微生物資源分子鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展

張羽，馬愛(ài)進(jìn)，高利芬，彭海，賈英民，孫寶國(guó)

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048；2.江漢大學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究院，武漢 430056）

一、前言

微生物無(wú)處不在，與人類的生存、生產(chǎn)和生活息息相關(guān)。微生物用途廣泛，可用于生產(chǎn)如奶酪、酒、酸奶、面包、饅頭等食品，也可用于凈化水源、吸附重金屬等領(lǐng)域，人體內(nèi)的腸道微生物可助力食物的降解和吸收。微生物的存在鏈接了自然秩序和人類生活的方方面面，微生物與人類健康密切相關(guān)，多數(shù)微生物是無(wú)害的，能與寄主和平共存。微生物中對(duì)人、動(dòng)物、植物產(chǎn)生危害或致病的一類微生物，統(tǒng)稱為病原微生物。病原微生物會(huì)引發(fā)寄主感染、過(guò)敏、腫瘤、癡呆甚至死亡，也是危害食品安全的主要因素之一。近年來(lái)出現(xiàn)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染、新型冠狀病毒肺炎等疾病傳染性強(qiáng)、對(duì)人體危害極大，為保障人類身體健康、食品安全和糧食安全，需要對(duì)醫(yī)學(xué)、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域中的微生物進(jìn)行快速、精準(zhǔn)、靈敏的檢測(cè)以及準(zhǔn)確的分型。傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)包括菌落形態(tài)、生理生化指標(biāo)、血清型檢測(cè)等常見(jiàn)致病菌檢驗(yàn)流程，具有技術(shù)成熟、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是目前食品衛(wèi)生監(jiān)管機(jī)構(gòu)采用的主流檢測(cè)方法；然而實(shí)驗(yàn)操作時(shí)存在步驟繁瑣、耗時(shí)、靈敏度低等問(wèn)題，致使得出的檢測(cè)結(jié)果缺乏充分的說(shuō)服力。

隨著醫(yī)學(xué)微生物學(xué)研究技術(shù)和交叉學(xué)科的發(fā)展，新的微生物檢測(cè)技術(shù)不斷出現(xiàn)，克服了傳統(tǒng)方法在檢測(cè)和鑒定微生物方面的一個(gè)或多個(gè)局限性。目前，新的微生物檢測(cè)技術(shù)已深入到分子水平、基因水平的檢測(cè)，包括核酸雜交技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、脫氧核糖核酸（DNA）指紋圖譜技術(shù)、基因芯片技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)等。隨著技術(shù)及自動(dòng)化設(shè)備的發(fā)展，顯著提升了微生物檢測(cè)的快速性、敏感性、特異性和適用性。同時(shí)，也應(yīng)看到，每種微生物檢測(cè)方法都有其自身的優(yōu)點(diǎn)以及在耗時(shí)、靈敏度、穩(wěn)定性、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等方面存在一個(gè)方面或多個(gè)方面的局限性。針對(duì)于此，本文著重梳理微生物資源分子鑒定方法的發(fā)展進(jìn)展和應(yīng)用態(tài)勢(shì)，分析存在的問(wèn)題，提出我國(guó)微生物資源分子鑒定方法的發(fā)展建議，以期為相關(guān)研發(fā)布局和管理政策研究提供基礎(chǔ)性參考。

二、微生物資源分子鑒定方法概述

微生物的群體特性對(duì)微生物檢測(cè)技術(shù)提出了挑戰(zhàn)，不僅要能檢測(cè)出微生物，還要檢測(cè)出微生物的變異情況，及時(shí)對(duì)微生物進(jìn)行分型。微生物資源的分子鑒定是指利用微生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中保留下來(lái)的保守基因組序列及其細(xì)微變化與規(guī)律，進(jìn)而對(duì)自然界中微生物資源的生物學(xué)進(jìn)化多樣性進(jìn)行分類和定位 [1]。分子鑒定已成為微生物資源鑒定中必備的分類信息，同時(shí)也是進(jìn)行微生物資源快捷鑒定的重要方法。常見(jiàn)的分子鑒定技術(shù)包括以下幾種技術(shù)。

（一）DNA含量測(cè)定

遺傳物質(zhì)DNA的特異性是由常見(jiàn)的4種堿基腺嘌呤（A）、鳥(niǎo)嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）的排列和含量所決定的。不同生物的DNA含量測(cè)定通常用DNA中（G+C）的含量摩爾分?jǐn)?shù)值表示 [2]，因其具有種特異性且不受菌齡及外界因素影響，成為細(xì)菌分類和菌種鑒定的重要指標(biāo)。不同微生物DNA的（G+C）含量變化范圍比較廣，但同種微生物的（G+C）含量?jī)H在3%~5%區(qū)間波動(dòng)。因此，DNA含量測(cè)定法通常用于快速確定微生物所屬種群。親緣關(guān)系密切或表型高度相似的微生物僅會(huì)具有相似的（G+C）含量，但不會(huì)完全相同；并且同一屬細(xì)菌之間的（G+C）含量差異不會(huì)超過(guò)12 mol%，種與種之間的差異小于5 mol%，為此可以通過(guò)數(shù)據(jù)差異判斷細(xì)菌之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。需要說(shuō)明的是，這種鑒定方法主要用于排除不確定的分類單元，而不是去建立一個(gè)新的分類單元，即親緣關(guān)系近的種，（G+C）的含量一定相近；但（G+C）含量相近的種，親緣關(guān)系卻不一定相近。

（二）核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)是用于微生物檢測(cè)的最早的分子生物學(xué)技術(shù)，指利用帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸探針與靶序列雜交，再用特定的方法檢測(cè)特異結(jié)合的探針 [3]。每種微生物都有其特殊的核酸片段，經(jīng)分離標(biāo)記后，制備出探針，通過(guò)檢測(cè)探針，對(duì)DNA序列片段進(jìn)行定性和定量分析，最終開(kāi)展微生物鑒定。該技術(shù)具有操作較為簡(jiǎn)單、特異性較好、敏感度高、速度快等優(yōu)點(diǎn)，主要有印記雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交等方法。其中，在原位雜交方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的熒光原位雜交技術(shù)（FISH），在對(duì)有熒光標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交后，使用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，已獲得廣泛應(yīng)用；該方法易受雜交溫度、反應(yīng)條件、熒光染料、探針選擇等影響。需要指出的是，核酸雜交技術(shù)需要運(yùn)用放射性同位素，成本較高且會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定傷害，在一定程度上限制了技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，但生物傳感器技術(shù)與之結(jié)合后，顯著提升了其效益。

（三）核酸擴(kuò)增技術(shù)

1. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)

PCR技術(shù)是微生物檢測(cè)最常用的分子方法之一，也是現(xiàn)行微生物檢測(cè)國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中常用的檢測(cè)技術(shù)之一。PCR技術(shù)通過(guò)包括模板變性、引物退火和產(chǎn)物延伸的兩步或三步的溫度循環(huán)來(lái)擴(kuò)增一個(gè)特定的目標(biāo)DNA序列。

根據(jù)一次檢測(cè)目標(biāo)的數(shù)量多少，可以將基于PCR的微生物檢測(cè)技術(shù)分為單重PCR技術(shù)和多重PCR技術(shù) [4]。①單重PCR技術(shù)是指一次PCR反應(yīng)只擴(kuò)增一對(duì)引物的檢測(cè)方法，適用于高保守性的微生物種或?qū)俚臋z測(cè)。通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)微生物種特異及種內(nèi)保守的DNA序列，將一對(duì)引物的檢測(cè)結(jié)果與目標(biāo)微生物進(jìn)行判定，如對(duì)洋蔥泛菌屬 [5]、茄子致病菌 [6]的檢測(cè)。單重PCR技術(shù)一次只能檢測(cè)一個(gè)目標(biāo)，存在檢測(cè)效率低、單對(duì)引物擴(kuò)增失敗導(dǎo)致產(chǎn)生高假陰性和低靈敏度等問(wèn)題。② 多重PCR技術(shù)是指一次PCR反應(yīng)擴(kuò)增多對(duì)引物，可以進(jìn)行多個(gè)靶標(biāo)檢測(cè)的方法。多重PCR技術(shù)可以一次檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)微生物，或者一次檢測(cè)一個(gè)目標(biāo)微生物的多個(gè)目標(biāo)序列，顯著提高了檢測(cè)效率和檢測(cè)的準(zhǔn)確性。多重PCR技術(shù)已用于沙門(mén)氏菌的多個(gè)血清型 [7]，真菌類微生物 [4]，眼部細(xì)菌性致病菌 [8]，病毒性腦膜炎兒童患者腦脊液中的18種致病菌 [9]，糞便樣本中的15種腸道致病菌 [10]以及11種食源性致病菌的檢測(cè) [11]。

根據(jù)PCR體系發(fā)生的場(chǎng)所，基于PCR的檢測(cè)技術(shù)還包括將PCR體系整合在液滴中的液滴PCR [12]、將PCR引物固體在固定支持物上進(jìn)行的固相PCR [7]等，但由于操作較為復(fù)雜、成本比較高，尚未廣泛應(yīng)用。

在實(shí)際應(yīng)用中，熒光PCR技術(shù)是比較常用的 [13]，是我國(guó)現(xiàn)行病原微生物檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中常采用的技術(shù)。熒光物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)化了PCR產(chǎn)物的檢測(cè)步驟，在單重或多重PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，通過(guò)熒光信號(hào)的積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的形成，因此，熒光物質(zhì)的加入實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)對(duì)目標(biāo)微生物的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。熒光PCR技術(shù)通常與多重PCR聯(lián)合，進(jìn)行多靶標(biāo)的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。常用的熒光物質(zhì)有熒光染料（如SYBR Green核酸染料）和熒光探針（如TaqMan探針）。例如，基于SYBR Green方法，對(duì)眼部的多種細(xì)菌性致病菌 [8]和糞便樣本中的15種腸道致病菌 [10]進(jìn)行了檢測(cè)；基于TapMan探針?lè)?，?duì)洋蔥泛菌屬和多抗藥的假絲酵母進(jìn)行了檢測(cè) [7,14]，對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行了檢測(cè) [15,16]。目前，依賴于熒光PCR儀的多重PCR一次性檢測(cè)的引物數(shù)量偏少，在多微生物同時(shí)檢測(cè)時(shí)，一種微生物通常只能檢測(cè)一個(gè)目標(biāo)序列，因此存在因?yàn)橐粋€(gè)序列檢測(cè)失敗而認(rèn)為該微生物不存在的的假陰性問(wèn)題。

2. 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是在等溫條件下擴(kuò)增核酸進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，該技術(shù)簡(jiǎn)化了核酸擴(kuò)增的裝置，在基層、即時(shí)微生物的分子診斷等方面被廣泛應(yīng)用 [17,18]。根據(jù)所添加的活性酶的不同，常見(jiàn)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、依賴解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有以下特點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)單，與常規(guī)PCR技術(shù)相比，不需要模板的熱變性、電泳及紫外觀察等過(guò)程，只需要水浴鍋即可，產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果用肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)沉淀濁度即可判斷；②無(wú)需溫度循環(huán)，速度快；③特異性極高，6 個(gè)靶區(qū)域的任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增；④靈敏度高，對(duì)于病毒模板的檢測(cè)可低至幾個(gè)拷貝，比PCR技術(shù)高出數(shù)量級(jí)的差異。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已被廣泛用于病原菌檢測(cè) [19]，如蘋(píng)果腐爛病菌 [20]、馬鈴薯環(huán)腐病 [21]、 甘蔗宿根矮化病菌 [22]等植物類病原菌，魚(yú)鏈球菌 [23]、魚(yú)乳球菌 [24]等動(dòng)物致病菌和人類呼吸道病原菌 [25]。

（四）DNA指紋圖譜技術(shù)

DNA指紋圖譜技術(shù)是用DNA指紋圖譜對(duì)DNA序列進(jìn)行分型、對(duì)微生物在種水平上進(jìn)行鑒定的一種技術(shù)?；贒NA的分型方法簡(jiǎn)單易操作、重復(fù)率和分辨率都很高 [26]。DNA指紋圖譜技術(shù)的特點(diǎn)有：①多位點(diǎn)性，可以更加全面反映基因組的特征；②高變異性，即不同的物種之間具有不同的DNA圖譜；③簡(jiǎn)單且穩(wěn)定的遺傳性，即DNA圖譜能準(zhǔn)確地從上一代傳到下一代。目前，該技術(shù)已成為分類鑒定及分類研究的常規(guī)方法，不僅用于在不同水平上的微生物的多樣性、分類、系統(tǒng)學(xué)研究，還用于微生物的進(jìn)化關(guān)系及生態(tài)研究。

DNA指紋圖譜技術(shù)的基本方法是先對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行酶切，再用瓊脂糖凝膠電泳將其分離，用探針標(biāo)記后進(jìn)行Southern印跡雜交顯色，最終獲得DNA指紋圖譜，對(duì)圖譜進(jìn)行一系列分析后可得到相應(yīng)的信息，最后確定菌株的親緣關(guān)系。DNA指紋圖譜技術(shù)常用的方法有變性梯度凝膠電泳（DGGE）、溫度梯度凝膠電泳（TGGE）、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、重復(fù)序列PCR（Rep-PCR）、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA）、多位點(diǎn)序列分析技術(shù)（MLST）等?；赑CR技術(shù)的DNA指紋圖譜技術(shù)，由于聯(lián)合使用兩種技術(shù)，可不用建立基因文庫(kù)，是目前普遍使用的方法。每種方法的應(yīng)用特點(diǎn)不同，可根據(jù)情況應(yīng)用于不同的微生物鑒定中；由于鑒定方法不可避免存在一些不足，為此在具體實(shí)驗(yàn)中通常選擇一起使用兩種方法。

（五）基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是生物芯片技術(shù)的一種，利用雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)，使用效果佳。該技術(shù)是一種高科技技術(shù)，利用微加工技術(shù)，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)特定序列的DNA片段規(guī)則排列并固定于支持物上，構(gòu)成一個(gè)二維DNA探針陣列，因其類似于計(jì)算機(jī)的電子芯片，故被稱為基因芯片技術(shù) [27]。基因芯片技術(shù)特異性強(qiáng)且高通量，可一次性檢測(cè)樣品中的多種微生物，在檢測(cè)結(jié)果出來(lái)后，能夠全自動(dòng)分析檢測(cè)結(jié)果，并用生物學(xué)知識(shí)分析信息結(jié)果?；蛐酒夹g(shù)在微生物病原體檢測(cè)、種類鑒定、功能基因檢測(cè)、基因分型、突變檢測(cè)、基因組監(jiān)測(cè)等研究領(lǐng)域中的作用顯著 [28]。

基因芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高通量的檢測(cè)，檢測(cè)效率顯著提高。該技術(shù)是基于顯色或是熒光信號(hào)進(jìn)行的，存在背景噪音大、靈敏度偏低等問(wèn)題，雖然可以檢測(cè)目標(biāo)微生物的有無(wú)，但無(wú)法檢測(cè)序列變異的情況，無(wú)法對(duì)微生物進(jìn)行分型。另外，現(xiàn)有的芯片多是點(diǎn)陣列型的雜交芯片，盡管已有一些商業(yè)化的芯片，但仍不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需求；芯片功能有限，需要根據(jù)需求進(jìn)行定制，成本較高，靈活性差。

（六）高通量測(cè)序技術(shù)

基于雙脫氧鏈中止（Sanger）法產(chǎn)生了第一代測(cè)序技術(shù)，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)，NGS方法已能快速、高效地進(jìn)行全基因組測(cè)序。2011年發(fā)展的第三代測(cè)序技術(shù)序列讀長(zhǎng)已高達(dá) 3000 bp，與前兩代測(cè)序技術(shù)相比，其最大的優(yōu)點(diǎn)是不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，避免了因PCR帶來(lái)的錯(cuò)誤 [29]。得益于測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，數(shù)百萬(wàn)個(gè)PCR擴(kuò)增子測(cè)序能夠同時(shí)進(jìn)行，檢測(cè)效率顯著提高。

1. 全基因組測(cè)序（WGS）、宏基因組測(cè)序（mNGS）和靶向測(cè)序技術(shù)

WGS技術(shù)能夠準(zhǔn)確區(qū)分菌株間的基因組差異，且具有高度的重現(xiàn)性，不僅可以用于預(yù)期的單核細(xì)胞生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)，還可以用于其他與公共衛(wèi)生相關(guān)的病原體報(bào)告，是細(xì)菌分離物暴發(fā)監(jiān)測(cè)和調(diào)查的有力工具。WGS測(cè)的是微生物的整個(gè)基因組序列，獲得的信息很全面，但也因此依賴于對(duì)微生物的分離培養(yǎng)，耗時(shí)費(fèi)力。微生物的群體特性需要深度測(cè)序才能準(zhǔn)確的檢測(cè)，這對(duì)于全基因組測(cè)序來(lái)說(shuō)成本會(huì)很高。

宏基因組指的是環(huán)境中所有微生物基因組的總和。mNGS技術(shù)不對(duì)微生物特定種群進(jìn)行單一性測(cè)序（如真菌、細(xì)菌或者病毒），而是考慮所有微生物基因組的總和 [30,31]。正因?yàn)榇耍瑴y(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)中會(huì)存在大量背景數(shù)據(jù)，對(duì)這些數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制 [32]和科學(xué)分析[33]成為有效利用mNGS數(shù)據(jù)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。此外，mNGS技術(shù)的另一個(gè)局限是目標(biāo)微生物淹沒(méi)在大量背景數(shù)據(jù)中，尤其是目標(biāo)微生物含量很低時(shí)，需要通過(guò)加強(qiáng)測(cè)序深度才能檢測(cè)到該微生物，導(dǎo)致成本提高。

靶向測(cè)序技術(shù)針對(duì)特定的微生物種群，可以低成本地實(shí)現(xiàn)超深度測(cè)序 [34]。在準(zhǔn)確性和靈敏性方面，該技術(shù)較mNGS技術(shù)明顯改進(jìn)，可以與mNGS技術(shù)實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，全面準(zhǔn)確地檢測(cè)微生物。常見(jiàn)的靶向測(cè)序技術(shù)有16S擴(kuò)增子測(cè)序（16S rRNA）、18S擴(kuò)增子測(cè)序（18S rRNA）、核糖體間隔基因分析（RISA）。16S rRNA是細(xì)菌、古生菌屬種鑒定與分類學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記基因 [35]；18S rRNA是真菌中常用的系統(tǒng)發(fā)育基因，它比16S rRNA具有更多的高變結(jié)構(gòu)域 [36]；基因間的間隔區(qū)（ITS）因具有良好的可變區(qū)和保守區(qū)受到人們的廣泛關(guān)注，在種及亞種的鑒定上優(yōu)越性突出，是一種廣泛應(yīng)用的通用真菌條形碼標(biāo)記，可用于真菌的成功鑒定。16S rRNA、18S rRNA、ITS靶向測(cè)序技術(shù)不僅可以低成本的檢測(cè)出微生物，還可以在屬或種的分類水平上進(jìn)行分型。

2. 多核苷酸多態(tài)性（MNP）標(biāo)記

MNP標(biāo)記是一種新型微生物鑒定方法，是一種包含多個(gè)分散核苷酸多態(tài)性標(biāo)記的新型DNA標(biāo)記方法。目前，MNP標(biāo)記已被采用作為我國(guó)國(guó)家植物身份鑒定基因分型的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。該方法開(kāi)發(fā)了微生物遺傳變異測(cè)序技術(shù)（MGV-Seq）及其配套的生物信息學(xué)分析工具，更重要的是設(shè)計(jì)了一種基于MGV-Seq的微生物鑒定程序，為MNP基因分型開(kāi)發(fā)了一種定制的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)算法。MGV-Seq方法具有高重現(xiàn)性、高準(zhǔn)確性、高敏感性和高特異性等特點(diǎn)。對(duì)白葉枯病毒（Xoo）菌株的檢測(cè)證明了MGV-Seq方法對(duì)微生物鑒定的適用性、可行性和重現(xiàn)性。Xoo菌株自1972年被分離出來(lái)后，被世界各地的實(shí)驗(yàn)室使用并進(jìn)行了多年的培養(yǎng)，在運(yùn)用MGV-Seq檢測(cè)時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)了一些被標(biāo)記為Xoo的菌株并不屬于Xoo家族，而是屬于黃單胞菌（Xcc）物種的情況；另外還發(fā)現(xiàn)，即使是已申報(bào)的Xoo菌株，也可能是一種不同的菌株。

三、微生物資源分子鑒定技術(shù)存在的問(wèn)題

對(duì)微生物尤其是病原微生物進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)、鑒定是食品檢疫、臨床檢測(cè)和傳染病防治工作的首要問(wèn)題。分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步為微生物檢測(cè)方法的發(fā)展提供了契機(jī)，檢測(cè)水平從組織形態(tài)學(xué)水平深入到分子水平、基因水平，檢測(cè)模式也從對(duì)可能的病原體單一靶向檢測(cè)模式發(fā)展到涵蓋常見(jiàn)病原體組合的檢測(cè)模式，實(shí)現(xiàn)了對(duì)一份樣品進(jìn)行一次檢測(cè)就可以診斷或排除多種病原體。不同的微生物資源分子鑒定技術(shù)適用性不同，各有優(yōu)劣勢(shì)，如表 1所示。目前，尚未有針對(duì)微生物資源鑒定選擇的研究，但無(wú)論使用哪種方法，都需要考慮鑒定成本、重現(xiàn)性、可靠性以及對(duì)菌株的鑒別能力等。當(dāng)前，微生物資源鑒定技術(shù)存在以下幾大問(wèn)題。

表1 不同微生物資源分子鑒定技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

（一）依賴于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境

目前，用于微生物資源分子鑒定的實(shí)驗(yàn)方法多處于實(shí)驗(yàn)室階段，僅作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的對(duì)照參考，尚未廣泛應(yīng)用，亟需發(fā)展不依賴于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的鑒定方法，如用于快速鑒定的試劑盒。同時(shí)，大部分微生物鑒定技術(shù)都需要進(jìn)行增菌培養(yǎng)以提高檢出率，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，無(wú)法及時(shí)獲得檢測(cè)結(jié)。未來(lái)應(yīng)開(kāi)發(fā)不需要增菌培養(yǎng)或者縮減增菌時(shí)間的鑒定方法以提高檢測(cè)效率。此外，例如高通量測(cè)序技術(shù)中的方法雖適用于實(shí)驗(yàn)室研究，可以得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，但存在數(shù)據(jù)處理復(fù)雜、無(wú)法在實(shí)際應(yīng)用中迅速獲得檢測(cè)結(jié)果的問(wèn)題。過(guò)分依賴于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，在不同實(shí)驗(yàn)室、由不同實(shí)驗(yàn)人員操作時(shí)，對(duì)獲得的檢測(cè)結(jié)果可能存在無(wú)法進(jìn)行處理分析的情況，因此檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)一化和標(biāo)準(zhǔn)化勢(shì)在必行，有利于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行交流。

（二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性不夠

微生物能夠迅速繁殖并存活，使遺傳變異在微生物中普遍存在，為此，微生物已被廣泛用于生物學(xué)和臨床研究中。致病微生物的基因變異可以改變病毒毒力，具有耐藥性，降低疫苗療效，明顯影響其與宿主的相互作用；同源菌株的遺傳變異使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性面臨風(fēng)險(xiǎn)。為了實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的再現(xiàn)性，需要確保同一微生物在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中用于相同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹Ｎ⑸镨b定需要檢測(cè)菌株內(nèi)（MGVI）和菌株之間（MGVB）的遺傳變異，現(xiàn)有的微生物變異檢測(cè)方法，如脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)（PFGE）、多位點(diǎn)的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)分析（LIVA）和多位點(diǎn)序列分型（MLST），尚不能明確區(qū)分密切相關(guān)的菌株，為此，通常采用增加測(cè)序深度、改進(jìn)測(cè)序庫(kù)準(zhǔn)備方法和優(yōu)化生物信息學(xué)分析方法，如采用超深的WGS以檢測(cè)出罕見(jiàn)的變體，但會(huì)導(dǎo)致鑒定成本增加。準(zhǔn)確性作為評(píng)價(jià)微生物鑒定技術(shù)的重要指標(biāo)，在選擇鑒定方法時(shí)要著重考量。而已有的微生物資源分子鑒定技術(shù)無(wú)法獲得精準(zhǔn)的結(jié)果，如運(yùn)用DNA含量測(cè)定時(shí)，僅依靠（G+C）含量無(wú)法準(zhǔn)確判斷微生物的菌株屬性；PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)會(huì)出現(xiàn)假陰性問(wèn)題，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件或者操作的要求比較高，若稍有不慎就會(huì)影響結(jié)果準(zhǔn)確性。WGS技術(shù)雖然能獲得十分準(zhǔn)確的結(jié)果，但檢測(cè)成本卻偏高。

（三）缺乏相應(yīng)的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)和鑒定平臺(tái)

目前，我國(guó)微生物資源基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)仍處于起步階段，相關(guān)微生物基因組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等信息依賴于國(guó)外數(shù)據(jù)庫(kù)，其中美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的數(shù)據(jù)庫(kù)占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。例如，就基因芯片技術(shù)而言，在進(jìn)行鑒定時(shí)，需要細(xì)菌的特異基因或者核糖體基因信息來(lái)進(jìn)行靶基因的設(shè)計(jì)，因此完善的基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)就顯得尤為重要。目前初步應(yīng)用的微生物DNA鑒定平臺(tái)主要依賴16S rRNA基因、ITS基因和特異基因鑒定技術(shù)。16S rRNA和ITS基因鑒定技術(shù)僅能分辨到種或者屬的分類水平，不能精細(xì)區(qū)分有害和有益微生物小種；特異基因鑒定技術(shù)一次僅能鑒定10種以下微生物的種或小種，不能同時(shí)檢測(cè)食品中的多種微生物。另外，為避免氣溶膠污染，這類鑒定技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和人員要求都較高?；?6S rRNA、ITS等技術(shù)對(duì)微生物資源進(jìn)行鑒定時(shí)，對(duì)國(guó)外設(shè)備的依賴性強(qiáng)，如來(lái)自伊勒米納公司（Illumina）和賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）等公司設(shè)備，存在價(jià)格高、耗材貴、鑒定技術(shù)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)無(wú)法保護(hù)等劣勢(shì)。高端試劑、高端儀器設(shè)備等的“卡脖子”現(xiàn)象嚴(yán)重，亟待建立具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微生物DNA鑒定平臺(tái)。

四、發(fā)展建議

微生物分類鑒定已經(jīng)成為微生物學(xué)科研究的重要組成部分，它不僅能闡明微生物資源的生物學(xué)地位與本質(zhì)，還是實(shí)現(xiàn)微生物資源利用的重要步驟。目前，由于沒(méi)有精準(zhǔn)的微生物資源鑒定方法，盜取微生物菌種的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，不僅給生產(chǎn)企業(yè)造成了一定經(jīng)濟(jì)損失，也給花費(fèi)幾年甚至幾十年的微生物菌種研究者造成了無(wú)法彌補(bǔ)的損失，嚴(yán)重影響了微生物健康與安全產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為此，微生物資源的精準(zhǔn)鑒定對(duì)于甄別微生物種質(zhì)、知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有重要意義。為促進(jìn)我國(guó)微生物資源的保護(hù)和利用，建議如下。

（一）繼續(xù)加大對(duì)各類鑒定技術(shù)的研究

微生物對(duì)國(guó)家生物安全的重要性日益凸顯，開(kāi)展微生物精準(zhǔn)鑒定和快速檢測(cè)的需求更加迫切。傳統(tǒng)微生物鑒定檢測(cè)方法多依賴于微生物的純培養(yǎng)，存在耗時(shí)長(zhǎng)、敏感度低和特異性較差等問(wèn)題；另外，全自動(dòng)細(xì)菌鑒定方法受反應(yīng)底物濃度、培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分等影響較大，某些細(xì)菌的生化反應(yīng)、菌體狀態(tài)、代謝情況會(huì)影響鑒定，難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒定。因此，高特異性、高靈敏性的微生物精準(zhǔn)鑒定技術(shù)在微生物健康與安全產(chǎn)業(yè)中需求廣泛。建議鼓勵(lì)相關(guān)科研機(jī)構(gòu)和高等院校深入開(kāi)展分子鑒定技術(shù)研究，適當(dāng)給予政策支持和資金支持。在對(duì)已有微生物資源鑒定技術(shù)完善的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)加快對(duì)快速、準(zhǔn)確的鑒定技術(shù)的研發(fā)，鼓勵(lì)開(kāi)展菌株鑒定試劑盒研發(fā)，滿足能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)微生物進(jìn)行鑒定的要求，深入研究復(fù)雜微生物群體的分類及功能，了解生物多樣性及其與生態(tài)功能的關(guān)系。

（二）建立具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微生物資源鑒定平臺(tái)

建立以MNP標(biāo)記技術(shù)為主的DNA鑒定平臺(tái)。該技術(shù)一次可高通量檢測(cè)96個(gè)樣本，每個(gè)樣本可以檢測(cè)100種以上微生物靶標(biāo)，可將每種微生物區(qū)分至亞種甚至是小種或變種，準(zhǔn)確率達(dá)到99.98%。同時(shí)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)設(shè)備、耗材、分析軟件的國(guó)產(chǎn)化，解決“卡脖子”問(wèn)題。同時(shí)，解決PCR技術(shù)的氣溶膠污染問(wèn)題，降低對(duì)實(shí)驗(yàn)室物理空間和高級(jí)別實(shí)驗(yàn)室的需求。

（三）完善微生物資源數(shù)據(jù)庫(kù)

建立微生物資源數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)我國(guó)微生物研究意義重大。建議重點(diǎn)支持微生物資源鑒定技術(shù)的相關(guān)科研單位，對(duì)國(guó)家菌種資源庫(kù)、國(guó)家病原微生物資源庫(kù)、國(guó)家病毒資源庫(kù)等3個(gè)微生物資源庫(kù)的建設(shè)和完善給予政策支持和資金支持。對(duì)已保存的微生物進(jìn)行鑒定，完善數(shù)據(jù)庫(kù)信息，為微生物知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和資源開(kāi)發(fā)利用提供支持，加速微生物健康與安全產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。另外，加快微生物基因組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)，豐富微生物資源數(shù)據(jù)庫(kù)。