺病發(fā)病機制尚未解釋清楚，所以一旦確診，臨床上沒有根治的方法［2］。

有研究表明，塵肺病發(fā)病與炎癥反應等免疫響應具有密切的關系［3］。二氧化硅（SiO2）進入肺部首先作用于上皮細胞和內(nèi)皮細胞等，促使這些細胞釋放炎癥介質(zhì)，引起血小板聚集，促進血管擴張和增加血管滲透性，使炎癥細胞聚集到損傷部位［4］。在塵肺病發(fā)病初期和發(fā)病末期均有巨噬細胞誘發(fā)炎癥反應。巨噬細胞能夠合成并且釋放腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6 等炎癥因子。隨著炎癥的發(fā)展，肺泡上皮細胞和巨噬細胞釋放促纖維化和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）。TGF-β具有多種功能，通過刺激成纖維細胞以及肌成纖維細胞分泌膠原等細胞外基質(zhì)以及調(diào)控蛋白多糖的表達參與塵肺病的發(fā)病過程［5］。

氧化應激反應在纖維化發(fā)生發(fā)展階段扮演了非常重要的角色［6］。人類肺組織相較于其他器官暴露于更高濃度的氧環(huán)境中，更容易受到氧化應激的損傷。當體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多或抗氧化能力不足時，過量的ROS 存在于組織或細胞內(nèi)，可以誘發(fā)氧化應激，將導致肺組織的損傷。Matsuzawa 等［7］通過檢測血清氧化應激標志物，得出了纖維化進展過程中存在氧化/抗氧化失衡的結論。氧化應激可以通過刺激相關基因表達來調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和死亡，進而促進肺纖維化。

肺組織中膠原纖維的生成與聚集是塵肺病的標志［8］。細胞外基質(zhì)的沉積和纖維灶的形成是肺纖維化的標志性特征。I型膠原和α-平滑肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肺內(nèi)細胞外基質(zhì)中的重要成分和特征性標志物。纖維灶主要是由活化的肌成纖維細胞組成，肌成纖維細胞能夠合成膠原、α-SMA 等細胞外基質(zhì)的主要成分。有研究人員通過對間質(zhì)性肺炎活檢分析發(fā)現(xiàn)，上皮細胞死亡后，肺泡表面基底膜脫落，在成纖維細胞和肌成纖維細胞等間充質(zhì)細胞中會大量合成新的細胞外基質(zhì)，從而加速肺部纖維化［9］。

目前，同時從炎癥反應、氧化應激反應以及膠原沉積三個方面綜合研究粉塵顆粒導致肺纖維化的工作較少，而這對于理解塵肺病的致病機理具有重要的意義。鑒于此，本研究擬對染塵后的小鼠進行為期56 d 的實驗，在此期間對不同染塵時間的小鼠樣本進行病理學研究，同時測定炎癥因子、氧化應激因子以及膠原形成相關的基因mRNA 的表達量，為塵肺病的發(fā)病機制研究提供一定的依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 小鼠購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010；動物飼養(yǎng)溫度控制在25℃左右，空氣濕度50%～60%，光照時間晝夜交替各12 h；適應飼養(yǎng)7 d 后進行實驗，動物實驗經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學實驗動物管理委員會審查批準，審批號為NMGKJDX-2017-03。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器Nanodrop 2000 紫外分光光度計（Thermo Fisher 科技公司，美國），Eclipse Ti-U 熒光倒置顯微鏡（尼康株式會社，日本），Synergy HT 多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司，美國），實時熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）。

1.2.2 主要試劑TNF-α、TGF-β、成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、ROS、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的酶免試劑盒（江蘇南京晶美生物科技有限公司，中國）；蘇木素-伊紅染色（haematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、Masson 染色試劑盒、羥脯氨酸（北京索萊寶有限公司，中國）；直徑1～5 μm 的SiO2粉末（Sigma公司，美國）；總RNA 提取試劑（RNAiso Plus）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScpriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）、實時熒光定量PCR試劑盒（TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ，TaKaRa 公司，日本）；Col1a2基因和α-SMA基因擴增引物（蘇州金維智公司，中國），其他試劑（分析純，國藥集團，中國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 構建小鼠模型根據(jù)前期實驗結果設定染塵劑量。將35只SPF級C57BL/6小鼠（雄性、體重約20～25 g、8～10 周）隨機分成空白對照組（5 只）、生理鹽水對照組（10只）、20 g·L-1SiO2染塵組（10 只）、60 g·L-1SiO2染塵組（10 只）共4 組。采用非氣管暴露法構建小鼠模型，每只小鼠灌注SiO2的量為50 mg·kg-1和150 mg·kg-1（以小鼠體重計），用無菌的生理鹽水配制20 g·L-1和60 g·L-1的SiO2懸濁液，按照小鼠體重灌注不同體積的SiO2懸濁液［8-9］。分別于第0天和第14天進行二次灌注。

1.3.2 樣本采集空白對照組全部在第28天處死，其余各組小鼠分別于第28 天和第56 天處死。用剪刀鑷子剪開胸腔，分離出肺組織，然后用生理鹽水將肺組織沖洗干凈，濾紙拭干。將左肺葉剪下浸泡在4%（體積分數(shù)，后同）的多聚甲醛溶液。

1.3.3 HE 與Masson 染色將小鼠肺組織浸泡在4%的多聚甲醛固定液中24 h 后進行脫水、石蠟包埋、切片操作，然后按照索萊寶HE 染色和Masson 染色步驟進行染色操作，將染好色的切片放到光學顯微鏡下觀察，拍照記錄并比較不同樣本間的差異。

1.3.4 肺組織TGF-β、TNF-α、FGF測定采用ELISA法測定，TGF-β 和FGF 的檢出限為0.337 5 ng·g-1，TNF-α 的檢出限為0.27 ng·g-1。首先將肺組織切成小塊，加入適量pH為7.4的磷酸鹽緩沖液。用勻漿器將樣本研磨充分，3 000 r·min-1（離心半徑10 cm）離心20 min，收集上清液待測。檢測過程按照試劑盒標準步驟進行，結果以每克濕肺組織中含上述因子的質(zhì)量分數(shù)（后稱含量）表示。

1.3.5 血清中SOD、ROS、MDA測定采用ELISA測定血清中SOD、ROS、MDA，SOD 檢出限為0.105 μg·L-1，ROS檢出限為0.3 U·L-1，MDA 的檢出限為0.03 μmol·L-1。小鼠眼球取血，室溫血液自然凝固20 min，2 500 r·min-1（離心半徑10 cm）離心20 min，收集到的上清液即為血清。檢測過程按照試劑盒標準步驟進行。

1.3.6 羥脯氨酸含量檢測稱取約20 mg 肺組織于消解管中，按照200 μL∶20 mg（鹽酸：肺組織）的比例加入6 mol·L-1鹽酸，煮沸3 h后16 000 r·min-1（離心半徑10 cm）離心20 min，然后用10 mol·L-1的氫氧化鈉溶液中和至pH值為7，加蒸餾水定容至400 μL，用分光光度計在560 nm波長下測得光密度（D）值代入標準曲線中計算每克濕肺組織含羥脯氨酸的質(zhì)量分數(shù)（后稱含量）。

1.3.7 Col1a2 基因和α-SMA 基因表達檢測將小鼠肺組織用液氮研磨充分加入1 mL TaKaRa 公司的RNAiso Plus，然后按照總RNA 提取試劑的說明書步驟進行RNA 提取，分光光度計檢測所得到的總RNA 濃度和純度，再按反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA鏈，以cDNA 鏈作為模板鏈，GAPDH基因為內(nèi)參基因進行擴增。擴增反應程序設定為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，57℃ 34 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。以基因GAPDH為內(nèi)參，以生理鹽水對照組為基準，通過處理組目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值（?Ct處理）減去對照組目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值（?Ct對照），得出??Ct，然后以2-??Ct值計算目的基因mRNA表達相對量。引物序列見表1。

表1 RT-PCR 分析的引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 進行分析，使用±s描述，組間差異采用單因素方差分析和LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 小鼠肺組織形態(tài)學變化

光鏡下觀察HE 染色的切片結果（圖1）：生理鹽水對照組組織結構完整，肺泡間隔均勻，無間質(zhì)纖維組織增生。20 g·L-1和60 g·L-1兩組小鼠染塵第28 天時，肺部結構被破壞，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)有大量的細胞浸潤；當染塵到第56 天時，小鼠肺部炎性細胞有所減少，血管壁增厚，形成明顯的纖維結節(jié)。

圖1 小鼠肺組織HE染色結果Figure 1 HE staining results of lung tissues of mice

2.2 肺組織中炎癥因子水平的變化

炎癥因子檢測結果顯示（圖2）：空白對照組小鼠肺組織中，TGF-β、FGF 和TNF-α 含量分別是1.09、3.63、3.13 ng·g-1，與空白對照組相比，生理鹽水組小鼠在第28 天和第56 天時肺組織中3 種炎癥因子的含量均無明顯變化（P＞0.05）；20 g·L-1和60 g·L-1染塵組小鼠在染塵至第56 天時，TGF-β、FGF、TNF-α 含量分別是3.42、3.62 ng·g-1，15.20、19.78 ng·g-1和9.02、11.30 ng·g-1，較生理鹽水組均有增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖2 小鼠肺組織炎癥因子檢測結果Figure 2 Inflammatory factor levels in lung tissues of mice

2.3 血清中氧化應激水平指標的變化

氧化應激因子檢測結果顯示（圖3）：空白對照組小鼠血清中，MDA、ROS 和SOD 的水平分別是0.19 μmol·L-1、7 U·L-1和0.58 μg·L-1；與空白對照組相比，在第28、56天時生理鹽水組小鼠血清中上述3種因子水平均無明顯變化（P＞0.05）；20 g·L-1染塵組小鼠在染塵第28、56天時，MDA濃度為0.23、0.26 μmol·L-1，ROS水平均為11、11 U·L-1，SOD質(zhì)量濃度為0.43、0.44 μg·L-1；60 g·L-1染塵組小鼠在染塵第28、56 天時，MDA 濃度為0.28、0.34 μmol·L-1，ROS 水平為13、14 U·L-1，SOD 質(zhì)量濃度為0.38、0.36 μg·L-1；在染塵第28、56 天時，兩個染塵組小鼠血清中MDA、ROS 水平增加，SOD 水平下降，與生理鹽水組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 小鼠血清中氧化應激因子檢測結果Figure 3 Oxidative stress factor levels in serum of mice

2.4 肺組織中膠原含量的變化

如圖4所示：在第28、56 天時，生理鹽水組小鼠肺組織羥脯氨酸含量均為0.15 mg·g-1，與空白對照組（0.12 mg·g-1）相比無差異（P＞0.05）；在染塵第28、56 天時，20 g·L-1染塵組小鼠，羥脯氨酸含量為0.25、0.28 mg·g-1；60 g·L-1染塵組為0.32、0.43 mg·g-1，較生理鹽水對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。如圖5所示：Masson 染色可將膠原纖維染成藍色，肌纖維染成紅色，隨著纖維化進程加重，膠原纖維累積；生理鹽水組有少量藍色，SiO2染塵組明顯比生理鹽水組藍色范圍更加廣闊。通過檢測基因表達量可知（圖6）：相較于生理鹽水組，60 g·L-1染塵組小鼠在第28 天時，Col1a2和α-SMA基因表達量分別上升至1.62倍和2.05倍；在第56天時，上升至3.08倍和3.34倍。

圖4 小鼠肺組織中羥脯氨酸含量檢測結果Figure 4 Hydroxyproline levels in lung tissues of mice

圖5 小鼠肺組織Masson染色結果Figure 5 Masson staining results of lung tissues of mice

圖6 肺組織中Col1a2（A）和α-SMA（B）基因mRNA表達水平Figure 6 mRNA expression levels of Col1a2 (A) and α-SMA (B)in lung tissues of mice

3 討論

本研究的結果表明，在小鼠染塵后肺組織出現(xiàn)了纖維化的特征。染塵組小鼠肺組織中出現(xiàn)了血管壁增厚現(xiàn)象，肺部形成了纖維結節(jié)；隨著染塵時間的延長，炎癥因子和氧化應激因子的含量出現(xiàn)不同程度的增加；羥脯氨酸含量的增加表明肺組織中積累過量SiO2后可導致肺部膠原纖維增多；α-SMA和Col1a2基因表達水平明顯升高，Masson 染色顯示染塵組的小鼠肺組織中染藍區(qū)域增多，同樣說明肺組織中出現(xiàn)了膠原纖維增多的現(xiàn)象。以上結果可以看出，小鼠肺內(nèi)SiO2染塵可導致肺組織出現(xiàn)纖維化的癥狀。

本實驗研究結果顯示，小鼠染塵進行到第56 天時，TGF-β、TNF-α、FGF 含量均隨著SiO2濃度增加而增加，說明SiO2在小鼠肺部沉積能夠引發(fā)明顯的炎癥反應；而染塵至第28 天時，僅有高濃度染塵組小鼠TGF-β 略有升高。有研究顯示塵肺病患者在病理學上的最初表現(xiàn)為肺泡炎癥，此時大量炎性細胞向肺內(nèi)浸潤活化，釋放多種具有生物活性的細胞因子［10］；也有研究將塵肺病的發(fā)展過程分為正常期、炎癥期、進展期和纖維化期四個時期［11］。在本實驗小鼠染塵至第28 天時可能正處于纖維化的誘發(fā)階段，故而出現(xiàn)上述結果。從實驗結果可判斷染塵至第56 天時小鼠肺組織局部已經(jīng)形成了纖維化，3 種細胞因子的含量均增加，說明這3 種因子在纖維化的形成過程中可能都發(fā)揮了重要的功能。有研究人員同樣發(fā)現(xiàn)在SiO2染塵大鼠肺纖維化進程中TGF-β、TNF-α、FGF 等細胞因子水平明顯增加［3］。這些結果均表明，炎癥反應在塵肺病發(fā)生發(fā)展過程具有非常重要的作用，免疫響應分泌的炎癥因子對后續(xù)肺纖維化可能起到了重要的促進效應。

除了炎癥反應之外，氧化應激反應也參與了肺纖維化的過程［12］。本實驗研究結果表明，當SiO2在肺部累積刺激肺組織產(chǎn)生氧化應激因子，ROS隨著纖維化進程最高提升至近2倍；小鼠染塵后MDA提高到1.78倍，SOD 含量最多降低了38%。正常的肺穩(wěn)態(tài)需要細胞內(nèi)外氧化物和抗氧化物的平衡，自由基在塵肺病患者肺部積累引起自由基對機體長期、反復的損害，促進肺纖維化的形成［13］。有研究表明，小鼠血清中MDA 含量的升高加重了氧自由基對機體的損害；而SOD 水平隨著染塵時間延長而降低，意味著小鼠肺組織纖維化程度加深，體內(nèi)清除氧自由基能力減弱［14］。也是學者發(fā)現(xiàn)隨著慢性阻塞性肺疾病患者病情的加重，機體中出現(xiàn)了氧化應激反應［15］。這些結果表明機體氧化應激失衡與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系。

本實驗同時從Masson 染色、羥脯氨酸含量變化和α-SMA和Col1a2基因表達水平的角度表明了SiO2的刺激會促使肺組織中膠原累積導致肺纖維化。肺纖維化組織中膠原蛋白、彈性蛋白和纖維連接蛋白等成分的聚集會促使膠原纖維的形成［16］。也有研究表明，通過非氣管暴露法灌注博來霉素可導致大鼠α-SMA的表達水平和膠原含量明顯升高［14］。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著染塵時間的延長，炎癥反應更劇烈，氧化應激反應持續(xù)增強，膠原累積量逐漸增多，這些因素異常升高對肺纖維化的進程起到了促進作用。從這三個角度出發(fā)研究SiO2致肺纖維化的生物學效應，可為塵肺病致病機理的理解和后期治療提供一定的參考價值。