枳椇子總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

謝三都，陳惠卿,2，張 穎，趙雅彬

（1.閩南科技學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362332；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350001）

枳椇子（Hovenia acerba Lindl.）為鼠李科枳椇屬植物，異名有枳棗、木蜜、拐棗等[1]。研究表明，枳椇子富含黃酮類物質(zhì)、生物堿類、皂苷和糖苷類等活性成分[2]，具有解酒、保護(hù)肝臟、抗脂質(zhì)過氧化、抗衰老等功效[3-5]。因此，枳椇子備受科研界關(guān)注。

黃酮類化合物屬于自然界中分布較廣的酚類物質(zhì)，為植物生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，主要包括黃烷-3-醇、花色苷和黃酮，是一種天然抗氧化劑[6-9]。黃酮類化合物難溶于水，不具揮發(fā)性，易溶于有機(jī)溶劑和稀堿液，常見的提取方法有醇提法、堿法、有機(jī)溶劑萃取法、微波輔助提取、超聲波輔助提取等[10-12]。其中，醇提法具有產(chǎn)物雜質(zhì)少、提取率高、對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。本文以枳椇子為原料，采用醇提法提取黃酮類化合物，在考察乙醇濃度、料液比、浸提溫度和時(shí)間對(duì)枳椇子總黃酮提取效果影響的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其提取工藝條件；同時(shí)，以茶多酚為陽性對(duì)照，通過探討枳椇子總黃酮對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除效果來評(píng)價(jià)其體外抗氧化性能，以期為進(jìn)一步利用枳椇子資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

枳椇子：購(gòu)于東南醫(yī)藥連鎖店；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鄰二氮菲、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、七水合硫酸亞鐵、30%雙氧水、無水乙醇、對(duì)氨基苯磺酸、濃鹽酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS)、過硫酸鉀、茶多酚、鹽酸萘乙二胺等均為分析純：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

721型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；RV10型數(shù)顯旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；LGJ-12型真空冷凍干燥機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；JSP-100型高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠；SHB-B95A型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FA2004型電子天平：上海衡平儀器儀表廠；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋：齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枳椇子總黃酮的提取工藝流程

枳椇子粉碎、過80目篩，40℃下烘干至恒重→乙醇溶液恒溫浸提→提取液過濾除渣→濾液真空濃縮→濃縮液冷凍干燥→凍干品冷藏儲(chǔ)存。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品參照文獻(xiàn)[15]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：

如圖1所示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=1.239 4x+0.002 5，決定系數(shù)R2=0.999 5，說明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.3 枳椇子總黃酮提取率的測(cè)定

參照“1.2.2”方法，準(zhǔn)確稱取一定量的枳椇子總黃酮凍干粉，溶于相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，用25 mL的容量瓶定容，充分搖勻后常溫靜置30 min，同時(shí)以相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液代替樣品做空白試驗(yàn)。按以下公式計(jì)算枳椇子總黃酮提取率：

式中，C為提取液中總黃酮的濃度，mg/mL；V為樣品溶液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為枳椇子粉末的質(zhì)量，g。

1.2.4 枳椇子總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.2.4.1 料液比的篩選

準(zhǔn)確稱取0.5 g枳椇子粉末，分別按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）的比例加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液，在60℃下恒溫水浴提取10 min，抽濾除渣，濾液冷凍干燥；取一定量的枳椇子總黃酮凍干粉溶于體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)方法測(cè)定枳椇子總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.2.4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的篩選

準(zhǔn)確稱取0.5 g枳椇子粉末，按料液比1∶80（g/mL）的比例分別加入體積分?jǐn)?shù)為0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，在60℃下恒溫水浴提取10 min，抽濾除渣，濾液冷凍干燥；取一定量枳椇子總黃酮凍干粉溶于相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)方法測(cè)定枳椇子總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.2.4.3 浸提溫度的篩選

準(zhǔn)確稱取0.5 g枳椇子粉末，按料液比1∶80（g/mL）的比例加入體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液，分別在30、40、50、60、70、80、90℃下恒溫水浴提取10 min，抽濾除渣，濾液冷凍干燥；取一定量的枳椇子總黃酮凍干粉溶于體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)方法測(cè)定枳椇子總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.2.4.4 浸提時(shí)間的篩選

準(zhǔn)確稱取0.5 g枳椇子粉末，按料液比1∶80（g/mL）的比例加入體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液，在50℃下分別恒溫水浴提取5、10、15、20、25、30 min，抽濾除渣，濾液冷凍干燥；取一定量的枳椇子總黃酮凍干粉溶于體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)方法測(cè)定枳椇子總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.2.4.5 乙醇浸提法提取枳椇子總黃酮的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以枳椇子總黃酮提取率為考察指標(biāo)，探討料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、浸提溫度（C）和浸提時(shí)間（E）對(duì)枳椇子總黃酮提取效果的影響，采用五因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L16(45)優(yōu)化枳椇子總黃酮的提取工藝條件，因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.5 枳椇子總黃酮抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 茶多酚溶液的制備

參照文獻(xiàn)[16]中茶多酚溶液的制備方法，具體如下：準(zhǔn)確稱取1.00 g的茶多酚，用蒸餾水溶解后定容至500 mL，制備成2.0 mg/mL的茶多酚溶液，并稀釋成所需要各濃度的茶多酚溶液，備用。

1.2.5.2 枳椇子總黃酮對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定

以茶多酚作為陽性對(duì)照，參考陳紅梅等[17]文獻(xiàn)中所述羥自由基清除率的測(cè)定方法，研究不同濃度枳椇子總黃酮清除羥自由基的性能，重復(fù)3次。

1.2.5.3 枳椇子總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

以茶多酚作為陽性對(duì)照，參考楊喆等[18]文獻(xiàn)中所述超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定方法，研究不同濃度枳椇子總黃酮清除超氧陰離子自由基的性能，重復(fù)3次。

1.2.5.4 枳椇子總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

以茶多酚作為陽性對(duì)照，參考韋獻(xiàn)雅等[19]文獻(xiàn)中所述DPPH自由基清除率的測(cè)定方法，研究不同濃度枳椇子總黃酮清除DPPH自由基的性能，重復(fù)3次。

1.2.5.5 枳椇子總黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定

以茶多酚作為陽性對(duì)照，參考Campos等[20]文獻(xiàn)中所述ABTS自由基清除率的測(cè)定方法，研究不同濃度枳椇子總黃酮清除ABTS自由基的性能，重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表，采用SPSS 23.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枳椇子總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 枳椇子總黃酮提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 料液比對(duì)枳椇子總黃酮提取率的影響

如圖2所示，枳椇子總黃酮提取率隨30%乙醇溶液添加量的增大整體呈現(xiàn)先緩慢上升后趨于平穩(wěn)的現(xiàn)象。當(dāng)料液比為1∶50（g/mL）時(shí)枳椇子總黃酮提取率雖達(dá)到最高值（2.86%±0.024%），但與料液比為1∶40（g/mL）時(shí)枳椇子總黃酮提取率無顯著差異；同時(shí)，料液比為1∶40（g/mL）與料液比為1∶30（g/mL）、1∶60（g/mL）時(shí)枳椇子總黃酮提取率無顯著差異，但極顯著高于料液比為1∶10（g/mL）、1∶20（g/mL）時(shí)枳椇子總黃酮提取率（P＜0.01）。這是由于增加溶劑加大了濃度差，有利于植物細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)進(jìn)入溶劑，從而使枳椇子總黃酮提取率增加[21]；而隨著溶劑量的繼續(xù)增加，總黃酮基本都已溶出，提取率不再有顯著變化[22]。因此，綜合考慮料液比宜選擇1∶40（g/mL）。

2.1.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)枳椇子總黃酮提取率的影響

如圖3所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，枳椇子總黃酮提取率呈現(xiàn)先顯著升高后顯著下降的現(xiàn)象。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，枳椇子總黃酮提取率達(dá)到最高值（3.10%±0.044%），與乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)枳椇子總黃酮提取率（3.05%±0.030%）無顯著差異，但極顯著高于其他各組（P＜0.01）。一方面，乙醇體積分?jǐn)?shù)不同其極性亦不同，枳椇子總黃酮的極性可能與體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液最為接近，根據(jù)相似相溶原理，黃酮類化合物在此時(shí)能最大限度地從固體載體中轉(zhuǎn)移到溶液中，故溶解度最高[23]；另一方面，植物組織中含有多種醇溶性物質(zhì)，如色素、精油等，而高濃度的乙醇溶液會(huì)增加這些成分的溶出量，使之同黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)乙醇-水分子體系，從而表現(xiàn)為總黃酮提取率在保持平衡一段時(shí)間后出現(xiàn)下降的現(xiàn)象[24]。因此，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)宜選擇40%。

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)枳椇子總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of different ethanol concentrations on extraction rates of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.

2.1.1.3 浸提溫度對(duì)枳椇子總黃酮提取率的影響

如圖4所示，隨著浸提溫度的上升，枳椇子總黃酮提取率呈現(xiàn)先緩慢上升后急劇下降的趨勢(shì)。當(dāng)浸提溫度為40℃時(shí)，枳椇子總黃酮提取率達(dá)到最高值（3.62%±0.111%），極顯著高于其他各組（P＜0.01）。黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)在高溫作用下會(huì)被破壞，且高溫也會(huì)使乙醇揮發(fā)，濃度下降，表現(xiàn)為總黃酮提取率下降[25]。因此，浸提溫度選擇40℃左右為宜。

圖4 不同浸提溫度對(duì)枳椇子總黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of different extraction temperatures on extraction rates of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.

2.1.1.4 浸提時(shí)間對(duì)枳椇子總黃酮提取率的影響

如圖5所示，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，枳椇子總黃酮提取率呈先顯著升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)浸提時(shí)間為10 min時(shí)，枳椇子總黃酮提取率達(dá)到最大值（3.29%±0.051%）。延長(zhǎng)浸提時(shí)間，溶劑對(duì)溶質(zhì)的溶脹和滲透作用有助于黃酮類物質(zhì)向溶劑擴(kuò)散，提取率上升；但過度延長(zhǎng)浸提時(shí)間，可能存在黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞[26]或枳椇子中的其他物質(zhì)影響了黃酮類物質(zhì)的溶出[27]。因此，浸提時(shí)間以10 min為宜。

2.1.2 乙醇浸提法提取枳椇子總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果

乙醇浸提法提取枳椇子總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析，比較各列的極差結(jié)果R值可知，RA＞RB＞RC＞RE，即各因素對(duì)枳椇子總黃酮提取率的影響程度大小為：料液比（A）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）＞浸提溫度（C）＞浸提時(shí)間（E），即在試驗(yàn)所設(shè)定的因素水平中，料液比對(duì)枳椇子總黃酮提取率的影響最大，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)和浸提溫度，浸提時(shí)間的影響程度最小。正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表3所示，根據(jù)表中F值大小可知，F(xiàn)A＞FB＞FC＞FE，這與表2極差分析結(jié)果相一致；顯著性分析表明，料液比在α=0.1水平上對(duì)枳椇子總黃酮提取率的影響顯著，其他因素影響不顯著。通過對(duì)表2中K值的比較可知，A3B2C2E3為最優(yōu)組合，即料液比1∶50（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，浸提溫度40℃，浸提時(shí)間15 min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

為驗(yàn)證最優(yōu)工藝的有效性，以最優(yōu)組合提取枳椇子總黃酮，重復(fù)3次，所得枳椇子總黃酮提取率為4.52%±0.043%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.009 5%，表明該提取工藝條件穩(wěn)定可行。

2.2 枳椇子總黃酮抗氧化性能的試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 枳椇子總黃酮清除羥自由基能力如圖6所示，枳椇子總黃酮對(duì)羥自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大而加強(qiáng)，且不同濃度枳椇子總黃酮對(duì)羥自由基清除率的影響差異極顯著（P＜0.01），這與陳紅梅等[17]和李玲等[28]對(duì)黃酮類物質(zhì)抗氧化性能的研究結(jié)果相一致，表明枳椇子總黃酮對(duì)羥自由基的清除效果呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。質(zhì)量濃度為0.39 mg/mL的枳椇子總黃酮對(duì)羥自由基清除率極顯著高于0.2 mg/mL茶多酚對(duì)羥自由基的清除率（P＜0.01），但極顯著低于0.25 mg/mL的茶多酚對(duì)羥自由基的清除率（P＜0.01），表明枳椇子總黃酮對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖6 不同濃度枳椇子總黃酮對(duì)羥自由基清除能力的影響Fig.6 Effects of different concentrations of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.on hydroxyl radical scavenging capacities

2.2.2 枳椇子總黃酮清除超氧陰離子自由基能力

如圖7所示，枳椇子總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增大而顯著加強(qiáng)，且不同濃度枳椇子總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響差異極顯著（P＜0.01），這與前人關(guān)于植物黃酮類物質(zhì)對(duì)超氧陰離子的清除能力研究結(jié)果相一致[29-31]，表明枳椇子總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。當(dāng)枳椇子總黃酮質(zhì)量濃度為0.706 mg/mL時(shí)，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除率極顯著高于0.5 mg/mL的茶多酚（P＜0.01），表明枳椇子總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖7 不同濃度枳椇子總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的影響Fig.7 Effects of different concentrations of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.on superoxide radical scavenging capacities

2.2.3 枳椇子總黃酮清除DPPH自由基能力

如圖8所示，枳椇子總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大而加強(qiáng)，當(dāng)濃度＜0.045 mg/mL時(shí)，不同濃度枳椇子總黃酮對(duì)DPPH自由基清除率的影響差異極顯著（P＜0.01），表明枳椇子總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除效果呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。因?yàn)辄S酮類化合物分子和茶多酚中均含有具備供氫能力的酚性羥基，當(dāng)孤對(duì)電子與還原態(tài)氫進(jìn)行配對(duì)時(shí)，ABTS·即被還原形成DPPH-H，表現(xiàn)出顯著的抗氧化能力[32]，當(dāng)枳椇子總黃酮質(zhì)量濃度為0.045 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率與1.5 mg/mL的茶多酚無顯著差異，表明了枳椇子總黃酮對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖8 不同濃度枳椇子總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig.8 Effects of different concentrations of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.on DPPH radical scavenging capacities

2.2.4 枳椇子總黃酮清除ABTS自由基能力

如圖9所示，隨著質(zhì)量濃度的升高，枳椇子總黃酮對(duì)ABTS自由基清除率呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)的趨勢(shì)，且不同濃度枳椇子總黃酮對(duì)ABTS自由基清除率的影響差異極顯著（P＜0.01），表明枳椇子總黃酮對(duì)ABTS自由基的清除效果呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。不同于供氫清除DPPH自由基，ABTS自由基被抗氧化劑清除的過程是電子轉(zhuǎn)移過程，而黃酮類化合物和茶多酚均具備較強(qiáng)電子供應(yīng)能力[33]，當(dāng)枳椇子總黃酮質(zhì)量濃度為0.082 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS自由基的清除率與0.15 mg/mL的茶多酚無顯著差異，表明枳椇子總黃酮對(duì)ABTS自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖9 不同濃度枳椇子總黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力的影響Fig.9 Effects of different concentrations of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.on ABTS radical scavenging capacities

3 結(jié)論

本研究采用乙醇浸提法提取枳椇子總黃酮，其最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶50（g/mL），浸提溫度40℃，浸提時(shí)間15 min，在此工藝條件下枳椇子總黃酮提取率為4.52%±0.043%，其對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基和ABTS自由基均具有清除效果，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，試驗(yàn)結(jié)果為制備具有抗氧化能力的枳椇子總黃酮及其應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。