多囊卵巢綜合征-胰島素抵抗大鼠子宮組織中PPARs異常表達(dá)與胰島素抵抗的關(guān)系

魏 巍,陳藝華,張秀智,冷義福,李 純,尹天曉

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,大連116001;2.大連大學(xué),大連116001)

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種影響生殖和代謝的內(nèi)分泌紊亂性疾?。?］。除了稀發(fā)排卵或無(wú)排卵、高雄激素等表現(xiàn)，PCOS患者常伴有胰島素抵抗（insulin resistance），PCOS合并胰島素抵抗的患者比例高達(dá)50%～70%［2］。PCOS患者排卵障礙和內(nèi)分泌異?？捎绊懽訉m內(nèi)膜正常的周期性變化，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜分泌反應(yīng)不良，甚至表現(xiàn)為不同程度的增生，從而影響胚胎著床，導(dǎo)致妊娠率降低和流產(chǎn)率升高，患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)增加［3-4］。應(yīng)用胰島素增敏劑是目前臨床治療PCOS-胰島素抵抗的有效手段。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisomal proliferator-activated receptors，PPARs）是胰島素增敏劑噻唑烷二酮（thiazolidinedione，TZD）類(lèi)藥物的作用靶點(diǎn)，是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子，包含3種亞型：PPARα、PPARβ、PPARγ。近年研究發(fā)現(xiàn)PPARs在人類(lèi)生殖系統(tǒng)中表達(dá)，可調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)生、排卵和黃體發(fā)育，參與胚胎發(fā)育及調(diào)節(jié)胎盤(pán)功能、維持妊娠等［5］。本文以PCOS-胰島素抵抗大鼠模型為研究對(duì)象，探討在子宮組織中PPARs異常表達(dá)與胰島素抵抗之間的關(guān)系，為PPARs調(diào)節(jié)劑藥物研發(fā)及安全有效地用于PCOS-胰島素抵抗治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)6周齡雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心［SCXK（遼）2013-0003］提供。每籠2只大鼠，于大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境［SYXK（遼）2018-0005］適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。室內(nèi)安靜，通風(fēng)良好，溫度為22～26℃，相對(duì)濕度為40%～70%，人工控制光照晝夜12 h/12 h，自由飲食，墊料1周更換2次。本研究通過(guò)大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查（2019130），所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑和儀器

人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）購(gòu)自寧波人健藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；胰島素注射液（商品名為諾和靈，規(guī)格10 mL：300 U）購(gòu)自諾和諾德（中國(guó)）制藥有限公司；ELISA試劑盒購(gòu)自上海朗頓生物技術(shù)有限公司，羅氏活力型血糖儀購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PPARα（兔單抗）、PPARβ（鼠單抗）、PPARγ（兔單抗）、胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）（兔多抗）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT-4）（兔單抗）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin like growth factor-1，IGF-1）（兔單抗）抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，所有試劑盒的質(zhì)控均符合要求。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立

40只雌性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組，各20只。模型組采用胰島素+hCG法造模［6］：于第1～21日頸背部皮下注射胰島素2.0 U/d，生理鹽水（即0.9%NaCl溶液）稀釋至0.2 mL，每日1次。第11～21日，皮下注射hCG 3.0 U/d，每日2次，以5%葡萄糖溶液替代日常飲水。從用藥第10日起，每日將大鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，1%瑞特藍(lán)染色后在顯微鏡下觀察陰道脫落細(xì)胞形態(tài)。于實(shí)驗(yàn)第22天，大鼠失去動(dòng)情周期超過(guò)7 d，且處死后顯微鏡下觀察可見(jiàn)卵巢形態(tài)呈現(xiàn)多囊樣改變，血睪酮及空腹胰島素升高，即視為造模成功［6］。對(duì)照組大鼠每日皮下注射生理鹽水0.2 mL，連續(xù)21 d。

1.4 標(biāo)本采集

于實(shí)驗(yàn)第22天（禁飲食12 h后），全部大鼠經(jīng)麻醉后稱(chēng)體質(zhì)量。經(jīng)大鼠尾靜脈取血，用于檢測(cè)空腹血糖。然后處死大鼠，于腹主動(dòng)脈取血5～7 mL，離心后取上清液，－80℃凍存?zhèn)溆?。取大鼠子宮組織，一部分用甲醛溶液固定，另一部分用于提取蛋白。

1.5 血清代謝指標(biāo)檢測(cè)

采用ELISA法測(cè)定空腹胰島素水平，具體操作步驟按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。然后結(jié)合空腹血糖值，計(jì)算穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)（insulin resistance index，HOMA-IR）。HOMA-IR＝空腹胰島素×空腹血糖/22.5。

1.6 子宮組織相關(guān)檢測(cè)

采用HE染色法觀察大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)子宮組織中PPARs的表達(dá)，操作過(guò)程包括組織石蠟包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)、血清封閉、免疫雜交及顯色、脫水封固及ImagePro-Plus軟件分析，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以平均吸光度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PPARs、IRS、GLUT-4、IGF-1蛋白表達(dá)水平，以β-Actin為內(nèi)參，操作過(guò)程包括蛋白質(zhì)樣品制備-蛋白質(zhì)定量-SDS-PAGE電泳-轉(zhuǎn)膜-免疫雜交反應(yīng)及顯影-凝膠成像分析系統(tǒng)，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ELISA結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠空腹血清中胰島素含量和穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)均明顯增高（P＜0.05），而空腹血糖含量在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1大鼠空腹胰島素、空腹血糖及穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)比較Table 1 Comparison of serum fasting insulin and fasting plasma glucose levels and insulin resistance index in rats（± s）

表1大鼠空腹胰島素、空腹血糖及穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)比較Table 1 Comparison of serum fasting insulin and fasting plasma glucose levels and insulin resistance index in rats（± s）

注：正常對(duì)照組注射等量生理鹽水；模型組注射胰島素+人絨毛膜促性腺激素，建立多囊卵巢綜合征-胰島素抵抗模型。

組別正常對(duì)照組模型組P值n 20 20空腹胰島素/(mU·L-1)27.58±0.92 48.19±1.24 0.001空腹血糖/（mmol·L-1）4.05±0.12 4.22±0.25 0.100穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)4.92±0.36 9.04±0.73 0.001

2.2 HE染色結(jié)果

正常對(duì)照組大鼠的子宮內(nèi)膜腺腔大、腺體多且呈簇狀排列；模型組大鼠的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)不同程度的增生性改變，腺腔變小，腺體數(shù)目減少，且排列松散（圖1）。

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果

PPARα、PPARβ及PPARγ3種亞型在大鼠子宮組織中均有表達(dá)。模型組大鼠PPARα、PPARγ在子宮組織中表達(dá)下調(diào)，與正常對(duì)照組大鼠相比的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PPARβ在兩組之間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1，表2）。

圖1 HE染色（×100）和免疫組織化學(xué)染色法（×200）分別檢測(cè)大鼠子宮組織形態(tài)及PPAR蛋白表達(dá)情況Figure 1 HE staining（×100）and immunohistochemistry staining of rat uterine tissues（×200）

2.4 蛋白質(zhì)印跡結(jié)果

模型組大鼠子宮組織中PPARα、PPARγ、IRS和GLUT-4表達(dá)下調(diào)，IGF-1表達(dá)上調(diào)，與正常對(duì)照組大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PPARβ的表達(dá)在兩組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05，圖2）。

表2大鼠子宮組織過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）平均吸光度值比較Table 2 Comparison of average absorbance value of peroxisome proliferators-activated receptors(PPAR)in rat uterinetissues（±s）

表2大鼠子宮組織過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）平均吸光度值比較Table 2 Comparison of average absorbance value of peroxisome proliferators-activated receptors(PPAR)in rat uterinetissues（±s）

注：PPARα、PPARβ及PPARγ分別為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體的3種亞型。

組別正常對(duì)照組模型組P值n 20 20 PPARα 60.05±0.92 45.55±1.09 0.001 PPARβ 45.58±1.02 44.78±1.47 0.180 PPARγ 63.40±1.21 47.20±0.58 0.001

圖2蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠子宮內(nèi)膜組織中各蛋白相對(duì)表達(dá)Figure2 Comparison of relativeexpression of variousproteinsin rat uterinetissues

3 討論

臨床上針對(duì)PCOS以藥物治療為主，很少采用外科手術(shù)治療，故PCOS患者的卵巢、子宮等組織取材比較困難，因此選用一種能準(zhǔn)確反映PCOS病理生理特征的動(dòng)物模型對(duì)于PCOS相關(guān)研究至關(guān)重要。目前，國(guó)內(nèi)外建立PCOS-胰島素抵抗動(dòng)物模型的主要方法有：雄激素造模法、雌激素造模法、胰島素聯(lián)合hCG造模法、來(lái)曲唑造模法、孕激素聯(lián)合hCG造模法、脫氫表雄酮聯(lián)合胰島素造模法、雄激素聯(lián)合hCG造模法等［6-10］。以上這些造模方法大多采用人源性激素誘導(dǎo)，但原理不盡相同，各有優(yōu)缺點(diǎn)［7-8］。其中胰島素+hCG造模法（Poretsky造模法）是一種經(jīng)典的造模方法。Poretsky等［9］和李軼等［10］均通過(guò)該方法成功誘導(dǎo)出PCOS-胰島素抵抗動(dòng)物模型，該模型具有卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥、胰島素抵抗、糖脂代謝異常等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)小組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)該造模法為優(yōu)選的PCOS-胰島素抵抗造模方法［6］，能很好模擬出PCOS的病理生理特點(diǎn)，動(dòng)物模型與PCOS患者臨床表現(xiàn)的吻合率比較好，且該方法造模成功率可達(dá)90%以上。故本研究采用胰島素+hCG造模法誘導(dǎo)PCOS-胰島素抵抗大鼠模型。

本研究中，模型組大鼠失去明顯的動(dòng)情周期，表現(xiàn)糖代謝異常；ELISA結(jié)果表明，模型組與對(duì)照組相比，大鼠血清中空腹胰島素和穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)均增高（P＜0.05），說(shuō)明模型組大鼠外周血存在胰島素抵抗；HE染色顯示，模型組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目減少，為單個(gè)腺體松散排列，腺腔小而直；蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，模型組大鼠子宮組織中IRS、GLUT-4表達(dá)下調(diào)，而IGF-1表達(dá)上調(diào)，提示模型組大鼠在外周血及子宮組織存在胰島素抵抗。

胰島素抵抗是指外周組織對(duì)胰島素的敏感性降低，對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)作用減弱，胰島素代償性分泌增加，形成高胰島素血癥。目前認(rèn)為，胰島素抵抗是PCOS主要的病理表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制，機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗后導(dǎo)致PCOS發(fā)生的主要原因包括，繼發(fā)高胰島素血癥導(dǎo)致卵巢功能障礙、抑制排卵、雄激素分泌增加、引發(fā)高雄激素血癥等［11］。而高雄激素血癥是PCOS的特征性臨床表現(xiàn)之一。PCOS患者的高雄激素血癥與高胰島素血癥存在相互作用［12］，高雄激素血癥又可直接和間接誘導(dǎo)機(jī)體胰島素抵抗［13］。本研究證實(shí)，PCOS-胰島素抵抗大鼠的子宮組織存在胰島素抵抗。Chang等［14］發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗患者的著床率和臨床妊娠率比非胰島素抵抗患者低。另有研究表明，胰島素抵抗及高胰島素血癥可促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生及癌變，增加了非妊娠女性患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)［15］。

應(yīng)用胰島素增敏劑改善胰島素抵抗對(duì)PCOS患者的治療效果明確［16-17］。胰島素增敏劑可以調(diào)節(jié)糖脂代謝，降低高胰島素水平，減少血清雄激素水平，并可促進(jìn)正常卵泡的發(fā)育和成熟卵子的排出，改善子宮內(nèi)膜容受性，增加妊娠率，降低自然流產(chǎn)發(fā)生率，從而改善PCOS患者的生殖功能［18-19］。

PPARs是一類(lèi)由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族，目前有3種亞型：PPARα、PPARβ、PPARγ［19］。PPARs是胰島素增敏劑的作用靶點(diǎn)，在維持機(jī)體正常的生理功能中起重要作用，包括生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝、細(xì)胞分化等，與癌癥、不育、肥胖、糖尿病等疾病的發(fā)生有關(guān)［20-21］。PPARs主要是通過(guò)與配體結(jié)合活化后，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)節(jié)能量平衡和卵巢功能，包括卵母細(xì)胞成熟、排卵、黃體形成等［22］。

PPARs與生殖的關(guān)系密切。在卵巢層面，PPARα和PPARγ通過(guò)調(diào)控一些蛋白酶來(lái)參與排卵及黃體形成［19］，而關(guān)于PPARβ在卵巢組織中的功能研究還尚無(wú)報(bào)告。PPARγ在動(dòng)物及人類(lèi)卵巢顆粒細(xì)胞、卵細(xì)胞中均有表達(dá)，參與性激素生成、卵巢各種細(xì)胞的分化和增殖［23］。有研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮在飲食誘導(dǎo)的大鼠模型中可以明顯提高卵巢功能［24］。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在小鼠卵巢組織中敲除PPARγ會(huì)導(dǎo)致生育能力下降［25］。在子宮層面，有研究發(fā)現(xiàn)將大鼠PPARα敲除，大鼠流產(chǎn)率明顯增加［26］；缺乏PPARβ的大鼠的胎盤(pán)發(fā)育出現(xiàn)缺陷［27］；PPARγ在大鼠及人類(lèi)胎盤(pán)中均有表達(dá)［28-29］；PPARγ失活將導(dǎo)致胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞分化缺陷、早期胚胎死亡，以及嚴(yán)重的胎盤(pán)發(fā)育損傷［30］。

此外，PPARs的異常表達(dá)與PCOS發(fā)病密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ在PCOS大鼠脂肪組織基質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低［31］。另有報(bào)道，PPARγ基因Pro12Ala多態(tài)性可能是PCOS多種發(fā)病機(jī)制中的重要因素之一，等位基因Ala的存在與胰島素敏感性增高及PCOS-胰島素抵抗減弱密切相關(guān)［32］。

本研究結(jié)果證實(shí)，PPARα、PPARβ及PPARγ在大鼠子宮組織中均有表達(dá)；免疫組織化學(xué)及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果一致，均顯示模型組的PPARα、PPARγ表達(dá)水平均低于對(duì)照組，PPARβ表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，說(shuō)明PCOS大鼠子宮內(nèi)膜中PPARα、PPARγ呈現(xiàn)低表達(dá)，其與胰島素抵抗有一定的聯(lián)系。之前也有研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中PPARγmRNA的表達(dá)水平明顯低于正常人組［33］，這與本研究結(jié)果相吻合。

在PPARs的3種亞型中，目前有關(guān)PPARγ的報(bào)告最多。PPARγ是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類(lèi)藥物的作用靶點(diǎn)，可通過(guò)激活胰島素受體亞單位上的酪氨酸激酶，使酪氨酸磷酸化，從而改善胰島素抵抗，降低血糖及胰島素水平，提高PCOS患者的排卵率及妊娠率［34］。但長(zhǎng)期服用PPARγ激動(dòng)劑可引起肥胖、水腫，并增加罹患心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生肝毒性等不良反應(yīng)，因此不能大量及長(zhǎng)期服用［35］。PPARα是貝特類(lèi)藥物的作用靶點(diǎn)，主要是通過(guò)調(diào)控脂肪酸代謝相關(guān)基因來(lái)調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝，還能改善免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，改善胰島素的耐受性［36］；此外，長(zhǎng)期應(yīng)用貝特類(lèi)降血脂藥物會(huì)增加患膽結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)，引起肌肉毒性等［37］。另有研究表明，PPARβ激動(dòng)劑通過(guò)上調(diào)PPARγ輔激活子1α表達(dá)，增強(qiáng)線(xiàn)粒體β氧化和能量代謝能力，從而改善胰島素敏感性［38］。本研究中并未發(fā)現(xiàn)PPARβ與胰島素抵抗的確切關(guān)系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在PCOS-胰島素抵抗大鼠子宮組織中IRS、GLUT-4表達(dá)下調(diào)，而IGF-1表達(dá)上調(diào)，證實(shí)在子宮組織層面存在胰島素抵抗，其機(jī)制可能與PCOS大鼠子宮組織PPARα、PPARγ表達(dá)下調(diào)相關(guān)。并且本研究證實(shí)，在子宮層面上不僅有PPARγ的表達(dá)，也有PPARα和PPARβ表達(dá)。已知PPARs單靶點(diǎn)藥物存在缺陷，而PPARα/PPARγ雙激動(dòng)劑或PPARα/PPARβ/PPARγ泛調(diào)節(jié)劑的治療效果好，弊端少，是后續(xù)進(jìn)行胰島素增敏劑開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一，也是未來(lái)治療PCOS和胰島素抵抗藥物研究的一個(gè)重要方向。目前本研究小組相關(guān)的臨床研究正在進(jìn)行中，期待后續(xù)研究結(jié)果能為PPARs在PCOS-胰島素抵抗疾病診療領(lǐng)域提供新的思路。