厄貝沙坦對(duì)高血壓合并2型糖尿病大鼠胰島素抵抗IRS-1/PI3K/GLUT4信號(hào)通路的影響

劉莉， 羅鵬， 周田田， 李燕， 謝紅艷， 呂德

1.攀鋼集團(tuán)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 攀枝花 617000； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院基地辦公室，成都 610075 3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，成都 610075

高血壓、2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）作為慢性代謝性疾病是影響人類壽命的兩大重要風(fēng)險(xiǎn)因素。高血壓是T2DM的常見并發(fā)癥，在T2DM患者中伴有高血壓患者高達(dá)40%左右，由于其高發(fā)病率和高死亡率已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的健康問題[1]。研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗（insulin resistance，IR）與多種代謝性疾病有關(guān)[2]，IR可能是高血壓與T2DM的共同致病因素，因此有效調(diào)控IR，是防治高血壓與T2DM的重要手段之一。已有研究表明[3]，IR與胰島素受體底物家族失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)異常有著密切的關(guān)系。其中胰島素受體基因-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）是胰島素受體底物家族中的一員，在骨骼肌中高表達(dá)。而骨骼肌中IRS-1異常磷酸化或表達(dá)減少會(huì)造成胰島素代謝調(diào)節(jié)的主要信號(hào)通路IRS-1/磷脂酰肌醇（-3）激酶（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory，PI3K）/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transport protein GLUT4，GLUT4）通路受損，最終導(dǎo)致IR[4]。厄貝沙坦是一種常用降壓藥物，研究表明厄貝沙坦能夠減輕胰島素抵抗作用，而其機(jī)制尚不明確[5]。本研究通過觀察厄貝沙坦對(duì)高血壓合并T2DM大鼠的影響，探討該藥是否通過調(diào)節(jié)IRS-1/PI3K/GLUT4信號(hào)通路對(duì)胰島素抵抗大鼠發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）30只和與SHR遺傳背景相同的Wistar-Kyoto（WKY）大鼠10只購自上海萊克公司，體重為（200±2）g，飼養(yǎng)于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（25±2）℃，濕度（50±10）%，12 h循環(huán)光照。正常飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，第2周開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司），厄貝沙坦片（批號(hào)：J20110026，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），馬來酸羅格列酮片（文迪雅）（批號(hào)：H20020475，葛蘭素史克公司），羅氏活力型血糖試紙（德國Roche Diagnostics GmbH公司），胰島素試劑盒、游離脂肪酸試劑盒（美國Cayman公司），包埋劑（optimal cutting temperature compound，OCT）購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，全蛋白抽提試劑盒（德國QIAGEN公司），Western blot試劑盒（美國BD公司），IRS-1、PI3Kp85、AKT、p-AKT及GLUT4抗體（美國Abcam公司）。RBP-IB型血壓計(jì)（北京中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所）；血糖儀（美國Jhonson醫(yī)療器械有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡（日本三菱公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立及取樣 根據(jù)Wong等人[6]的方法對(duì)SHR大鼠建立T2DM模型，SHR大鼠高糖髙脂飼料喂養(yǎng)，2周后，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)價(jià)胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR＝空腹血清胰島素濃度（μU/ml）×空腹血漿葡萄糖濃度（mmol/L）/22.5。成功誘導(dǎo)出胰島素抵抗（HOMA.IR≥3.8），隨后禁食12 h，予以腹腔一次性注射STZ，注射劑量為35 mg/kg，1周后空腹12 h，取鼠尾血，檢測血糖水平，血糖≥16.7 mmol/L表明T2DM造模成功。取10只WKY大鼠作為對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)并注射生理鹽水。造模成功后將30只SHR合并T2DM大鼠隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦低、高劑量組，每組10只；厄貝沙坦低、高劑量組每日分別按30、60 mg/kg劑量灌服[7]，對(duì)照組和模型組灌服等量生理鹽水，連續(xù)5周，觀察攝食量及飲水量的變化，并于每周末稱量大鼠體重。造模后第5周，禁食8 h，尾部取血備用，處死后取骨骼肌組織，一部分固定于4%甲醛，一部分于-80℃保存。

1.2.2 大鼠SBP、FBG、FINS檢測及HOMA-IR計(jì)算分別于造模后、處死前采取套尾法測量大鼠收縮壓（systolic blood pressure，SBP），取大鼠尾部血，使用快速血糖儀，采血前將血糖試紙插入儀器內(nèi)，在尾靜脈處滴血測空腹血糖值；取各組大鼠眼眶血，3000 rpm離心15 min，取血清為待測樣本。ELISA試劑盒測定血清中FINS含量，具體操作依照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)中止后，采用酶標(biāo)儀測量450 nm處的OD值，計(jì)算大鼠胰島素濃度。根據(jù)公式HOMA-IR＝（FBG×FINS）/22.5計(jì)算HOMA-IR[8]。

1.2.3 HE染色檢測大鼠骨骼肌組織冰凍切片 各組大鼠骨骼肌組織在4%多聚甲醛溶液中4℃固定2 h，包埋劑（optimal cutting temperaturecompound，OCT）包埋，切成4μm的切片。然后依次脫蠟、水化，進(jìn)行HE染色、脫水、二甲苯充分浸泡2 h直至透明后干燥。用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)并拍攝。

1.2.4 免疫熒光檢測大鼠骨骼肌組織GLUT4的表達(dá)取各組大鼠骨骼肌冰凍切片用5%BSA的封閉液室溫封閉1 h，將GLUT4一抗以1：100比例稀釋并滴加在切片上，室溫孵育2 h，PBS沖洗干凈，加稀釋好的熒光標(biāo)記的二抗于37℃避光作用1 h，用稀釋好的DAPI染細(xì)胞核，封片并置于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 Western blot檢測大鼠骨骼肌組織IRS-1、PI3Kp85、AKT及p-AKT蛋白表達(dá) 分別收集各組樣本，用總蛋白提取試劑盒分別提取組織及細(xì)胞中總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。制備蛋白樣品并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加含有5%BSA的封閉液室溫下封閉2 h。加入IRS-1（1：1000）、PI3Kp85（1：1000）、AKT（1：1000）及磷酸化AKT（p-AKT）（1：1000）一抗于4℃封閉過夜。次日用緩沖液清洗PVDF膜3次，加入標(biāo)記HRP的二抗，室溫孵育1 h后，加入顯色液曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0軟件，作圖工具采用Graphpad 5.01，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 厄貝沙坦對(duì)大鼠飲食、飲水及體重的影響

經(jīng)高糖高脂飲食聯(lián)合STZ造模后，大鼠先后出現(xiàn)飲食、飲水增加現(xiàn)象；在給與厄貝沙坦治療后，隨時(shí)間增加，不同劑量組大鼠均比模型組飲食、飲水量減少。分別于造模后的5個(gè)周末稱量大鼠體重，結(jié)果如圖1所示，對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)體重持續(xù)增加；與對(duì)照組相比，模型組大鼠體重在造模后1至5周持續(xù)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，厄貝沙坦各組大鼠體重逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），厄貝沙坦高劑量組大鼠體重增加更加明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 厄貝沙坦對(duì)大鼠體重的影響（n＝10）*P<0.05，與對(duì)照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.1 Effect of Irbesartan on body weight in rats（n=10）*P<0.05 vscontrol group,#P<0.05 vsmodel group

2.2 厄貝沙坦對(duì)大鼠SBP、FBG、FINS及HOMA-IR的影響

造模后，與對(duì)照組相比，其余各組大鼠SBP、FBG、FINS及HOMA-IR顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；處死前，與對(duì)照組相比，模型組SBP、FBG、FINS及HOMA-IR明顯升高（P<0.01），與模型組相比，厄貝沙坦低、高劑量組大鼠以上指標(biāo)均減少（P<0.05，P<0.01）。另外，與造模后相比，厄貝沙坦低、高劑量組在處死前SBP、FBG、FINS及HOMA-IR均下降（P<0.05），而對(duì)照組和模型組差異不顯著（P>0.05），見圖2。

圖2 厄貝沙坦對(duì)大鼠FBG、SBP、FINS及HOMA-IR的影響（n＝10）**P<0.01，與對(duì)照組比較#P<0.05，##P<0.01，與模型組比較ΔP<0.05，與造模后第1周比較Fig.2 Influence of Irbesartan on rat FBG,SBP，F(xiàn)INSand HOMA-IR（n=10）**P<0.01 vscontrol group,#P<0.05,##P<0.01 vsmodel group,ΔP<0.05 vsafter modeling at 1 week

2.3 厄貝沙坦對(duì)大鼠骨骼肌組織的影響

結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組大鼠骨骼肌肌纖維排列正常，細(xì)胞核排列有序，未見炎性浸潤；而模型組大鼠骨骼肌肌纖維排列紊亂，間隙增加，有波浪樣改變，細(xì)胞核異位；與模型組相比，厄貝沙坦低、高劑量組肌纖維排列有不同程度的恢復(fù)。

圖3 厄貝沙坦對(duì)大鼠骨骼肌組織的影響 A：對(duì)照組B：模型組C：厄貝沙坦低劑量組D：厄貝沙坦高劑量組Fig.3 Effect of Irbesartan on skeletal muscle tissue of rats A:Control group;B:Model group;C:Irbesartan low-dose group;D:Irbesartan high-dosegroup

2.4 厄貝沙坦對(duì)大鼠骨骼肌組織中GLUT4表達(dá)的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證厄貝沙坦是否調(diào)節(jié)IRS-1/PI3K通路下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的關(guān)鍵蛋白GLUT4的表達(dá)，采用免疫熒光檢測各組大鼠骨骼肌組織中GLUT4的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示，GLUT4主要定位于細(xì)胞膜，與對(duì)照組相比，模型組中GLUT4的表達(dá)明顯減少；與模型組相比，厄貝沙坦低、高劑量組大鼠骨骼肌組織中GLUT4表達(dá)均增加（P<0.05）。

圖4 厄貝沙坦對(duì)大鼠骨骼肌組織GLUT4表達(dá)的影響（n=10）A：對(duì)照組B：模型組C：厄貝沙坦低劑量組D：厄貝沙坦高劑量組；E:各組GLUT4相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖*P<0.05，與對(duì)照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.4 Effect of Irbesartan on GLUT4 expression in skeletal muscletissueof rats（n=10）A:Control group;B:Model group;C:Irbesartan low-dosegroup;D:Irbesartan high-dose group;E:Statistical chart of GLUT4 relative expression level;*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group

2.5 厄貝沙坦對(duì)大鼠骨骼肌組織IRS-1及PI3K通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組IRS-1、PI3Kp85及p-AKT的表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，厄貝沙坦低、高劑量組大鼠IRS-1、PI3Kp85及p-AKT的表達(dá)均增多（P<0.05），見圖5。

圖5 厄貝沙坦對(duì)大鼠骨骼肌組織IRS-1及PI3K通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n=10）A：對(duì)照組B：模型組C：厄貝沙坦低劑量組D：厄貝沙坦高劑量組*P<0.05，與對(duì)照組比較#P<0.05，與模型組比較Fig.5 Effect of Irbesartan on theprotein expression of irS-1 and PI3K pathway in skeletal muscletissuesof rats（n=10）A:Control group;B:Model group;C:Irbesartan low-dose group;D:Irbesartan high-dose group;*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs model group

3 討論

高血壓合并T2DM是一種臨床常見疾病類型，其發(fā)病機(jī)制及病因不明確，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起并發(fā)癥威脅患者生命。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓、糖代謝異常者均存在高胰島素血癥，IR也被認(rèn)為是高血壓與T2DM主要的共同病理機(jī)制之一[9]。IR使機(jī)體中胰島素作用的靶組織（肝臟、骨骼肌、脂肪等）對(duì)胰島素作用的敏感性降低，無法正常響應(yīng)胰島素，葡萄糖攝取和處理能力降低，從而導(dǎo)致體內(nèi)血糖升高，胰島素抵抗還可刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)，心排血量增加，血管收縮或血管張力增加。

厄貝沙坦是一種血管緊張肽Ⅱ受體拮抗藥，能有效阻斷血管緊張肽Ⅱ的血管收縮而起到平穩(wěn)血壓的作用。有研究發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦能通過提高大鼠骨骼肌胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)而增加對(duì)胰島素的敏感性[10]；厄貝沙坦能夠促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素的釋放從而有效改善高胰島素血癥[11]。因此本研究通過對(duì)SHR合并T2DM大鼠灌服不同劑量的厄貝沙坦，觀察厄貝沙坦對(duì)大鼠的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，SHR合并T2DM大鼠給予厄貝沙坦后體重有不同程度的增加，血壓、血糖等指標(biāo)有不同程度的降低，通過HE染色檢測大鼠骨骼肌的病理變化也發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦能明顯改善SHR合并T2DM大鼠骨骼肌組織中肌纖維排列紊亂，間隙增加及波浪樣改變的情況，表明厄貝沙坦能夠促進(jìn)SHR合并T2DM大鼠的恢復(fù)。

PI3K/AKT信號(hào)通路是胰島素在葡萄糖代謝中的經(jīng)典途徑[12]。胰島素通過與靶細(xì)胞表面的胰島素受體（Insulin receptor，InsR）結(jié)合，激活β亞基酪氨酸激酶并與胰島素結(jié)合發(fā)生自磷酸化，進(jìn)一步激發(fā)細(xì)胞內(nèi)胰島素受體底物IRS家族磷酸化，其中被激活的IRS-1可與PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基結(jié)合并使AKT發(fā)生磷酸化。GLUT4蛋白是IRS-1/PI3K通路下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，主要定位于細(xì)胞膜，AKT發(fā)生磷酸化后可加速GLUT4從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，與細(xì)胞膜融合，增加葡萄糖的攝取[13]。大部分胰島素代謝活動(dòng)通過PI3K通路激活，而當(dāng)這條信號(hào)通路上的任何一個(gè)環(huán)節(jié)被減弱或抑制后均可能抑制胰島素生理作用進(jìn)而導(dǎo)致IR。研究顯示通過調(diào)節(jié)PI3K信號(hào)通路可影響T2DM大鼠骨骼肌中葡萄糖的攝取和利用[14]。Abdelmageed等人[15]也表明PI3K/AKT信號(hào)通路受損與糖尿病大鼠肝胰島素抵抗密切相關(guān)。本研究通過Western blot檢測各組大鼠骨骼肌中IRS-1/PI3Kp85/GLUT4通路蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，模型組中除AKT無 明 顯 變 化，IRS-1、PI3Kp85、p-AKT及GLUT4表達(dá)均明顯下降，而與模型組相比，厄貝沙坦各組IRS-1、PI3Kp85、p-AKT及GLUT4表達(dá)均有不同程度的上升。提示厄貝沙坦能夠通過IRS-1/PI3K/GLUT4信號(hào)通路抑制SHR合并T2DM大鼠IR，調(diào)節(jié)體內(nèi)胰島素及葡萄糖利用，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)SHR合并T2DM大鼠的保護(hù)作用。

綜上所述，厄貝沙坦可通過促進(jìn)IRS-1/PI3K/GLUT4信號(hào)通路對(duì)SHR合并T2DM大鼠發(fā)揮保護(hù)作用，本研究能夠?yàn)榕R床治療提供一定的理論依據(jù)。