復雜疾病小鼠模型構(gòu)建新策略：類精子單倍體胚胎干細胞介導的半克隆技術(shù)

賴梭梅,丁一夫,李勁松

[1.中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心(生物化學與細胞生物學研究所),細胞生物學國家重點實驗室,上海200031;2.中國科學院大學,北京100039]

由于能夠掩蓋發(fā)生的隱性突變，提高環(huán)境適應度，二倍體基因組是大多數(shù)動物的典型特征，但這恰好限制了基于突變研究的遺傳學的發(fā)展［1］。而單倍體基因組具有外顯優(yōu)勢，非常適合用于在體外分析各種突變對基因功能的影響。在自然狀態(tài)下，因酵母能夠以單倍體形式穩(wěn)定存活［2］，故圍繞功能基因篩選的研究常常在酵母上開展。同時，科研人員一直試圖構(gòu)建一種可用于體外篩選的單倍體細胞系，尤其是哺乳動物的單倍體細胞系。

自然狀態(tài)下哺乳動物體內(nèi)的單倍體細胞只有精子和卵細胞，但是目前的技術(shù)尚無法實現(xiàn)體外長期培養(yǎng)精子或卵細胞以用于研究［3-4］?？蒲腥藛T在19世紀70年代就探索利用胚胎分割［5］、孤雌激活卵母細胞［6］、顯微去除原核［7］等方法構(gòu)建單倍體胚胎，并成功地獲得了小鼠的單倍體胚胎［8］。然而單倍體基因組在體外會自發(fā)地二倍體化，因此體外長期培養(yǎng)單倍體細胞成為了一個難以逾越的壁壘。直到2011年，科研人員才實現(xiàn)哺乳動物單倍體胚胎干細胞的體外培養(yǎng)［9］。

因為單倍體細胞的突變都是顯性的，在類精子單倍體胚胎干細胞技術(shù)誕生之前，單倍體的應用主要集中于功能基因篩選。2009年，Carette等［10］借助人慢性髓細胞性白血病細胞系KBM-7（該細胞系除了8號染色體外，其余染色體都是單倍體核型）進行遺傳篩選。他們利用KBM-7單倍體細胞篩選細胞致死性膨脹毒素（cytolethal distendingtoxins，CDTs）所必需的宿主因子，并通過在單倍體上大規(guī)模敲除基因，使得篩選病原體致病所必需的宿主因子如毒素、病毒、受體的配體成為可能。最后研究者成功找到了鞘磷脂合成酶1和G蛋白偶聯(lián)受體TMEM181分別獨立地插入失活的抗CDTs的細胞系。2008年，Chong等［11］構(gòu)建了條件性Drosha敲除的小鼠。Drosha在細胞核中催化pri-miRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為premiRNA莖環(huán)前體［12］，這對于miRNA加工的起始非常重要。2011年之前尚無Drosha敲除細胞系的報告。直到2011年，Elling等［13］利用基因誘捕（gene trap）技術(shù)，在單倍體細胞上獲得了一株不表達Drosha的細胞系。

在過去的一個世紀里，基因篩選已經(jīng)幫助人們闡明了多種生物學過程［14］。但對于基因功能的研究，尤其是復雜的人類疾病，僅在細胞水平上進行基因篩選是遠遠不夠的，一些簡單的動物模型不足以闡明疾病發(fā)生的具體機制。因此，構(gòu)建更貼近人類發(fā)病模式的復雜疾病小鼠模型在疾病相關(guān)研究中顯得非常重要。

近幾十年來，基因編輯小鼠模型使得生物領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究有了飛躍式進展，尤其是與人類有關(guān)的研究如衰老［15］、腫瘤［16］、自閉癥［17］、抑郁癥［18］、肥胖［19］，以及各種器官損傷、再生、修復等基礎(chǔ)研究。但科研工作者仍然渴求在短時間內(nèi)以較低成本獲得特定的基因型小鼠，這需要實現(xiàn)基因組的編輯，并將這種編輯傳遞到生殖系中。人們最開始是通過同源重組實現(xiàn)基因組的編輯，然后是病毒介導的轉(zhuǎn)基因、重組鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應蛋白核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術(shù)，尤其是2020年諾貝爾化學獎得主Charpentier和Doudna等開發(fā)的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白核酸酶9（CRISPR-associated nuclease 9，Cas9）技術(shù)。這些技術(shù)的出現(xiàn)使得基因組編輯越來越便捷、精準。例如，應用原核注射或卵胞質(zhì)內(nèi)注射，或者通過囊胚注射，可以將基因編輯上升到小鼠個體水平。

遺憾的是，采用常規(guī)的動物模型建立技術(shù)產(chǎn)生的模型小鼠存在或多或少的嵌合，嵌合體需要通過交配獲得無嵌合的小鼠。而如果是多基因同時編輯的模型動物，在交配時由于存在基因分離現(xiàn)象，會極大地增加飼養(yǎng)與鑒定的成本。2012年類精子單倍體胚胎干細胞的誕生［20］以及后續(xù)的優(yōu)化工作［21］，證明了利用類精子單倍體胚胎干細胞可以高效地獲得多基因雜合編輯的半克隆小鼠，可直接將細胞水平的編輯傳遞到小鼠個體水平，為人類復雜疾病的動物模型研究帶來了新的工具。

1 類精子單倍體胚胎干細胞技術(shù)的發(fā)展歷程

核移植技術(shù)和單倍體胚胎干細胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化，使得從單倍體胚胎中獲取可體外穩(wěn)定培養(yǎng)的單倍體胚胎干細胞成為可能［22］。1970年，F(xiàn)reed等［23］在美洲豹蛙的孤雄胚胎中建立了兩株單倍體細胞系，其中一株可以傳代200次以上。1975年，Philippe等［24］成功在體外培養(yǎng)了蟑螂孤雌胚胎來源的單倍體細胞。1978年，Debec［25］建立并培養(yǎng)了黑腹果蠅的單倍體細胞。1999年，Kotecki等［26］從慢粒細胞白血病患者的骨髓中通過連續(xù)亞克隆的方式分離出了“近單倍體”的細胞系KBM-7，該細胞系中除了8號染色體是2條，其余皆為1條。2009年，Yi等［27］構(gòu)建了青鳉魚孤雌單倍體多能干細胞，再次將單倍體細胞的研究推向高潮。然而在哺乳動物胚胎中，單倍性維持和發(fā)育并不兼容，盡管在卵圓筒期（egg cylinder stage）的孤雌胚胎中觀察到了單倍體細胞的存在，但是存活的胚胎中細胞多為二倍體［9］。直到2011年，Leeb等［9］引入了2i培養(yǎng)系統(tǒng)（含有兩個小分子抑制劑PD184352、CHIR99021）后，才成功獲得了小鼠孤雌單倍體胚胎干細胞，并通過流式分選富集單倍體，可在體外維持該細胞系的單倍性35代左右。PD184352和CHIR99021通過抑制糖原合成酶激酶3和絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路，促進胚胎干細胞的自我更新［28-29］，白血病抑制因子可抑制胚胎干細胞的分化［29］。同年Elling等［13］也建立了小鼠孤雌單倍體胚胎干細胞系。但是Leeb和Elling等只是通過多能性實驗驗證了他們獲得的孤雌單倍體胚胎干細胞具有體內(nèi)外的分化能力，研究并未證明其獲得的小鼠孤雌單倍體胚胎干細胞能否發(fā)生生殖系嵌合，是否保留母源基因組的表觀遺傳特性，以及是否能代替卵子基因組獲得半克隆小鼠。

單倍體胚胎干細胞研究的一個重大突破是2012年Li帶領(lǐng)的團隊首次建立了小鼠孤雄胚胎來源的單倍體胚胎干細胞，這些孤雄單倍體胚胎干細胞保持了大部分的父源印記，表達典型的多能性基因，并在注射到二倍體囊胚時，可嵌合發(fā)育成生殖系在內(nèi)的各種組織；最重要的是孤雄單倍體胚胎干細胞在注入卵母細胞后可以產(chǎn)生可育的小鼠［20］。同年Zhou帶領(lǐng)的團隊也獨立建立了小鼠孤雄單倍體胚胎干細胞，并證明了這類細胞替代精子內(nèi)遺傳物質(zhì)的可能性［30］。

此外，孤雄單倍體胚胎干細胞的出現(xiàn)使得復雜基因編輯小鼠的獲取變得更加容易。但是通過注射孤雄單倍體胚胎干細胞獲得小鼠的效率很低，不到移植胚胎的2%，并且還有大約50%的半克隆小鼠呈現(xiàn)出生長遲緩的表型，在出生后不久就死亡。低出生效率、生長遲緩的現(xiàn)象直接阻礙著利用孤雄單倍體胚胎干細胞構(gòu)建基因修飾小鼠。直到2015年，Zhong等［31］利用CRISPR/Cas9技術(shù)在孤雄單倍體胚胎干細胞中將H19、IG差異性甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR）敲除，這種敲除后的孤雄單倍體胚胎干細胞的基因組更接近精子中的狀態(tài)；進一步將雙敲除的孤雄單倍體干細胞注射到卵母細胞后，產(chǎn)生健康半克隆小鼠的效率高達22.3%，這比2012年Yang等［20］的研究結(jié)果提高了10倍，真正意義上將孤雄單倍體胚胎干細胞由概念上的創(chuàng)新轉(zhuǎn)變?yōu)轭惥訂伪扼w胚胎干細胞這一強有力的構(gòu)建小鼠模型的工具。次年，Yang等［32］通過孤雌激活的方法，成功獲得了兩株食蟹猴孤雌單倍體胚胎干細胞MPH1和MPH2。食蟹猴孤雌單倍體胚胎干細胞具有胚胎干細胞的典型特征；最重要的是，食蟹猴孤雌單倍體胚胎干細胞支持體外遺傳操作，能夠用于大規(guī)模的遺傳篩選研究。

2016年Li等［33］將小鼠的孤雌單倍體胚胎干細胞和大鼠的孤雄單倍體胚胎干細胞融合在一起，形成的異源二倍體不僅含有穩(wěn)定的基因組，而且具有分化成三胚層和早期生殖細胞的多能性；同時，小鼠和大鼠單倍體胚胎干細胞的等位基因?qū)Ξ愒炊扼w中的基因表達貢獻類似。同年Sagi等［34］和Zhong等［35］分別采用孤雌激活和去除受精卵雄原核的方式，從單倍體孤雌囊胚中獲得了人單倍體胚胎干細胞系。隨后，Zhong等［35］和Li等［36］證明將敲除了2個印記基因DMR（H19、IG）的孤雌單倍體胚胎干細胞注射到卵母細胞中，可以產(chǎn)生存活的孤雌來源小鼠。2年后，Li等［37］研究發(fā)現(xiàn)，敲除了7個母源性高甲基化印記基因（Nespas、Grb10、lgf2r、Snrpn、Kcnq1、Peg3和Gnas）的孤雄單倍體胚胎干細胞和精子共注射后，采用四倍體補償技術(shù)，可以產(chǎn)生存活的孤雄小鼠，但是這些孤雄小鼠出生后不久便相繼死亡，提示目前仍有很多的印記相關(guān)問題有待研究。

2 類精子單倍體胚胎干細胞的特性

為了獲得類精子單倍體胚胎干細胞，首先需要將受精卵中的雌原核去除以獲得孤雄單倍體胚胎，進一步將體外培養(yǎng)至囊胚時期的孤雄單倍體胚胎的內(nèi)細胞團分離進行培養(yǎng)，就可以獲得類精子單倍體胚胎干細胞。類精子單倍體胚胎干細胞兼具二倍體干細胞和單倍體精子的諸多特性，其本質(zhì)仍是胚胎干細胞，因此在形態(tài)、分化、增殖、基因表達圖譜等方面都十分類似于二倍體胚胎干細胞。

類精子單倍體胚胎干細胞在體外可形成擬胚體，并進一步分化為各類型的細胞。向嚴重免疫缺陷小鼠皮下注射類精子單倍體胚胎干細胞后，可產(chǎn)生包含所有胚層的畸胎瘤。把類精子單倍體胚胎干細胞注射到二倍體囊胚中后，可以在12.5 d的胚胎中體細胞和生殖系中檢測到類精子單倍體胚胎干細胞的痕跡［30］。Yang等［20］通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)，類精子單倍體胚胎干細胞表達胚胎干細胞的標志基因如Nanog、Oct4、Sox2和SSEA1，微陣列表達圖譜表明其基因表達模式與小鼠的二倍體胚胎干細胞接近。類精子單倍體胚胎干細胞只有一套父源的遺傳物質(zhì)，它的性染色體是X染色體，通過卵胞質(zhì)內(nèi)單細胞注射技術(shù)，將類精子單倍體胚胎干細胞注射進卵母細胞，可以使之受精并發(fā)育，產(chǎn)生后代全為雌性的半克隆小鼠。類精子單倍體胚胎干細胞和孤雌單倍體細胞相近，通過定期的流式細胞分選富集單倍體［13，20，30］，可以在體外長期傳代培養(yǎng)并保持單倍體性。上述這些特性使得類精子單倍體胚胎干細胞支持多輪的基因編輯，進而獲得攜帶多基因編輯的小鼠（圖1）。

圖1類精子單倍體胚胎干細胞上的遺傳修飾可以一步傳遞至子代小鼠中Figure 1 Genetic modification of sperm-like haploid embryonic stem cells can be transmitted to offspring mice in one step

3 基因修飾小鼠模型的發(fā)展歷史

基因修飾小鼠模型一直是科學界廣泛使用的動物模型之一。1974年Jaenisch等［38］將猴空泡病毒40（SV40）DNA注射到小鼠囊胚腔內(nèi)，這些囊胚大約有40%可以正常發(fā)育且在1歲時也未檢測到腫瘤；用從這些動物的不同器官中提取的DNA進行SV40特異性DNA序列檢測，結(jié)果顯示大約40%的成年小鼠的器官中檢測到了SV40表達。1976年Jaenisch［39］又用小鼠白血病病毒（M-MuLV）感染剛出生的小鼠和植入前的小鼠胚胎（4～8細胞時期），兩種小鼠均出現(xiàn)病毒誘導的白血病。與新生小鼠感染不同，著床前胚胎的感染可導致病毒整合到生殖系中并傳遞給下一代。1980年Gordon等［40］報告，將基因序列注射到小鼠胚胎的原核中，當胚胎被移植到代孕母鼠體內(nèi)并發(fā)育到期時，可以成功地將目的基因序列保留在小鼠基因組中。1981年Evans等［41］成功地建立了小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cells）的體外培養(yǎng)技術(shù)。1985年，Smithies等［42］在哺乳動物細胞中通過同源重組完成對特定人類基因的修飾，而又不影響基因組的其他部分。

胚胎干細胞的體外培養(yǎng)和同源重組技術(shù)的出現(xiàn)是偉大的突破，由于可以精確地操縱小鼠基因組，進而可以創(chuàng)建人類疾病的動物模型，因此在過去的50年里推動生物學研究取得了長足的進步［43］。1987年Thomas等［44］首次報告，通過體外同源重組成功突變了小鼠胚胎干細胞的內(nèi)源性次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT）基因。1993年Gu等［45］首次應用Cre/LoxP系統(tǒng)，獲得了一個刪除IgH位點的JH-Eμ片段小鼠品系JHT。2009年Geurts等［46］將編碼ZFNs的DNA或mRNA單次注射到單細胞大鼠胚胎中，導致靶基因位點發(fā)生25%～100%的破壞，并且這些突變可以有效地傳遞給后代。2010年Meyer等［47］通過ZFN介導小鼠受精卵的同源重組。2012年Doudna團隊與Charpentier團隊合作，創(chuàng)造性地將CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于基因組的定向編輯［48］。2013年Zhang帶領(lǐng)的團隊首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人和小鼠細胞的內(nèi)源性基因組位點上實現(xiàn)了精確編輯［49］。2015年Zhong等［31］將CRISPR/Cas9技術(shù)與類精子單倍體胚胎干細胞相結(jié)合，通過簡單的步驟可以穩(wěn)定高效地批量獲得基因修飾的半克隆小鼠，實現(xiàn)了個體水平的基因篩選。

4 構(gòu)建基因修飾小鼠的胚胎操作技術(shù)

構(gòu)建小鼠疾病模型主要包含兩部分：基因組的編輯和胚胎的操作、培養(yǎng)?；蚪M編輯的方法主要有同源重組、病毒、轉(zhuǎn)座子、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等。在體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，外源DNA片段和染色體基因之間如果序列存在相似性，便會發(fā)生同源重組，只是這種重組的頻率非常低［42］。病毒介導的基因組修飾是隨機的，常用的可整合到基因組上的病毒有慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。隨機插入存在破壞正常基因功能的可能，需要在鑒定時加以注意。PiggyBac轉(zhuǎn)座酶通過剪切/粘貼機制介導基因的轉(zhuǎn)移［50］。轉(zhuǎn)座過程不依賴DNA復制，具有較高的插入效率。PiggyBac轉(zhuǎn)座插入的位點同樣不是固定的，存在破壞正常基因功能的可能，需在鑒定時加以注意。

ZFN與TALEN都是一類人工合成的限制性內(nèi)切酶，由DNA結(jié)合域與限制性內(nèi)切酶的DNA切割域融合而成，ZFN與TALEN發(fā)生的基因編輯一般是位點特異的。Cas9是一種由向?qū)NA（guide RNA，gRNA）引導，能夠使DNA發(fā)生雙鏈斷裂的核酸內(nèi)切酶。Cas9對基因組的切割依賴于與目的序列配對的gRNA序列以及序列附近的PAM（NGG）位點。CRISPR/Cas特異性編輯所依賴的gRNA的設(shè)計和合成難度也遠遠小于TALEN和ZFN技術(shù)的DNA識別模塊的構(gòu)建過程。所以，CRISPR/Cas技術(shù)是目前實現(xiàn)基因組精確編輯的最常用手段［48］。

除了上述能對基因組進行修飾的分子生物學技術(shù)外，仍然需要借助胚胎操作技術(shù)將遺傳修飾體現(xiàn)在個體水平上，才能在真正意義上建立可用于研究的基因修飾小鼠模型。目前，廣泛利用原核注射、卵胞質(zhì)內(nèi)注射、基于胚胎干細胞的囊胚注射、四倍體補償這4種方法來構(gòu)建小鼠模型。

原核注射是第一個被證明可有效產(chǎn)生基因整合小鼠的技術(shù)［40］。它將外源DNA通過顯微注射的方法注射到受精卵的原核內(nèi)，注射的DNA可以整合到小鼠受精卵的基因組中，并穩(wěn)定遺傳給后代。由于DNA都是隨機整合到基因組上，無法預測整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，這就導致每一只原代小鼠有自身獨特的整合位點、整合方式、拷貝數(shù)，需一一進行分析。原核注射也可以結(jié)合PiggyBac系統(tǒng)，從而限定插入局限在基因組的TTAA位點。如果一個原代小鼠的多條染色體發(fā)生轉(zhuǎn)基因的整合，其后代小鼠也可能會產(chǎn)生不同的品系。通常情況下，整合發(fā)生在二細胞時期之前，但是仍有20%～30%的原代小鼠出現(xiàn)基因整合延遲，發(fā)生在二細胞之后，就產(chǎn)生了嵌合體［51］。而且多數(shù)原代小鼠傳遞的轉(zhuǎn)基因頻率較低，僅為5%～10%［51］。如果想實現(xiàn)一只小鼠上有多種基因的轉(zhuǎn)基因整合，就需要將不同的轉(zhuǎn)基因小鼠相互交配。

隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的成熟，直接在卵胞質(zhì)內(nèi)注射體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA和gRNA，或是體外組裝好的Cas9蛋白與gRNA復合物也可以簡單地實現(xiàn)基因編輯［52］，并且卵胞質(zhì)內(nèi)注射會比原核注射的效率更高［53］。Cas9及gRNA進入受精卵后，在特異性的位點產(chǎn)生DNA的雙鏈斷裂，隨后會發(fā)生非同源末端連接修復或同源重組修復，前者會產(chǎn)生隨機的堿基插入或缺失，后者會依照同源的模板將雙鏈斷裂修復。如果在卵胞質(zhì)內(nèi)注射的同時給予帶有同源臂的模板DNA（Donor），細胞就可以利用該模板進行修復，從而實現(xiàn)人為改變指定區(qū)域基因序列的效果。卵胞質(zhì)內(nèi)注射同樣存在一定的延遲，子代小鼠大多存在一定程度的嵌合，將目的基因位點實現(xiàn)了特定編輯的原代小鼠與野生型小鼠交配，可以獲得穩(wěn)定的基因編輯小鼠。由于CRISPR/Cas系統(tǒng)的效率取決于gRNA，因此差異較大，但總體而言仍遠高于原核注射。卵胞質(zhì)內(nèi)注射對RNA純度和濃度的要求較高，否則非常影響胚胎的發(fā)育效率以及基因編輯效率（圖2）。

嵌合體通常指個體的細胞基因組存在不同的現(xiàn)象。1961年，Tarkowski［54］將遺傳上不同的八細胞時期的胚胎的透明帶移去，體外培養(yǎng)時讓它們彼此接觸，再將聚集的胚胎移植到代孕母鼠后，產(chǎn)生了存活的嵌合體后代。1968年，Gardner［55］將胚胎干細胞注射到囊胚腔中也獲得了小鼠嵌合體。嵌合同樣有一定概率發(fā)生在生殖系中，將這種嵌合體小鼠與野生型小鼠交配，可獲得不同基因型的小鼠。這種囊胚注射發(fā)生生殖系傳遞的效率是不穩(wěn)定的，而一種改進的被稱為四倍體補償?shù)募夹g(shù)的出現(xiàn)彌補了這一缺陷。四倍體補償將二細胞時期的胚胎通過電或病毒方式融合，產(chǎn)生四倍體的胚胎，這些四倍體的細胞后續(xù)只能發(fā)育為胚外組織，而無法發(fā)育產(chǎn)生健康胚胎，但如果此時向四倍體囊胚中注射二倍體的胚胎干細胞，會產(chǎn)生完全來源于注射的供體干細胞的健康胚胎。胚胎干細胞有著成熟的培養(yǎng)、編輯系統(tǒng)，注射經(jīng)過基因編輯的胚胎干細胞到四倍體囊胚中，就可以獲得基因組完全來自于注射細胞的小鼠（圖2）。

圖2構(gòu)建基因修飾小鼠模型的胚胎操作方法Figure2 Experimental methodsfor constructing mousemodels

利用類精子單倍體胚胎干細胞構(gòu)建小鼠模型，完全排除了上述方式產(chǎn)生的原代小鼠基因型不確定、存在嵌合、需要回交、多次鑒定等問題。類精子單倍體胚胎干細胞可以使卵母細胞受精形成胚胎，同時可在體外進行培養(yǎng)，也可結(jié)合CRISPR/Cas9系統(tǒng)對類精子單倍體胚胎干細胞進行基因的編輯，這個過程同對二倍體胚胎干細胞進行基因編輯一樣。類精子單倍體胚胎干細胞具有單倍體的特性，每一次的編輯只會產(chǎn)生“是”或“否”的結(jié)果，對編輯后的細胞進行單克隆建系，通過測序就可以判斷基因編輯是否如預期發(fā)生。如果需要獲得多基因同時編輯的細胞，只需要在前一輪得到的細胞系的基礎(chǔ)上再進行一輪編輯即可。由于所有的鑒定都是在細胞層面上完成，鑒定的時間成本較低，建成攜帶指定基因型的類精子單倍體胚胎干細胞系，注射后產(chǎn)生的原代小鼠的基因型均為編輯且雜合的，不存在嵌合情況，可以直接在原代小鼠中開展研究，并能夠穩(wěn)定地傳遞給下一代（圖2）。

基于類精子單倍體胚胎干細胞的半克隆技術(shù)相比于原核或卵胞質(zhì)內(nèi)注射、四倍體補償技術(shù)來構(gòu)建復雜的小鼠模型更具優(yōu)勢（表1）。但是由于只攜帶Y染色體的孤雄胚胎無法發(fā)育至囊胚，所以全部的類精子單倍體胚胎干細胞的性染色體都是X染色體，注射到卵母細胞后產(chǎn)生的后代全部是雌性。同時如果編輯的基因本身會影響干細胞的生存、自我更新過程，細胞系就難以建立，也無法得到后代小鼠（表1）。

表1常用于構(gòu)建基因修飾小鼠模型的動物實驗手段優(yōu)劣勢比較Table1 Comparison of advantagesand disadvantagesof different animal experiments for constructing mousemodels

5 類精子單倍體胚胎干細胞構(gòu)建小鼠模型的應用

類精子單倍體胚胎干細胞介導的半克隆技術(shù)中半克隆是指將類精子單倍體胚胎干細胞注射至卵母細胞產(chǎn)生的后代有別于克隆產(chǎn)生的后代，只有一半的遺傳物質(zhì)來源于體外培養(yǎng)的細胞?；谠摷夹g(shù)，科研人員已經(jīng)在多種復雜疾病小鼠模型的構(gòu)建方面取得了突破性進展（圖3）。

人強直性肌營養(yǎng)不良1型（myotonic dystrophy type 1，DM1）是一種復雜的遺傳性疾病，主要由強直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶（dystrophia myotonica protein kinase，DMPK）基因3′非編碼區(qū)的CTG重復擴增引起［56-57］；通常隨著重復數(shù)量的增加而加重表型，最嚴重時可以發(fā)展為呼吸衰竭和智力遲鈍（如先天性DM1，即CDM）［58］。許多研究都表明，CTG的重復擴增不僅影響DMPK本身的表達水平，也會影響DMPK鄰近區(qū)域的染色體結(jié)構(gòu)，從而降低鄰近基因的表達水平［59-60］。攜帶DM1相關(guān)基因Dmpk、Six5和Mbnl1的其中任何一個基因雜合突變的小鼠只能部分重現(xiàn)DM1患者的癥狀［61-63］，而任何一個純合突變的小鼠病情會加重。但在DM1患者中，幾乎不存在Dmpk、Six5和Mbnl1這幾個相關(guān)基因的純合突變。

另外一種DM1的小鼠模型構(gòu)建策略是側(cè)重于重現(xiàn)CTG的重復。如攜帶人骨架肌動蛋白基因HAS的轉(zhuǎn)基因小鼠，其肌肉HAS非編碼區(qū)插入了大約250個CUG重復擴增［64］。這種轉(zhuǎn)基因小鼠在肌肉多個方面出現(xiàn)了和DM1患者一樣的表型，但并沒有出現(xiàn)DM1患者常見的其他癥狀，如肌肉萎縮和白內(nèi)障［64］。DM1患者出現(xiàn)肌肉萎縮、白內(nèi)障、胰島素抵抗、心臟傳導缺陷等多方面的癥狀，很可能是上述多個基因的表達不足導致［65-66］。但限于傳統(tǒng)方法的局限性，難以獲得如此多基因同時敲除的小鼠，多基因表達不足的猜想一直未得到實驗驗證。2019年，Yin等［58］通過將Dmpk、Six5和Mbnl1這3個基因敲除的類精子單倍體胚胎干細胞注射到卵母細胞后，產(chǎn)生的雜合小鼠出現(xiàn)了DM1的部分表型；進一步將Dmpk、Six5、Mbnl1和Dmwd共4個基因敲除的類精子單倍體胚胎干細胞注射到卵母細胞后，產(chǎn)生的雜合小鼠重現(xiàn)了DM1患者的絕大多數(shù)病理狀態(tài)。四基因敲除的雜合小鼠模型直接證明了多基因劑量不足效應確實能夠?qū)е翫M1。

圖3類精子單倍體胚胎干細胞在構(gòu)建疾病模型上的應用Figure 3 Application of sperm-like haploid embryonic stem cells in the construction of disease model

苗勒管異常（Müllerian anomalies，MA）包括子宮、宮頸、輸卵管或陰道的各種解剖學畸形［67-69］。MA女性的生殖能力低下，同時要承受巨大的心理痛苦［70］。關(guān)于MA的病因，遺傳危險因素通常被認為具有很強的影響力。但是由于MA患者個體之間存在廣泛的基因異質(zhì)性，很難確定潛在的致病基因［70］。先前的一些研究提示，基因組拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）參與了MA致?。?0］。2019年，Wang等［70］分析了25例MA患者的全基因組雜交芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中有3例患者和苗勒管發(fā)育有關(guān)的基因Gen1（1/25）、Tbx6（1/25）和Lhx1（1/25）存在基因拷貝數(shù)差異。為了進一步了解這些基因的拷貝數(shù)差異是否會造成苗勒管發(fā)育異常，研究人員對新的100例MA患者的qPCR數(shù)據(jù)檢驗后發(fā)現(xiàn)，其中有6例患者的Tbx6（4/100）和Lhx1（2/100）存在基因拷貝數(shù)差異。但是Gen1基因雜合敲除小鼠并沒有展現(xiàn)出任何苗勒管畸形表型，提示單基因缺陷并不足以導致苗勒管畸形，而很可能是多基因缺陷造成的。研究人員后續(xù)對這9例MA患者進行全基因組測序分析，將目光鎖定到了Gen1/Wnt9b以及Tbx6/Gata3這兩種基因組合。通過分析由類精子單倍體胚胎干細胞一步獲得的Gen1/Wnt9b雙雜合敲除小鼠的子宮發(fā)現(xiàn)，其確實比Gen1或Wnt9b單雜敲除小鼠的子宮發(fā)育畸形程度更嚴重，從而證明Gen1和Wnt9b雙基因缺陷導致了苗勒管畸形的產(chǎn)生［70］。有趣的是，研究人員還確定了4例攜帶Gen1有害突變，但沒有Wnt9b有害突變的個體，這支持Gen1突變對MA致病的遺傳貢獻。由于Gen1中的單個突變不足以引起人或小鼠的MA，其他基因的有害突變可能與Gen1突變協(xié)同作用而引起MA，與MA的高度遺傳異質(zhì)性相符?？傊?，這些結(jié)果均表明Gen1/Wnt9b是MA致病基因中一個重要的組合，并提示Gen1是MA的主要致病因素［70］。

穩(wěn)定表達Cas9的類精子單倍體胚胎干細胞和gRNA文庫結(jié)合會產(chǎn)生一種非常高效便捷的小規(guī)?；蚝Y選系統(tǒng)。每個類精子單倍體胚胎干細胞中轉(zhuǎn)染一種gRNA后，其基因組被穩(wěn)定表達的Cas9切割，實現(xiàn)對應的一個基因的編輯，注射到卵母細胞后又會進一步切割母源基因組，產(chǎn)生純合敲除的小鼠。2019年Bai等［71］通過向卵母細胞注射穩(wěn)定表達Cas9和以72個預選基因為靶標的gRNA文庫的類精子單倍體胚胎干細胞系，建立了一個文庫基因突變的半克隆小鼠庫，并通過對出生小鼠的骨骼分析篩選出了4個與骨骼發(fā)育相關(guān)的基因，其中Zic1和Clec11a已被報告是骨骼發(fā)育所必需的基因，而Rln1和Irx5基因從未有研究表明對骨骼有影響。Rln1純合敲除小鼠僅在出生時骨骼較小，而Irx5純合敲除小鼠由于骨量減少和骨髓脂肪生成增加，在出生后和成年階段均顯示骨骼異常［4，71］。利用類似的策略，2018年Li等［72］結(jié)合CRISPR/Cas9介導的單堿基編輯器發(fā)現(xiàn)了小鼠原始生殖細胞（primordial germ cells，PGC）發(fā)育的重要基因Dnd1上有4個與PGC發(fā)育相關(guān)的氨基酸。這種對蛋白質(zhì)關(guān)鍵氨基酸進行體內(nèi)遺傳篩選的系統(tǒng)，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究開辟了一個新的體系［4］。該體系的一個潛在應用是在小鼠中篩選與疾病發(fā)展相關(guān)基因的功能位點，并與已有的SNVs數(shù)據(jù)庫進行比對，以預測疾病相關(guān)基因的致病位點［73］。

上述研究為人和小鼠中多基因致病理論提供了實驗證據(jù)，證明利用類精子單倍體胚胎干細胞介導的半克隆技術(shù)作為一種快速有效的實驗檢測手段，可用于鑒定復雜疾病的小鼠模型中遺傳變異的致病性組合。

6 類精子單倍體胚胎干細胞技術(shù)構(gòu)建小鼠模型的展望

人類遺傳學在研究方法和概念上的進步加快了對人類致病基因的鑒定過程。當某種疾病涉及一個以上基因時，準確判斷各致病基因突變的貢獻率及其組合形式至關(guān)重要。越來越多疾病的遺傳和突變數(shù)據(jù)也逐漸闡明了多個基因（包括等位基因）聯(lián)合作用如何產(chǎn)生表型效應［74］。生物學、醫(yī)學、進化學對于疾病的定義各不相同，但是毋庸置疑的是，環(huán)境、文化、人口等外在因素和遺傳內(nèi)在因素交錯在一起導致了疾病的復雜性以及人類群體在各種簡單或者復雜疾病發(fā)生率上的差異。復雜性狀疾病（complex disease）的發(fā)病由多個基因位點共同參與，且與環(huán)境因素相互作用決定疾病表型，往往是遺傳疾病，如心血管疾病、腫瘤性疾病、自身免疫病等［75］。而且在遺傳疾病中，如果涉及染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)量異常，也會增加該遺傳疾病的復雜性?；陬惥訂伪扼w胚胎干細胞介導的半克隆技術(shù)可以獲得多基因突變的小鼠，可以較優(yōu)地模擬涉及多基因、染色體異常（非整倍體）這類復雜的疾病，從而發(fā)揮其對高風險人群的預測、篩查及干預作用，為復雜性狀疾病提供更準確的診斷、預后工具。

以神經(jīng)退行性疾病肌萎縮側(cè)索硬化征為例，肌萎縮側(cè)索硬化征（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）即Lou Gehrig′s disease病，是一種成人發(fā)病且致命的罕見神經(jīng)退行性疾病［76］。ALS以進行性肌肉無力、肌肉萎縮和最終癱瘓為特征，診斷后患者生存期從2年到5年不等，僅有10%的ALS患者可以存活10年以上［77］。ALS實際上和許多成人發(fā)病的神經(jīng)退行性疾病共享許多臨床和病理學特征，如額顳葉癡呆（frontotemporal dementia，F(xiàn)TD）。在許多患者中，也會觀察到ALS和FTD的共同存在；其中約15%的FTD患者會發(fā)展為ALS，5%～22%的ALS患者發(fā)展為FTD［78］。目前公認的ALS發(fā)病機制主要有以下方面：RNA穩(wěn)定性改變、代謝失調(diào)、運動神經(jīng)元細胞骨架破壞［79］、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失調(diào)、線粒體結(jié)構(gòu)或功能受損、谷氨酸介導的興奮性毒性、膠質(zhì)細胞喪失功能、免疫功能失調(diào)及代謝障礙。自1993年報告第一個ALS相關(guān)基因SOD1后［80］，迄今為止已發(fā)現(xiàn)超過50個基因在其突變的情況下可能引起ALS［81］，只是這些基因?qū)LS的貢獻程度有大有小，而且這些基因存在相同或截然不同的功能，這給早期臨床診斷帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

C9ORF72、SOD1、TDP-43、TBK1、OPTN等基因只能解釋不到50%的ALS/FTD患者發(fā)病原因［81］。而且很多時候某個基因的突變不會影響ALS/FTD進展，或者即使影響ALS/FTD的發(fā)生，但不顯著改變生存時間；甚至某些基因突變反而可以減緩ALS的癥狀。Gerbino等［82］研究表明，小鼠表達人的喪失功能、無義突變的TBK1時，并不會出現(xiàn)和神經(jīng)退行有關(guān)的癥狀；但是如果在SOD1G93A這樣經(jīng)典的ALS小鼠中特異性敲除TBK1后，會削弱自噬，增加SOD1聚集，加速疾病進展，但不改變生存時間。更令人困惑的是，TBK1上的點突變同樣可以加速疾病的發(fā)生，但可以延長生存時間。

遺傳異質(zhì)性、多基因共同效應、每個基因存在不同的突變點、基因功能的交叉性、神經(jīng)元與周圍的膠質(zhì)細胞共同作用等多方面因素，使得ALS/FTD的深入研究及臨床診治進展緩慢，既缺乏ALS發(fā)病早期確診的遺傳學證據(jù)，也缺乏有效的治療藥物。目前被FDA批準上市的只有2種藥物（利魯唑和依達拉奉），既不能治愈ALS/FTD，也不適用于所有的ALS/FTD患者，且藥物對于中位生存時間的增加效果相當有限，其中一個重大的障礙是缺乏研究ALS的小鼠模型。

1994年Gurney等［83］通過轉(zhuǎn)基因使得小鼠中高表達含有G93A點突變的人SOD1蛋白的突變體，這些小鼠脊髓中運動神經(jīng)元喪失導致一條或多條肢體癱瘓，并在5～6個月齡時死亡。SOD1G93A小鼠模型確實重現(xiàn)了ALS的一些指征，如突變的SOD1蛋白異常聚集［84］，星形膠質(zhì)細胞中EAAT2谷氨酸轉(zhuǎn)運體的喪失導致運動神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性死亡［85］。米諾環(huán)素（minocycline）、頭孢曲松（ceftriaxone）、塞來昔布（celecoxib）、來那度胺（lenalidomide）和其他抗炎藥物在SOD1G93A小鼠中被證明有療效，但在臨床試驗中全部失?。?6］。其中一個關(guān)鍵點在于，ALS患者存在實質(zhì)性的皮質(zhì)運動神經(jīng)元退行性變，但是在大多數(shù)SOD1G93A小鼠模型中并沒有明確地看到實質(zhì)性的皮質(zhì)運動神經(jīng)元退行性變［87］。而且高達50%的ALS患者會共同發(fā)展為FTD，而在SOD1G93A小鼠模型中未發(fā)現(xiàn)［87］。

除了SOD1G93A小鼠模型外，TDP-43小鼠模型也常被用來研究ALS。但無論是SOD1還是TDP-43，單一基因缺陷的小鼠模型都無法完全模擬ALS患者的典型病癥。如果采用類精子單倍體胚胎干細胞技術(shù)，先在細胞水平上獲得多個致病基因同時修飾的突變系，除了可以進行神經(jīng)元的定向分化以檢測其對神經(jīng)元細胞功能的影響外，還可以通過半克隆技術(shù)注射后獲得雜合突變的小鼠，有望更好地在小鼠上模擬出ALS癥狀。

除了多基因有關(guān)的復雜疾病外，基于類精子單倍體胚胎干細胞獲得的半克隆小鼠也非常適合應用于染色體數(shù)目變化相關(guān)疾病的研究。人類胚胎早期致死、流產(chǎn)或出生后發(fā)育缺陷的一個重要原因是染色體數(shù)目的異常，其中三體是染色體數(shù)目變異的一種最普遍的形式［88］。臨床上公認的35%的自然流產(chǎn)和4%的死產(chǎn)是由于染色體三體或單體造成，約有0.3%的新生兒為非整倍染色體組［89］。

獲得非整倍性染色體組小鼠模型，研究其發(fā)育過程是相當復雜的。1983年Gropp等［90］通過育種獲得了多種常染色體三體的小鼠胚胎，其中許多三體的胚胎都無法存活到器官發(fā)生階段；將存活時間較長、三體胚胎來源的造血干細胞移植到輻射損傷的小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，不同三體胚胎來源的造血干細胞對造血系統(tǒng)受損小鼠的生存支持能力差異巨大，其中19號染色體三體胚胎來源的造血干細胞對受損小鼠的支持最好，可以支撐小鼠存活12個月。2004年Baker等［91］發(fā)現(xiàn)紡錘體組裝檢查點蛋白BubR1水平較低的小鼠表現(xiàn)為漸進性非整倍體化，并伴隨著壽命短、急腹癥、矮小、跛行、白內(nèi)障、皮下脂肪丟失和傷口愈合受損等多種特征。2008年Lavon等［92］從非整倍體胚胎中獲得整倍體人類胚胎干細胞，闡明了整倍體和非整倍體嵌合體胚胎發(fā)育過程中，由于整倍體具有競爭優(yōu)勢，因此隨著發(fā)育進行，非整倍體細胞逐漸消失。2016年Bolton等［93］通過活胚胎成像和嵌合胚胎的單細胞追蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)從囊胚開始，非整倍體細胞逐漸減少；而且通過非整倍體和整倍體嵌合實驗證明，一定比例的整倍體細胞即可支持胚胎發(fā)育。染色體三體小鼠模型中，較常見的一種是Ts16小鼠。小鼠第16號染色體的遠端部分和人類第21號染色體的長臂之間存在同源性，所以Ts16小鼠常被應用于研究人類三體綜合征。Ts16小鼠胎兒具有許多相似的表型特征，包括心臟缺陷和鼻肉瘤，只是Ts16小鼠胎兒會在子宮內(nèi)死亡，使得Ts16小鼠的研究僅限于早期發(fā)育階段［94］。后續(xù)Davisson等［94］構(gòu)建了Ts65Dn小鼠模型，Ts65Dn小鼠能存活至36個月，與人類第21號染色體長臂具有廣泛的同源性。但Ts65Dn小鼠模型只包含了人類第21號染色體長臂的絕大部分，而長臂的少部分以及短臂都被排除在外。如果通過類精子單倍體胚胎干細胞技術(shù)，在細胞水平上先構(gòu)建染色體數(shù)目差異的細胞系，再將其注射進卵母細胞中獲得胚胎，可排除常規(guī)技術(shù)嵌合率低的問題，能更方便地得到非正常倍性的小鼠模型資源，有助于闡明發(fā)生非整倍性現(xiàn)象背后的原因。

綜上，基因修飾小鼠模型的使用讓闡明疾病發(fā)生機制和進行新藥臨床前試驗更為直觀、簡便。目前使用傳統(tǒng)技術(shù)手段如原核注射、卵胞質(zhì)內(nèi)注射、基于胚胎干細胞的囊胚注射或四倍體補償獲得的小鼠模型只是部分模擬了人類疾病的一些基因突變，尚不能完全概括人類疾病的生理和病理機制。要想解決這些問題，需要建立一個可以最大程度上模擬患者復雜體系及相關(guān)復雜機制的人源化或類人化小鼠模型［95］，這需要科學界的共同合作。例如，可以結(jié)合臨床上患者的病理、家系、相關(guān)基因突變等信息，利用類精子單倍體胚胎干細胞獲得和患者攜帶基因突變一致或相關(guān)基因人源化的小鼠模型。這些小鼠的疾病癥狀和嚴重程度可以更好地反映某些基因?qū)膊〉呢暙I，以實現(xiàn)生物醫(yī)學研究的最終目標：更深入地了解人類疾病的致病機制，進而開發(fā)出新的診斷方法和改進療法。類精子單倍體胚胎干細胞技術(shù)的出現(xiàn)為構(gòu)建精確可控、多基因、復雜編輯的小鼠模型提供了一種全新的有力工具。