不同燕麥品種抗氧化系統(tǒng)對(duì)稈銹病菌侵染的響應(yīng)

韓宇婷，陳曉晶，徐忠山，劉景輝，2，薛國(guó)興

燕麥?zhǔn)侵匾募Z飼兼用作物之一，我國(guó)種植面積約70 萬(wàn)hm2[1]，其中裸燕麥種植面積約55 萬(wàn)hm2，居世界首位[2-3]。燕麥具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄等特性[4]。燕麥籽粒中富含β-葡聚糖、亞油酸，相比小麥和玉米擁有更大的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，并在防治糖尿病和心腦血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。

燕麥稈銹?。≒uccinia graminis f.sp.avenae）是燕麥生產(chǎn)中面臨的主要病害之一，近年來(lái)，主要在北美[5]、加拿大西部[6]、中國(guó)吉林白城和河北張家口[7]等地區(qū)發(fā)病，造成不同程度的減產(chǎn)。燕麥稈銹病病斑主要生長(zhǎng)在葉片上，發(fā)病初期夏孢子為圓形暗紅色小點(diǎn)，后期燕麥近枯黃時(shí)，在夏孢子堆的基礎(chǔ)上產(chǎn)生黑色的冬孢子[8]。植株感病會(huì)造成千粒重降低、面粉色黑不筋、莖稈易折、飼草質(zhì)量下降等問(wèn)題[9]。近年來(lái)，我國(guó)加大對(duì)農(nóng)業(yè)、草牧業(yè)、生態(tài)等方面的建設(shè)力度，燕麥作為糧飼兼用作物種植面積不斷擴(kuò)大，但是，全球氣候變暖使燕麥稈銹病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[10]。病原菌入侵后會(huì)引起植物體內(nèi)的一系列防御反應(yīng)，活性氧反應(yīng)是其中的一種，對(duì)植物的抗病性具有重要的作用[11]?；钚匝醢ǔ蹶庪x子自由基（·O2-）、羥基自由基（·OH）、單線氧（1O2）和過(guò)氧化氫（H2O2）?；钚匝踉谥参矬w代謝過(guò)程中的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[12]?；钚匝醯淖饔糜袃蓚€(gè)方面，一是作為信號(hào)分子引起植物的抗病反應(yīng)，二是活性氧含量過(guò)多會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能[13]。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）都具有清除活性氧的作用[14]。過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）使植物體內(nèi)過(guò)量的H2O2分解為H2O 和O2；超氧化物歧化酶（SOD）能清除多余的·O2-，維持植物體內(nèi)活性氧平衡，提高植物抗性[15]；苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙氨酸途徑中重要的酶，是參與植物抗病過(guò)程中酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶[16]。但是不同的病原菌與寄主，活性氧的產(chǎn)生機(jī)制不同，清除活性氧的酶活性高低也大不相同[17]。

有研究表明，條銹病菌侵染小麥感病品種后在侵染早期快速產(chǎn)生H2O2和·O2-，但在抗病品種早期侵染點(diǎn)未檢測(cè)到·O2-和H2O2的積累[18]。但苜蓿莖點(diǎn)霉侵染苜蓿后抗性品種能快速、大量產(chǎn)生H2O2[19]。樊秦[20]研究表明，在病原菌侵染初期H2O2少量增加，隨著侵染程度不斷加深，H2O2含量過(guò)度積累，對(duì)植物造成傷害，病原菌易入侵?？菸【秩痉押螅剐云贩N能快速大量產(chǎn)生活性氧并提高POD 活性[21]。棉花接種黃萎病菌后，SOD、POD 活性均呈上升趨勢(shì)，且抗病品種增幅大于感病品種[22]。鑒于不同的病原菌與宿主體系變化規(guī)律不同，本試驗(yàn)通過(guò)研究不同抗性品種燕麥接種稈銹病菌后各器官活性氧變化及防御酶活性變化，探討燕麥響應(yīng)稈銹病侵染的生理機(jī)制，為燕麥抗稈銹病研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試燕麥品種為高感稈銹病品種壩莜1 號(hào)（張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供）、蒙燕1 號(hào)（張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供）和抗病品種壩莜18 號(hào)（張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供）、白燕5 號(hào)（吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供）[23]。稈銹菌孢子樣本于2019年9月在張家口壩上燕麥生產(chǎn)田采集獲得，將取回的燕麥完全陰干后用塑封袋包好，放入冰箱4 ℃保存。參照黃振濤等[24]方法分離擴(kuò)繁。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年6—9月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)燕麥產(chǎn)業(yè)研究中心溫室進(jìn)行。挑選大小一致的燕麥種子，3%的次氯酸鈉消毒后擺放至發(fā)芽盒內(nèi)，萌發(fā)后移至裝有1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的聚乙烯盆中培養(yǎng)[25]。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)一葉一心時(shí)，將新鮮燕麥稈銹病夏孢子6×1010個(gè)懸浮液用毛筆均勻接種在燕麥葉片上，對(duì)照涂抹蒸餾水（CK）。接菌后的幼苗和CK 置18～22 ℃黑暗保濕箱內(nèi)保濕24 h，之后取出在18～25 ℃、光照16 h、濕度60%～80%的溫室中隔離培養(yǎng)，分別在接菌后1、3、5、7、9 d 取樣。每個(gè)處理每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選擇5株不同燕麥植株。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 活性氧含量 過(guò)氧化氫（H2O2）含量測(cè)定：參照SERGIEV 等[26]的方法，接種稈銹病菌后在1、3、5、7、9 d 分別取樣，稱取新鮮葉片0.5 g，5 mL 0.1%的三氯乙酸冰浴研磨，在12 000 r/min，4 ℃下離心20 min，取1 mL 上清液分別加入1 mL 0.1 mol/L pH值7.0 的磷酸緩沖液和2 mL 1 mol/L 的KI 溶液，搖勻，放置20 min 后，用分光光度計(jì)在390 nm 處測(cè)OD值。超氧陰離子自由基（·O2-）采用羥胺氧化法測(cè)定[27]。

1.3.2 防御酶系統(tǒng) 超氧化物歧化酶（SOD）活性：采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定[28]。過(guò)氧化物酶（POD）活性：采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[29]。過(guò)氧化氫酶（CAT）活性：采用過(guò)氧化氫法測(cè)定[30]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性：在接種病原菌后1、3、5、7、9 d 分別取樣，稱取新鮮葉片0.2 g，用pH 值8.8 的硼酸緩沖液加PVP 冰浴中研磨成勻漿，然后移入10 mL 容量瓶中定容，4 ℃條件下，4 000 r/min 離心30 min，取上清液即為粗提酶液。取1 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸，2 mL pH 值8.8 的硼酸緩沖液，0.2 mL 酶液，以緩沖液代替酶液為對(duì)照，搖勻后立即在752B 型分光光度計(jì)290 nm 處測(cè)定起始OD 值，將第1 次測(cè)定后的各支試管在30 ℃恒溫水浴鍋中保溫，30 min 后分別測(cè)定OD 值，兩次值的差值即為反應(yīng)液的酶活性[31]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行整理繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片H2O2 含量的影響

接種稈銹病菌后，感、抗病燕麥品種葉片H2O2含量呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)（圖1）。感病品種壩莜1 號(hào)、蒙燕1 號(hào)在接菌后葉片H2O2含量整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。接菌后5 d 達(dá)到最大值，較CK分別顯著升高92.8%、155.5%（P＜0.05）。抗病品種壩莜18 號(hào)、白燕5 號(hào)在接菌后1、5 d 葉片H2O2含量出現(xiàn)峰值。抗病品種壩莜18 號(hào)在接菌后1、5 d 葉片H2O2含量較CK 顯著升高32.3%、99.1%（P＜0.05），抗病品種白燕5 號(hào)在接菌后1、5 d 葉片H2O2含量較CK 顯著升高34.6%、113.6%（P＜0.05）。接菌后抗病品種比感病品種積累更多的H2O2。

圖1 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片H2O2 含量的影響

2.2 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片·O2-含量的影響

接種稈銹病菌后，感、抗病燕麥品種葉片·O2-含量均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（圖2）。與CK 相比，感病品種壩莜1 號(hào)、蒙燕1 號(hào)葉片中·O2-含量較CK 平均增幅75.3%、42.7%，抗病品種壩莜18 號(hào)、白燕5 號(hào)葉片中·O2-含量較CK 平均增幅43.9%、40.2%。感病品種壩莜1 號(hào)、蒙燕1 號(hào)上升幅度大于抗病品種壩莜18 號(hào)、白燕5 號(hào)。

圖2 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片·O2-含量的影響

2.3 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片SOD 活性的影響

稈銹病菌侵染燕麥后，感、抗病品種SOD 活性在3、9 d 出現(xiàn)兩個(gè)峰值（圖3）。感病品種壩莜1 號(hào)、蒙燕1 號(hào)在接菌后3 d 分別較CK 顯著升高22.2%、63.2%（P＜0.05），抗病品種壩莜18 號(hào)、白燕5 號(hào)在接菌后3 d 分別較CK 顯著升高50.0%、48.0%（P＜0.05）。接菌后9 d 感病品種壩莜1 號(hào)、蒙燕1 號(hào)SOD 活性相較CK 增加53.1%、47.5%，抗病品種壩莜18 號(hào)、白燕5 號(hào)SOD 活性相較CK 增加73.8%、79.2%。接菌后抗病燕麥品種SOD 活性增幅大于感病燕麥品種。

圖3 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片SOD 活性的影響

2.4 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片POD 活性的影響

稈銹病菌侵染燕麥后，葉片POD 活性均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)（圖4）。接菌后1、3、5、7、9 d，感病品種壩莜1 號(hào)葉片POD 活性較CK 增加10.8%、14.5%、34.3%、52.4%、39.4%，蒙燕1 號(hào)葉片POD 活性較CK 增加17.4%、28.4%、35.8%、32.1%、34.3%；接菌后1、3、5、7、9 d，抗病品種壩莜18 號(hào)葉片POD活性較CK 增加14.7%、31.0%、50.7%、51.4%、92.1%，白燕5 號(hào)葉片POD 活性較CK 增加4.1%、0.9%、19.1%、29.7%、69.0%。

圖4 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片POD 活性的影響

2.5 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片CAT 活性的影響

稈銹病菌侵染燕麥后，4 個(gè)燕麥品種葉片CAT活性呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)（圖5）。接菌后1、3 d，感病品種壩莜1 號(hào)、蒙燕1 號(hào)葉片CAT 活性較CK 分別顯著上升19.0%～39.2%、14.7%～46.5%（P＜0.05）；接菌后5 d，蒙燕1 號(hào)葉片CAT 活性與CK 相比顯著下降19.9%（P＜0.05）；接菌后7、9 d，壩莜1 號(hào)、蒙燕1 號(hào)葉片CAT 活性與CK 相比分別上升24.8%～30.7%、20.4%～30.0%，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。接菌后抗病品種壩莜18 號(hào)、白燕5 號(hào)葉片CAT 活性先降低再升高。接菌后1、3 d，壩莜18 號(hào)、白燕5號(hào)較CK 葉片中的CAT 活性分別降低11.0%～12.2%、28.0%～31.9%；接菌后5、7、9 d，壩莜18 號(hào)、白燕5 號(hào)葉片CAT 活性較CK 上升27.6%～55.8%，37.2%～48.3%。

圖5 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片CAT 活性的影響

2.6 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片PAL 活性的影響

稈銹病菌侵染燕麥后，葉片PAL 活性呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)（圖6）。接菌后1、3、5、7、9 d，感病品種壩莜1 號(hào)葉片PAL 活性較CK 增加6.7%、17.8%、10.7%、29.3%、28.1%，而蒙燕1 號(hào)葉片PAL 活性較CK 增加11.1%、21.3%、30.5%、27.0%、27.0%。接菌后1、3、5、7、9 d 抗病品種壩莜18 號(hào)葉片PAL 活性較CK 增加31.8%、21.8%、25.2%、34.6%、28.8%，白燕5 號(hào)葉片PAL 活性較CK 增加9.0%、23.4%、24.2%、33.3%、37.9%。

圖6 稈銹病菌侵染對(duì)燕麥葉片PAL 活性的影響

3 討論

植物體內(nèi)的活性氧一直處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)外界病原菌侵染時(shí)，會(huì)打破細(xì)胞內(nèi)的活性氧產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡[32]。抗氧化酶CAT 和SOD 一起參與H2O2的代謝，在植物抗病中發(fā)揮重要作用[33]。番茄通過(guò)增大活性氧在寄主體內(nèi)的積累，導(dǎo)致SOD活性增加，增強(qiáng)番茄的抗性[34]。張麗等[35]研究指出，病原菌侵染苜蓿后抗病品種通過(guò)提高過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，增強(qiáng)植物的抗病性。

本研究表明，接種稈銹病菌后對(duì)燕麥葉片活性氧的平衡造成了很大影響。稈銹病菌侵染前期壩莜1 號(hào)、蒙燕1 號(hào)葉片中SOD 活性、CAT 活性上升，使植物體內(nèi)產(chǎn)生的·O2-被歧化H2O2，H2O2被CAT 降解為H2O 和O2，因此，在稈銹病侵染前期壩莜1 號(hào)、蒙燕1 號(hào)葉片活性氧積累較少；之后葉片SOD 活性、CAT 活性下降，使植物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2、·O2-被大量積累。壩莜18 號(hào)、白燕5 號(hào)在接種稈銹病后前期葉片SOD 活性上升、CAT 活性下降，導(dǎo)致H2O2在葉片中被積累，猜測(cè)H2O2可能作為植物的抗病信號(hào)，引發(fā)植物的防御反應(yīng)[36-37]。這與小麥洛夫林13 接種不同致病力的條銹病菌后植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)[38]和苜蓿抵抗苜蓿莖點(diǎn)霉的早期機(jī)制[12]研究結(jié)果一致。在接菌7 d 壩莜1 號(hào)、蒙燕1 號(hào)、壩莜18 號(hào)、白燕5 號(hào)葉片中SOD、CAT 活性與CK 相比均上升。此時(shí)酶活性上升可能是由于底物ROS 濃度增加誘導(dǎo)了酶活性的增加[39]。

4 結(jié)論

稈銹病菌侵染后導(dǎo)致燕麥葉片活性氧含量均有所上升，抗病燕麥品種葉片中H2O2含量分別在接菌1、5 d 出現(xiàn)兩個(gè)高峰，感病燕麥品種葉片在接菌5 d達(dá)到最大值；接菌后感、抗病燕麥品種葉片·O2-含量均呈上升趨勢(shì)，抗病燕麥品種活性氧含量增幅整體大于感病燕麥品種。接菌后感、抗病燕麥品種葉片中SOD、POD、PAL、CAT 活性上升，且抗病燕麥品種增幅大于感病燕麥品種，說(shuō)明抗病燕麥品種通過(guò)快速產(chǎn)生活性氧，促使燕麥較早產(chǎn)生防御反應(yīng)，抵抗外界病原菌入侵。