基于氣相色譜的1-MCP檢測方法及釋放規(guī)律研究

李廣勝，邱 夕，馬 駿，李昆侖，陳紹慧，路丹丹

（1.國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津），農業(yè)農村部農產品貯藏保鮮重點實驗室，天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384；2.天津農學院，天津 300384；3.天津科技大學，天津 300222）

1-甲基環(huán)丙烯（1-Methylcyclopropene,1-MCP）作為一種乙烯受體抑制劑，能以高于乙烯10倍的結合力與乙烯受體結合，從而阻斷乙烯信號傳導，達到減緩果蔬后熟、延長貯藏時間的作用[1-2]。1-MCP已被廣泛應用于各類果蔬采后貯藏保鮮中，有關其對采后果蔬的保鮮效果研究也有相當多報道[3-6]。由于果蔬品種、成熟度和采后時間的不同[7]，1-MCP處理濃度也有一定的差異，適宜的1-MCP處理濃度能夠有效延長果蔬采后貯藏時間，提高貯藏品質[8-11]。1-MCP在常溫常壓下為氣態(tài)，不便于批量運輸和使用，因此常用環(huán)糊精將其進行包藏，使用時通過水或一定濃度的KOH溶液浸濕的方式將1-MCP氣體釋放到貯藏環(huán)境中[12]。1-MCP氣體從包藏載體中釋放、1-MCP與乙烯受體進行不可逆結合這兩個過程均會受到低溫因素的影響，過低的溫度將會對釋放和結合產生抑制作用，從而影響果蔬的保鮮效果[13]。目前對于1-MCP的研究主要集中在對不同果蔬的保鮮效果方面，而對于1-MCP氣體濃度精確檢測和不同環(huán)境條件下的釋放規(guī)律研究涉及較少。由于1-甲基環(huán)丙烯純氣體無法得到，而1-甲基環(huán)丙烯（分子式：C4H6；分子量：54.09）與異丁烯（分子式：C4H8；分子量：56.10）具有相近的分子式和分子量，且在氫火焰離子化檢測器上有相同的響應值，因此陳明等[14]以異丁烯作為標準物，采用頂空氣相色譜法（HS-GC）建立了對1-MCP濃度進行精確測定的方法。本研究借鑒該方法，同樣以異丁烯作為標準物，確定了1-MCP氣相色譜檢測條件，且得到良好的線性分析結果，從而進一步印證了該檢測方法的準確性和可靠性，并以該方法對貯藏環(huán)境中的1-MCP含量進行測定。何翊等[15]通過氣相色譜法（GC）研究了1-MCP在不同包藏物中的釋放速度，但并未對實際應用過程中的釋放情況進行研究。本文受此啟發(fā)，以青皮核桃為試材，對商品1-MCP在采后貯藏應用中受不同因素影響的釋放規(guī)律進行了研究，以期為1-MCP精準濃度、高效處理采后果蔬貯藏保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

商品1-MCP由國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津）提供；異丁烯，購于天津市賽美特特種氣體有限公司（標準濃度：400μL/L）；試驗用梨購于紅旗農貿市場，試驗用核桃采摘自天津市薊州區(qū)孫各莊鄉(xiāng)隆福寺村。

1.1.2 儀器與設備

GC-2010氣相色譜儀，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 建立異丁烯色譜檢測條件

參考陳明等[14]的方法，色譜柱選用HP-INNOWAX毛細管柱（30 m×250μm×0.25μm），柱溫為100℃，載氣為氮氣，設置壓力120 kPa，進樣器溫度130℃，檢測器溫度150℃，進樣量為2 mL。比較不同柱溫（70、100、130℃）、不同載氣壓力（60、80、100、120、150 kPa）、不同進樣器溫度（70、100、130℃）和不同檢測器溫度（130、150、180℃）對檢測結果的優(yōu)化響應。

1.2.2 異丁烯濃度線性分析

使用已經(jīng)確定的異丁烯色譜檢測條件，將異丁烯配制成不同的梯度濃度。方法如下：使用20 mL的玻璃針管吸取異丁烯標準原樣氣體（400μL/L）20 mL，再推出10 mL，于空氣流通處抽取10 mL新鮮空氣，封住針眼，靜置30 min，此時針管內異丁烯濃度為200μL/L，再次推出10 mL，抽取10 mL空氣，靜置30 min，此時針管內異丁烯濃度為100μL/L。以此類推分別得到400、200、100、50、25μL/L系列濃度異丁烯氣體。

1.2.3 商品1-MCP濃度線性分析

將商品1-MCP利用上述確定的色譜檢測條件進行檢測，商品1-MCP做如下濃度梯度處理：1包、2包、4包、8包、16包、32包6個處理，每種處理均將相應包數(shù)的1-MCP經(jīng)蒸餾水浸濕后立即放入5.5 L樂扣盒中，并蓋上蓋子密封好，蓋子上事先預留取樣用小孔，用膠帶密封好。每種處理重復3次，密封2 h后用玻璃針管取樣測定。

1.2.4 不同條件下1-MCP釋放規(guī)律

1.2.4.1 樂扣盒模擬包裝

在洗凈烘干的樂扣盒內，放入1包商品1-MCP和一個微型風扇，分為濕潤、干燥和裝有梨3種方式，每種方式分為常溫和低溫兩種。處理方式記為：常溫+濕潤、常溫+干燥、低溫+濕潤、低溫+干燥、常溫+梨、低溫+梨，共計6組處理。濕潤：樂扣盒內壁噴灑水珠；干燥：保持樂扣盒內壁干燥；裝有梨：每個樂扣盒內裝入6個梨；常溫：28℃；低溫：0℃；每個樂扣盒內放入1包商品1-MCP后每1 h采樣檢測1次，連續(xù)采樣7 h。每次氣體采樣前微型風扇工作30 s，后靜置5 min再進行采樣。以異丁烯為標準物繪制標準曲線，GC方法進行釋放濃度測定。

1.2.4.2 PE50保鮮袋包裝青皮核桃

使用PE50保鮮袋（厚度為50μm，利用熱封機制成尺寸為40 cm×25 cm×50 cm的保鮮袋）對青皮核桃進行包裝，每袋裝入10 kg青皮核桃，分為常溫處理（28℃）和低溫處理（0℃）。常溫處理組：常溫條件下在袋子開口處放入1包經(jīng)蒸餾水浸濕后的商品1-MCP，立即封口，存放在常溫環(huán)境。低溫處理組：每袋核桃敞口于-2℃環(huán)境下預冷24 h，后在袋子開口處放入1包經(jīng)蒸餾水浸濕后的商品1-MCP，立即封口，存放于0℃環(huán)境下。從放入商品1-MCP開始，每1 h使用玻璃針管對袋子上、中、下3個固定位置進行氣體采樣，每次采樣后用透明膠帶封住采樣口，連續(xù)采樣10 h，整個采樣過程中不翻動袋子，不觸碰青皮核桃。

2 結果與分析

2.1 異丁烯色譜檢測條件篩選

2.1.1 柱溫

由圖1可知，3種設定柱溫下的異丁烯色譜圖峰形相差不大，但保留時間和峰面積隨溫度變化改變明顯。80℃時，保留時間為2.494 min，峰面積為1 012.95；100℃時，保留時間為1.985 min，峰面積為1 263.63；130℃時，保留時間為1.935 min，峰面積降低到1 162.89。由此可見，柱溫設定為100℃時，異丁烯的色譜圖峰形、保留時間、峰面積都非常理想，所以柱溫選擇100℃。

圖1 不同柱溫下的異丁烯標準品圖譜Fig.1 Isobutylene standard chromatograms at different column temperatures

2.1.2 載氣壓力

由圖2可知，60 kPa時，保留時間為2.870 min，峰面積為491.65；80 kPa時，保留時間為2.621 min，峰面積為750.97；100 kPa時，保留時間為2.553 min，峰面積為951.47；120 kPa時，峰形最好，保留時間為2.050 min，峰面積為1 336.33；150 kPa時，保留時間為1.926 min，峰面積為1 140.36。120 kPa時峰形、峰面積、保留時間都非常理想，所以選用120 kPa為載氣壓力。

圖2 不同載氣壓力下的異丁烯標準品圖譜Fig.2 Isobutylene standard chromatograms under different carrier gas pressures

2.1.3 進樣器溫度

由圖3可知，70℃時的異丁烯色譜峰保留時間為1.977 min，峰面積為1 258.23；100℃時，色譜峰保留時間為1.963 min，峰面積為1 224.04；130℃時，色譜峰保留時間為1.987 min，峰面積為1 234.22。由此可見，進樣器溫度對保留時間和峰面積的產生影響不顯著，本試驗中選擇峰面積中間的值，即確定130℃作為進樣器溫度。

圖3 不同進樣器溫度下的異丁烯標準品圖譜Fig.3 Isobutylene standard chromatograms at different injector temperatures

2.1.4 檢測器溫度

由圖4可知，在130、150、180℃這3個檢測器溫度下，異丁烯標準品的峰形相差不大。130℃時，異丁烯標準品的保留時間為1.971 min，峰面積為3 090.37；150℃時，保留時間為1.975 min，峰面積為3 220.01；180℃時，保留時間為1.931 min，峰面積為3 192.30。3個檢測器溫度下，異丁烯標準品的保留時間、峰面積基本相同。在本試驗中，以選擇最大峰面積為準。因此，確定檢測器溫度為150℃。

圖4 不同檢測器溫度下的異丁烯標準品圖譜Fig.4 Isobutylene standard chromatograms at different detector temperatures

2.2 異丁烯與商品1-MCP濃度的線性分析

由圖5～7可知，利用上述建立的氣相色譜條件進行檢測，異丁烯濃度與峰面積、商品1-MCP濃度與峰值、商品1-MCP濃度與峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關系，其線性方程分別為y=7 446x-21 743（R2=0.999）、y=3 050x-1 749（R2=0.997）和y=56 745x-1 284（R2=0.997）。已知濃度的異丁烯與間接已知濃度的商品1-MCP均與峰面積（峰值）呈現(xiàn)良好的線性關系。由此可見，利用本試驗中建立的氣相色譜條件，同時利用已知濃度異丁烯繪制標準曲線來測定不同環(huán)境中1-MCP含量的方法是可行且準確的。

圖5 異丁烯濃度與峰面積的線性關系Fig.5 Linear relationship between concentrations and peak areas of isobutylene

圖6 1-MCP濃度與峰值的線性關系Fig.6 Linear relationship between concentrations and peak values of 1-MCP

圖7 1-MCP濃度與峰面積的線性關系Fig.7 Linear relationship between concentrations and peak areas of 1-MCP

2.3 不同條件下1-MCP的釋放規(guī)律

2.3.1 樂扣盒內模擬的1-MCP釋放規(guī)律

由圖8可知，在樂扣盒模擬試驗中，常溫+干燥、低溫+干燥和低溫+梨3個處理組在7 h內均沒有檢測到1-MCP含量積累，可能是由于這3個處理組的環(huán)境保持干燥，無法使商品1-MCP進行有效釋放。常溫+濕潤處理組1-MCP釋放速率最高，在2 h時釋放濃度達到了最高值，為14.87μL/L，3 h時下降到8.61μL/L，后期呈小幅度上升趨勢，7 h時1-MCP積累濃度為10.746μL/L；低溫+濕潤處理組在1 h的1-MCP釋放量與常溫+濕潤組相近，為7.3μL/L，2 h下降到5.57μL/L，隨后緩慢上升，7 h時的1-MCP積累含量為6.47μL/L，從3 h開始常溫+濕潤處理組1-MCP積累量顯著高于低溫+濕潤處理組（P＜0.05）；常溫+梨處理組1-MCP釋放較為平衡，1 h和7 h時的1-MCP積累濃度分別為4.63μL/L和5.57μL/L，在7 h釋放過程中，其1-MCP積累量顯著低于常溫+濕潤處理組（P＜0.05）。表明濕潤環(huán)境能夠有效促進商品1-MCP的釋放，同時低溫對其釋放有一定的抑制作用；由于梨在常溫條件下較低溫條件下更能夠使貯藏環(huán)境產生水分（濕度），故常溫+梨處理組能夠促使商品1-MCP進行釋放。

圖8 不同條件下樂扣盒內1-MCP的釋放情況Fig.8 Release of 1-MCP in sealed box under different conditions

2.3.2 不同溫度下青皮核桃保鮮袋內1-MCP釋放規(guī)律

由圖9可知，常溫條件下，保鮮袋上部空間1-MCP積累濃度較高，1 h積累濃度為5.53μL/L，2 h積累濃度達到最高值（12.18μL/L），3 h時積累濃度有所下降，為9.36μL/L，后期緩慢上升再緩慢下降并最終保持平穩(wěn)，釋放后期1-MCP積累濃度為9.36μL/L；中部空間1-MCP積累較為緩慢，1 h時1-MCP積累濃度為1.26μL/L，2～4 h時1-MCP積累濃度未顯著增加，5 h時積累濃度為2.93μL/L，后期積累濃度基本保持穩(wěn)定，10 h時1-MCP積累濃度為3.28μL/L；下部空間1～3 h未檢測到1-MCP，4～6 h的1-MCP積累量維持在0.36μL/L左右，7 h時的1-MCP積累濃度增加到1.26μL/L，并保持緩慢增加，10 h時1-MCP積累濃度為1.55μL/L。在整個10 h取樣時間內，上部空間的1-MCP積累濃度顯著高于中部空間和下部空間（P＜0.05）。中部空間前4 h的1-MCP積累量保持穩(wěn)定，5 h時1-MCP積累濃度開始有所增加，且后期1-MCP積累濃度顯著高于下部空間。1-MCP氣體從包藏物中釋放出來并擴散到整個貯藏環(huán)境中是一種氣體自由擴散的過程，1-MCP氣體在無外界措施干預下，僅依靠自由擴散需要一定的時間才會均勻分布在整個貯藏環(huán)境中，該過程可能會使在10 h的檢測中不同部位的1-MCP積累濃度不一致，從而導致靠近釋放點的氣體濃度較高，遠離釋放點的氣體濃度較低。

圖9 常溫條件下保鮮袋中1-MCP的釋放情況Fig.9 Release of 1-MCP from fresh-keeping bags at room temperature

由圖10可知，低溫條件下，保鮮袋上部空間1-MCP積累濃度呈前期上升，中期緩慢下降，后期基本保持穩(wěn)定，1 h時1-MCP積累濃度為5.38μL/L，3 h達到濃度最高值，為6.63μL/L，10 h 1-MCP積累濃度為5.32μL/L，與1 h時所積累濃度相近；中部空間的1-MCP積累濃度整體較為平穩(wěn)，未見明顯增加，整個測定期間的1-MCP積累濃度基本維持在1.12μL/L左右；下部空間1～6 h未檢測到1-MCP，7 h開始有少量1-MCP積累，10 h時積累濃度為0.33μL/L。整個測定期間，1-MCP積累濃度高低表現(xiàn)為上部＞中部＞下部，且不同部位間的1-MCP積累濃度差異顯著（P＜0.05）。造成這種差異可能也是由于氣體自由擴散速度較慢產生。

圖10 低溫條件下保鮮袋中1-MCP的釋放情況Fig.10 Release of 1-MCP from fresh-keeping bags at low temperature

由圖11可知，在保鮮袋的上部位置，常溫條件和低溫條件下，1-MCP在1 h的積累濃度相近，之后常溫條件下1-MCP積累濃度顯著高于低溫條件（P＜0.05）。在兩種溫度條件下，由于商品1-MCP受到蒸餾水浸濕作用，在1 h時的積累濃度相同，2～10 h過程中由于受到低溫環(huán)境的影響，1-MCP釋放速率顯著低于常溫狀態(tài)（P＜0.05），表現(xiàn)為低溫下的1-MCP積累濃度顯著低于常溫下的1-MCP積累濃度。

圖11 保鮮袋上部位置1-MCP在常溫和低溫條件下的釋放情況Fig.11 Release of 1-MCP from fresh-keeping bags at room&low temperatures

3 結論與討論

3.1 結論

（1）使用異丁烯作為標準物繪制標準曲線，結合GC檢測方法，使用如下檢測條件：柱溫為100℃，載氣壓力為120 kPa，進樣器溫度為130℃，檢測器溫度為150℃，進樣量為2 mL。該檢測方法下，異丁烯標準物濃度與對應峰面積之間呈良好線性關系，商品1-MCP的梯度“間接已知含量（濃度）”與所對應的峰面積之間亦呈現(xiàn)良好的線性關系。因此，通過此檢測方法能夠較為準確地測定貯藏環(huán)境中1-MCP的濃度。

（2）通過樂扣盒模擬試驗表明，商品1-MCP的釋放效果受浸濕程度和溫度的影響較大。主要表現(xiàn)為：充分浸濕條件下，1-MCP的釋放速度很快，依靠常溫條件下密封樂扣盒內梨自身水分散失所產生的濕度條件，1-MCP釋放速率和積累濃度顯著低于充分浸濕條件（P＜0.05），干燥條件下無法釋放1-MCP氣體；1-MCP在低溫條件（0℃）下釋放速度低于常溫條件（28℃），且差異達到顯著水平（P＜0.05）；低溫條件下（0℃），未浸濕的商品1-MCP在裝有梨的密封樂扣盒中7 h內未檢測到1-MCP。氣體取樣前微型風扇工作30 s是為了使樂扣盒中各位置的1-MCP濃度混勻，保持盒內各點位相同的取樣濃度。

（3）通過保鮮袋包裝青皮核桃試驗發(fā)現(xiàn)，在一定空間的貯藏環(huán)境中，相同時間內1-MCP的積累濃度在同一保鮮袋的不同位置并不相同。主要表現(xiàn)為：商品1-MCP所在位置（上部，即封口處）與保鮮袋最下部的1-MCP積累濃度在相同時間內差異達顯著水平（P＜0.05），前者1-MCP積累濃度高于后者。在裝有青皮核桃的密封保鮮袋內，依靠氣體自由擴散10 h并不能使整個保鮮袋各個位置的1-MCP積累濃度相同，即在同一個密封保鮮袋中不同位置的青皮核桃在10 h內接受到的1-MCP處理劑量（處理濃度×處理時間）是不相同的。

3.2 討論

1-MCP作為一種成熟的乙烯受體抑制劑，其已被廣泛應用于各類果蔬采后貯藏保鮮中，不同的果蔬因品種、成熟度和采后時間的不同，1-MCP處理量也有一定的差別，且適宜的處理濃度能使采后果蔬的品質達到最佳。相關研究表明：使用1.35μL/L 1-MCP處理安溪油柿果實效果最佳[16]；0.325μL/L 1-MCP處理采后梨，配合其他措施可使梨的貯藏期達8個月[17]；1.0μL/L 1-MCP處理采后軟棗獼猴桃能有效維持其營養(yǎng)物質含量，減緩果實硬度降低[18]；1.0μL/L 1-MCP處理番石榴果實12 h，能夠有效推遲乙烯釋放高峰，保鮮效果好[19]；3μL/L 1-MCP連續(xù)處理青皮核桃24 h，在保證品質的前提下能有效延長其貯藏期[20]。以上研究結果表明，使用1-MCP處理采后果蔬均需要適宜的濃度以達到較好的貯藏效果。因此，精準確定1-MCP處理濃度對于維持果蔬采后貯藏品質很關鍵。本文在借鑒前人研究的基礎上，進一步確定了基于氣相色譜的1-MCP檢測方法，且良好的線性關系驗證了本方法的可行性與準確性。需要指出的是，在繪制標準曲線時，所用異丁烯的梯度濃度應與所檢測1-MCP濃度保持在相同數(shù)量級，以保證檢測結果的準確性。

本研究結果顯示，商品1-MCP的釋放受浸濕程度和低溫的影響較大，在完全浸濕的條件下氣體釋放較迅速，易達到釋放峰值。在潮濕環(huán)境中，商品1-MCP則需要先吸收環(huán)境中的氣態(tài)水分，然后再釋放1-MCP氣體，且釋放速度顯著低于完全浸濕條件。裝有梨的封閉樂扣盒內，環(huán)境中產生的水分促進了商品1-MCP氣體的釋放。低溫對1-MCP的釋放產生顯著的抑制作用，表現(xiàn)為相同濕度條件下低溫（0℃）環(huán)境1-MCP釋放速率顯著低于常溫（28℃）環(huán)境，產生此現(xiàn)象的原因可能是在低溫條件下商品1-MCP包藏物與氣態(tài)水分的結合能力下降，從而導致1-MCP氣體從包藏物中釋放速率降低。由此可見，不同的1-MCP處理方式對其釋放效果產生顯著差異，因此，在實際貯藏應用中建議將商品1-MCP充分浸濕后再放入貯藏環(huán)境（袋）中。由于1-MCP處理與預冷處理對于溫度的要求是截然相反的，因此在實際應用中存在是先1-MCP處理還是先預冷處理的問題。本文認為，在進行貯藏保鮮科學研究時，由于果蔬貯藏量較規(guī)模應用少很多，一般采用預冷前對果蔬進行1-MCP處理；而大規(guī)模市場化應用往往是在預冷后低溫貯藏開始時進行1-MCP處理，這樣能夠減少相當部分的工作量，節(jié)省前期貯藏費用。由于商品1-MCP在低溫環(huán)境下釋放速率受到抑制，可根據(jù)實際情況加大使用量，以達到最優(yōu)處理濃度，但同時也會增加保鮮劑的費用。頡敏華等[13]就1-MCP處理和預冷處理進行了平衡，篩選出一個適宜的溫度點作為1-MCP處理與預冷處理的共用溫度，且使果蔬保鮮效果達到最佳，本文認為這也是一種解決兩者溫度矛盾的較好方式。

本研究也顯示，商品1-MCP在充分浸濕的情況下，1-MCP積累濃度在相同時間內同一保鮮袋不同位置的差異很大。常溫條件下，保鮮袋上部位置1 h達到1-MCP釋放濃度平均值，2 h達到釋放高峰；低溫條件下，距離商品1-MCP藥包放置點最遠端的位置7 h才開始有1-MCP積累。產生這種差異的原因可能是由于1-MCP氣體自由擴散緩慢造成。在本研究中，樂扣盒模擬試驗中使用微型風扇是為了使盒內1-MCP氣體均勻分布，而在核桃包裝試驗中則未使用。筆者在預試驗中曾經(jīng)開展二氧化氯保鮮劑對蘋果的保鮮研究，試驗中發(fā)現(xiàn)靠近二氧化氯藥包的蘋果表皮受到氧化導致斑點變大、產生褐變，而遠離藥包的蘋果則未受到影響，這也說明二氧化氯氣體在包裝袋內擴散并不均勻。本研究結果顯示，僅靠氣體自由擴散無法在短時間內使1-MCP氣體分布均勻，造成貯藏環(huán)境中的濃度與計劃使用的濃度存在一定差異。這種不同位置1-MCP積累濃度的差異是否會對果蔬的保鮮效果產生影響有待進一步研究證實。另外，由于一定時間內1-MCP氣體在密封保鮮袋內的自由擴散不均勻，藥包附近過高濃度的1-MCP氣體是否會對果蔬的貯藏品質產生負面影響亦有待進一步研究。