CD137信號調控內皮細胞間質轉化促進小鼠心腦血管新生

翁嘉懿,馬雪興,李 淵,孫康云

(1.江蘇大學附屬醫(yī)院心血管內科,鎮(zhèn)江212000;2.蘇州市立醫(yī)院,南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院心血管內科,蘇州215000)

血管新生是從原血管以出芽方式形成新生微血管，是動脈粥樣硬化（atherosclerosis）易損斑塊的特征性病變。內皮細胞間質轉化（endothelium-mesenchymal transition，End-MT）是介導炎性細胞浸潤、血管新生、影響動脈粥樣硬化斑塊完整性，從而誘發(fā)動脈粥樣硬化易損斑塊破裂并導致一系列急性心腦血管事件的關鍵因素，是遠期心血管事件可靠的獨立預測因子［1］。End-MT是內皮細胞在各種病理因素作用下向間充質細胞轉化的過程，在該過程中內皮細胞逐漸失去其形態(tài)和功能，獲得增殖、遷移和合成膠原等間充質細胞表型特點［2］。在炎性浸潤、缺氧等因素刺激下，動脈粥樣硬化斑塊內發(fā)生End-MT的內皮細胞一方面可促進膠原-基質金屬蛋白酶合成，促使斑塊纖維帽變??；另一方面內皮細胞失去特異性抗原，獲得間質細胞抗原，同時其功能發(fā)生改變，獲得較強的增殖、遷移能力，通過促進新生血管形成，導致斑塊破裂和繼發(fā)臨床急性事件的發(fā)生［3］。近期研究結果證實：冠狀動脈易損斑塊內End-MT細胞數量及新生血管數量顯著增加［4］。End-MT過程受多種刺激因素和Wnt信號通路調控，這些信號通路相互調節(jié)，從而激活多種轉錄基因，影響End-MT的發(fā)生和發(fā)展［5-6］。目前，End-MT的具體調控機制仍在研究中，可能與干預因素、微環(huán)境變化及調控血管新生的關鍵分子有關。

CD137屬腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成員，在動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊中高表達。CD137信號通路在血管新生及動脈粥樣硬化進展過程中起著至關重要的作用［7］。CD137分子與其配體結合可作為共刺激分子，促進T淋巴細胞激活，進一步加速炎性因子釋放而加重炎性反應，從而促進動脈粥樣硬化進展。新近研究表明，CD137信號在動脈粥樣硬化斑塊形成中起重要作用，動脈粥樣硬化斑塊中存在CD137高表達，而CD137基因敲除小鼠的粥樣斑塊明顯減少［8-9］。本課題組前期研究發(fā)現，CD137信號可以促進動脈粥樣硬化斑塊內新生血管的形成［10］。本研究在此基礎上進一步觀察CD137信號是否通過調控內皮細胞End-MT促進血管新生，即通過分別激動CD137信號和在抑制End-MT相關信號的基礎上激動CD137信號，觀察End-MT及內皮細胞管腔形成能力和動脈環(huán)血管新生能力。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要實驗材料

SPF級別8周齡C57BL/6J雄性小鼠20只，體質量20～22 g，由江蘇大學動物實驗中心［SCXK（蘇）2018-0012］提供，飼養(yǎng)于江蘇大學實驗動物中心［SYXK（蘇）2018-0053］，根據實驗動物相關管理規(guī)定進行操作和處理。動物實驗經江蘇大學動物福利倫理委員會批準（UJS-IACUC-2019102902）。CD137L重組蛋白、PCR上下游引物均由上海生工生物工程有限公司設計并合成；胎牛血清、高糖培養(yǎng)基（DMEM）、雙抗、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）購 自 美 國PeproTech公司；兔抗鼠CD31、血管內皮細胞鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VECadherin）、成纖維細胞特異性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，FSP-1）、Wnt和肌動蛋白α（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體，以及內參GAPDH單克隆抗體均購自德國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自美國Invitrogen公司；Wnt信號抑制劑（IWR-1）購自安諾倫（北京）生物科技有限公司；RNA提取試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒和反轉錄試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；基質膠購自武漢艾美捷科技有限公司；小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3購自美國標準培養(yǎng)物保藏中心；Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；鼠尾Ⅰ型膠原購自德國Millipore公司；眼科手術器械購自北京中興名業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.2 細胞及動脈環(huán)的培養(yǎng)

小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3［11］在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后置于37℃培養(yǎng)箱中，待細胞融合度為80%～90%時，以0.25%胰蛋白酶消化后離心細胞，常規(guī)傳代。

以頸椎脫臼法處死小鼠，取下胸主動脈后，置于質量濃度為2 g/L的Ⅱ型膠原酶中，并放入37℃培養(yǎng)箱中消化6～7 min以去除外膜。然后，將血管均勻地剪成約0.5 mm長的動脈環(huán)，放入無血清培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)箱中饑餓過夜。將預處理過的動脈環(huán)包埋入質量濃度為1 g/L的鼠尾I型膠原包被的96孔板中。96孔板在室溫平衡10 min后，放入37°C培養(yǎng)箱孵育30 min。待膠原凝固后，加入含2.5%胎牛血清的DMEM 100μL/孔覆蓋膠原表面，隔天換液。

1.3 實驗分組及干預

細胞分組：將密度為2×105個/孔的bEnd.3細胞接種于6孔板，加入質量濃度為10 ng/mL的TNF-α刺激24 h進行預處理（誘導內皮細胞表達CD137）。按隨機數字表法將預處理后的內皮細胞分為3組：（1）對照組，即培養(yǎng)基中加入質量濃度為10 ng/mL的TNF-α；（2）CD137刺激組，即培養(yǎng)基中加入質量濃度為10 ng/mL的TNF-α和質量濃度為5 mg/L的CD137抗體；（3）CD137抑制組，即培養(yǎng)基中加入濃度為200 nmol/L的IWR-1預處理細胞30 min后，再加入質量濃度為10ng/mL的TNF-α和質量濃度為5mg/L的CD137抗體。各組內皮細胞均置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后提取細胞蛋白或RNA備用。

動脈環(huán)分組：以鼠尾I型膠原（質量濃度為1 g/L）包被96孔板后，將動脈環(huán)按1個/孔包埋入96孔板，干預措施同上。

1.4 熒光定量PCR檢測內皮細胞中CD31、VECadherin、FSP-1、Wnt和α-SMA mRNA水平

經不同組處理后的細胞按照TRIzol法提取總RNA，并用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，以反轉錄產物為模板，GAPDH為內參，用SYBR法檢測CD31、VE-Cadherin、FSP-1、Wnt和α-SMA的mRNA表達。PCR反應體系總體積為20μL反應，依次加入TaKaRa Taq Premix 10μL，上下游引物（濃度10nmol/L，引物序列見表1）各1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。PCR反應條件：預變性95℃5 min；變性95℃5 s，退火60℃30 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。

1.5 蛋白質印跡法檢測CD31、VE-Cadherin、FSP-1、Wnt和α-SMA蛋白表達水平

各組內皮細胞分別按照RIPA裂解液及組織蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，分裝后在－20°C保存待用。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，以350 mA恒流120 min轉印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。PVDF膜置于質量分數為5%的脫脂牛奶TBST緩沖液中，37°C封閉1 h，再分別加入相應的兔抗鼠CD31（1︰1 000）、VE-Cadherin（1︰1 000）、FSP-1（1︰1 000）、α-SMA（1︰1 000）、Wnt（1︰1 000）和GAPDH抗體（1︰3 000），4℃孵育過夜。次日用TBST洗滌3次，采用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1︰7 000），37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL顯色系統(tǒng)定影顯色，使用LANE-1D圖像分析軟件對掃描灰度值進行相對定量分析。

1.6 Transwell遷移實驗檢測內皮細胞遷移能力

各組內皮細胞經預處理培養(yǎng)24 h后，消化收集細胞并計數，將收獲細胞配制成1.5×106個細胞/mL的懸液，按1×105個細胞/孔加入Transwell小室上室（分組干預措施見1.3節(jié)）。12 h后取出小室，用棉簽拭去聚碳酸酯膜上室側細胞，下室側細胞經固定，結晶紫染色，漂洗和拍照。每組設置3個復孔，實驗重復3次。用Image-ProPlus 6.0軟件計算每組下室側細胞數量，分別取各組細胞數量的平均值，然后計算CD137刺激組與對照組及CD137抑制組與對照組細胞數量的比值。

1.7 內皮細胞管腔形成實驗檢測管腔形成能力

各組內皮細胞經預處理培養(yǎng)24 h后，消化收集細胞并計數，將收獲細胞配制為1.5×105個細胞/mL的懸液，按1.5×104個細胞/孔接種于基質膠包被的96孔板，每孔覆蓋100μL培養(yǎng)基（分組干預措施見1.3節(jié)）。24 h后拍照，通過Image-ProPlus6.0軟件分析各組內皮細胞形成小管的長度及分支數量。每組設置4個復孔，實驗重復3次以上。

1.8 小鼠主動脈環(huán)血管新生實驗檢測新生血管形成能力

以約80μL/孔鼠尾膠原包被預冷的96孔板，將動脈環(huán)包埋入液態(tài)基質膠。96孔板在室溫平衡10 min后放入37°C培養(yǎng)箱孵育30 min，待膠原凝固后加入100μL/孔培養(yǎng)基（分組干預措施見1.3節(jié)）覆蓋膠原表面，隔天換液。7 d后在倒置顯微鏡下觀察動脈環(huán)新生微血管的數量和分支。每組設置5個復孔，實驗重復3次以上。

表1實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

1.9 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 16.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示。兩兩比較采用t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠內皮細胞中CD31、VE-Cadherin、FSP-1、α-SMA、Wnt mRNA及蛋白表達水平

熒光定量PCR結果見圖1A。與對照組比較，CD137刺激組的內皮細胞中CD31和VECadherin mRNA表達水平較低（P值均＜0.05），FSP-1、α-SMA和Wnt表達水平較高（P值均＜0.05）；與CD137刺激組比較，CD137抑制組的內皮細胞中CD31和VE-Cadherin mRNA表達水平較高（P值均＜0.05），FSP-1、α-SMA和Wnt表達水平較低（P值均＜0.05）。

蛋白質印跡法檢測結果見圖1B。與對照組比較，CD137刺激組的內皮細胞中CD31和VECadherin蛋白表達水平較低（P值均＜0.05），FSP-1、α-SMA和Wnt蛋白表達水平較高（P值均＜0.05）；與CD137刺激組比較，CD137抑制組的內皮細胞中CD31和VE-Cadherin蛋白表達水平較高（P值均＜0.05），FSP-1、α-SMA和Wnt蛋白表達水平較低（P值均＜0.05）。

圖1小鼠腦微血管內皮細胞中CD31、VE-Cadherin、FSP-1、α-SMA、Wnt mRNA及蛋白表達水平比較Figure 1 Comparison of the expression of CD31，VE-cadherin，FSP-1，α-SMA，Wnt at the mRNA and protein levels in cardio-cerebral endothelial cellsin thethreegroups

2.2 小鼠內皮細胞的遷移能力

Transwell細胞侵襲實驗結果見圖2A。CD137刺激組小鼠內皮細胞的遷移數量（1.21±0.13）多于對照組（1.00±0.00），CD137抑制組小鼠內皮細胞遷移數量少于CD137刺激組（0.83±0.07），差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。

2.3 小鼠內皮細胞管腔形成能力

內皮細胞管腔形成實驗結果見圖2B。CD137刺激組的內皮細胞小管長度［（5.97±0.23）mm］大于對照組［（4.16±0.14）mm］，分支數量（31.58±1.43）多于對照組（24.11±1.10）個，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）；而CD137抑制組內皮細胞小管長度［（2.03±0.09）mm］和分支數（7.68±0.93個）均小于CD137刺激組（P值均＜0.05）。

2.5 小鼠主動脈環(huán)血管新生情況

動脈環(huán)新生血管形成實驗結果見圖2C。小鼠主動脈環(huán)CD137刺激組的新生微血管數量（23.82±5.12）多于對照組（2.14±1.80），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而CD137抑制組新生微血管數量（3.16±1.10）少于CD137刺激組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2小鼠腦微血管內皮細胞的遷移能力、管腔形成能力和動脈環(huán)新生血管形成能力比較Figure2 Comparison of themigration and tubeformation abilities of cardio-cerebral endothelial cellsaswell asthe angiogenesis ability of mouse aortic rings in the three groups（the scale is 100μm）

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病已成為人類死亡率最高的疾病之一，尤其是動脈粥樣硬化誘發(fā)的急性心肌梗死的致殘及致死率極高，已成為國民“頭號殺手”。心腦血管疾病共同的病理基礎是動脈粥樣硬化。多項回顧性研究均顯示在冠狀動脈易損斑塊內檢測到新生微血管密度顯著增加，絕大多數動脈粥樣硬化斑塊內的新生血管在炎性浸潤、缺氧等因素刺激下，隨著斑塊發(fā)展而數量增多，為炎性介質浸潤提供了通道，有助于斑塊脂核形成及擴大，促進斑塊內出血，更容易導致斑塊破裂和臨床急性事件如心肌梗死的發(fā)生［12］，這一點近期也被關于人類斑塊血管新生的一項前瞻性研究結果所證實［13-14］。我們前期研究證實，伴隨著CD137信號激活，小鼠動脈粥樣硬化斑塊內新生血管形成數量增加，內皮細胞增殖、遷移及管腔形成能力增加［15］，提示CD137信號可能促進動脈粥樣硬化斑塊內血管新生并導致斑塊不穩(wěn)定。

但是CD137信號如何促進動脈粥樣硬化中血管新生的機制目前尚不清楚，血管新生過程受多種血管生成刺激和抑制因子的雙重調控。Chen等對43例不同嚴重程度的冠心病患者的冠狀動脈進行檢測，發(fā)現冠狀動脈病變嚴重程度與內皮成纖維細胞生長因子受體FGFR1表達缺失，Wnt信號轉導增加、End-MT的發(fā)生程度密切相關［16］。動脈粥樣硬化病變早期，Wnt信號通路激活導致End-MT增加，產生未完全成熟的成纖維細胞，促進End-MT過程引起的新生血管形成，并在動脈粥樣硬化斑塊晚期促進斑塊的鈣化，而當這一信號被抑制時，End-MT程度降低，新生內膜形成減少［17-18］。這些結果提供了強有力的證據：End-MT這一過程有助于動脈粥樣硬化新生血管形成，進而促進病變發(fā)生和進展，更容易導致斑塊破裂和繼發(fā)臨床急性事件的發(fā)生。

CD137信號是否通過End-MT調控動脈粥樣硬化血管新生呢？現有的研究尚不能回答這個問題。故本實驗分別從細胞和離體實驗兩方面分別觀察激活CD137信號通路并抑制Wnt信號，觀察對End-MT及新生血管形成的影響。在細胞實驗中，我們前期實驗已證實CD137信號激活，內皮細胞增殖、遷移、成管能力顯著增強，可促進血管新生，但其中機制尚不明確。本實驗中，我們發(fā)現激活CD137信號通路，伴隨著內皮細胞形成管腔長度、分支數量增加，動脈環(huán)新生微血管數量增加，內皮細胞內Wnt信號激活，CD31、VECadherin內皮細胞表型蛋白表達減少，間充質細胞表型FSP-1和α-SMA表達增加。綜合國內外研究進展及前期工作，我們提出CD137信號通路可能通過調控內皮細胞內皮-間質細胞轉化促進血管新生的假說，為驗證該假說，本研究通過Wnt信號抑制劑抑制End-MT相關信號通路激活，再次激活CD137信號，檢測內皮細胞遷移及管腔形成能力，觀察小鼠動脈環(huán)新生血管形成能力。結果顯示，激活CD137信號，內皮細胞內內皮細胞表型CD31、VE-Cadherin表達下降，間充質細胞表型FSP-1和α-SMA表達增加，Wnt信號激活，同時內皮細胞增殖、遷移等管腔形成能力增加，形成小管長度及分枝增加，小鼠動脈環(huán)新生血管形成能力增加，不僅如此，抑制Wnt信號后，再刺激CD137信號，與CD137刺激組比較，內皮細胞內內皮細胞表型CD31、VE-Cadherin表達升高，間充質細胞表型FSP-1和α-SMA表達下降，同時內皮細胞增殖、遷移等管腔形成能力減弱，形成小管長度及分枝減少，小鼠動脈環(huán)新生血管數量顯著減少。綜上所述，本次研究結果提示，CD137信號通路通過End-MT介導新生血管的形成。然而，EndMT目前在體水平缺乏明確的功能學定義與生物學標志物，本研究在動物水平的研究中對End-MT的定義也較為模糊，內皮細胞標志蛋白與間充質細胞特異性蛋白的細胞表達定位有待進一步證實，CD137信號激活Wnt信號后是如何傳遞信息與相應靶基因結合促發(fā)End-MT的形成？CD137信號軸如何調控Wnt信號及其與該信號通路間的相互作用以及各自在誘發(fā)End-MT進程中發(fā)揮多大作用，其具體機制如何，均需要深入探討。

綜上所述，CD137信號通路可能通過End-MT促進小鼠動脈粥樣硬化斑塊內的血管新生。本實驗為了解CD137-CD137L信號通路與新生血管形成的相關性提供了理論基礎，也為預防和治療動脈粥樣硬化提供了新思路。