蘭 璞,紀(jì)海鵬,賈 凝,張 娜,于晉澤,董成虎,3,*
(1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,天津 300384;2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所(國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工
程技術(shù)研究中心(天津)),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300384;3.天津市興有果蔬種植專(zhuān)業(yè)合作社,天津 301714)
大蒜(AlliumsativumL.)也稱(chēng)為蒜頭、大蒜頭、胡蒜,是蒜類(lèi)植物的統(tǒng)稱(chēng)[1],為半年生草本植物,屬百合科蔥屬,以鱗莖入藥。從古至今埃及、中國(guó)、日本等一直用大蒜治療多種疾病。大蒜是秦漢時(shí)從西域傳入我國(guó),經(jīng)人工栽培繁育,具有抗癌功效,深受大眾喜食[2]。大蒜呈扁球形或短圓錐形,外層是灰白色或淡棕色膜質(zhì)鱗皮,剝?nèi)[葉,內(nèi)有6~10個(gè)蒜瓣,輪生于花莖的周?chē)o基部盤(pán)狀,生有多數(shù)須根,有濃烈的蒜臭,味辛辣,有刺激性氣味,可食用或供調(diào)味。目前我國(guó)大蒜主要栽培品種有:山東蒼山大蒜品種群、吉林白馬芽、山東金鄉(xiāng)白蒜、江蘇太倉(cāng)白蒜、陜西蔡家坡紫皮蒜、黑龍江阿城大蒜、天津?qū)氎娲笏獾取1狙芯克x試材為天津?qū)氎娲笏?,?瓣為主,蒜瓣在莖盤(pán)上圍成一輪,蒜皮為紫紅色,蒜瓣潔白、均勻,鮮嫩多汁,口感辛辣,脆香濃郁,肉質(zhì)肥厚[3]。大蒜傳統(tǒng)的貯藏方法有掛藏法、堆藏法、埋藏法、輻射貯藏和化學(xué)藥劑處理貯藏[4]。目前市場(chǎng)上流通的大蒜主要是干蒜,源于其耐貯性。事實(shí)上新鮮大蒜口感更為鮮美,適于鮮食,但不易保存,在貯運(yùn)過(guò)程中易受微生物污染,導(dǎo)致蒜瓣失水干縮、腐敗發(fā)芽、易霉化軟爛等問(wèn)題發(fā)生,使鮮蒜的品質(zhì)和商品價(jià)值受到影響。
目前果蔬的貯藏保鮮方法主要有低溫、臭氧、1-甲基環(huán)丙烯(1-Methylcyclopropene,1-MCP)、涂膜、煙霧劑保鮮等。曹琳等[5]研究表明:臭氧處理大蒜可有效抑制赤霉、橘青霉等的生長(zhǎng)發(fā)育,改變菌體形態(tài)。張靜林等[6]采用30 mg/m3臭氧對(duì)脫水蒜片進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)蒜片中菌落總數(shù)得到顯著抑制,且不影響蒜片內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分。姜楠等[7]發(fā)現(xiàn)采用臭氧處理后的交鏈孢菌對(duì)生物活性的不良影響顯著降低,同時(shí)發(fā)現(xiàn)適宜濃度的臭氧處理能夠降解交鏈孢菌的多種芽孢菌,使得毒力得以顯著降低。臭氧由于具有強(qiáng)氧化性且使用后無(wú)殘留,被廣泛應(yīng)用于食品加工車(chē)間食品表面殺菌、防腐保鮮等多個(gè)領(lǐng)域[8]。臭氧處理果蔬,既有可靠的殺菌保鮮效果,又沒(méi)有任何有害殘留[9-10]。冷藏或氣調(diào)貯藏配合臭氧處理是一項(xiàng)新型的果蔬保鮮方式[11]。根據(jù)臭氧在果蔬貯藏的研究報(bào)道,明確得到的結(jié)論是隨貯藏庫(kù)溫度升高或相對(duì)濕度增加,臭氧的分解速率明顯加快[12]。每年的冬季市面上大多為干蒜,鮮有可口的鮮蒜,因此本研究主要以貯藏5個(gè)月的寶坻鮮蒜為試材,進(jìn)一步探索驗(yàn)證貯藏后期鮮蒜的主要致病微生物和致病微生物控制方法,以期獲得新鮮的大蒜病害控制技術(shù),滿足廣大消費(fèi)者對(duì)鮮蒜食用需求。
1.1.1 材料與試劑
材料:貯藏后期的寶坻鮮蒜,于2019年5月購(gòu)買(mǎi),鮮蒜購(gòu)買(mǎi)時(shí)含水量為64~66 g/100 g。挑選整理后用長(zhǎng)1 m、寬0.6 m、厚度0.05 mm的鮮蒜專(zhuān)用PE袋包裝,每袋15 kg置于冷庫(kù)的架子上,貯藏溫度(0±0.5)℃,相對(duì)濕度(RH)90%~95%,至2019年12月之后開(kāi)始出現(xiàn)輕微發(fā)霉現(xiàn)象,挑選表面已霉變或產(chǎn)生霉變趨勢(shì),甚至生長(zhǎng)出病原菌的鮮蒜進(jìn)行致病微生物的分離鑒定,對(duì)分離的菌株進(jìn)行鮮蒜反接種及分離純化,并采用臭氧處理進(jìn)行鮮蒜主要致病菌的抑制試驗(yàn)。
瓊脂粉,北京奧博星生物化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品;葡萄糖,天津市科威有限公司產(chǎn)品;土豆,購(gòu)于天津市西青區(qū)物美超市。
1.1.2 儀器與設(shè)備
VS-1300-V型超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;SPX-250B智能生化培養(yǎng)箱,上?,槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;氣調(diào)冷庫(kù),意大利Isolcell公司;557115游標(biāo)卡尺,艾威博爾研發(fā)制造有限公司;BX51TF攝像顯微鏡,日本Olympus公司。
1.2.1 培養(yǎng)基的配制
采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)培養(yǎng)大蒜的病害組織,即去皮馬鈴薯200 g,瓊脂15~20 g,葡萄糖20 g,超純水1 000 mL。
1.2.2 大蒜病原真菌的分離流程
冷藏條件下獲取發(fā)病大蒜→無(wú)菌環(huán)境下分離大蒜病害組織→PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)病害組織→鏡檢→培養(yǎng)基上多次純化→獲得單菌落菌株→鏡檢→確定病原菌[13-14]
1.2.3 大蒜病原真菌菌落形態(tài)觀察及分離鑒定
觀察分離培養(yǎng)基平板上菌落的形態(tài),包括形狀、色澤、大小、菌絲特征[15-16];將單菌落的病原菌制片后無(wú)需染色直接在4倍、10倍、20倍和40倍目鏡下觀察菌絲形態(tài)和孢子形狀,記錄觀察結(jié)果并拍照[17];分離純化后的菌種經(jīng)過(guò)反接種試驗(yàn)來(lái)確定其致病性,如果發(fā)病癥狀與貯藏中的腐爛癥狀相同[18-19],作為采后病害病原菌進(jìn)一步鑒定到屬種,分離鑒定方法參照《真菌鑒定手冊(cè)》等書(shū)籍[20-23]。
1.2.4 主要病原菌回接與臭氧處理
在無(wú)菌環(huán)境下切分發(fā)病鮮蒜病斑與健康組織交界處(1 cm×1 cm)后置于PDA培養(yǎng)基上,隨后放入培養(yǎng)箱中,設(shè)定培養(yǎng)箱環(huán)境為25℃。在已培養(yǎng)好的平板上打孔取菌餅,將菌餅置于新培養(yǎng)基中央繼續(xù)培養(yǎng),重復(fù)3次后得到純化病原菌,采用菌液法[22]制備孢子懸浮液。
將主要病原菌侵染回接至已消毒的健康鮮蒜上,采用刺傷接種法[14],使用無(wú)菌針在鮮蒜赤道部位制造傷口(大小約為4 mm×4 mm),將10μL孢子液注入傷口,被接種的鮮蒜貯藏在不同溫度(0、25℃)條件下通過(guò)不同濃度(17.152、21.44 mg/m3)的臭氧氣體熏蒸處理,每天進(jìn)行不同時(shí)間(12、18 h)臭氧處理,共貯藏7 d。
每天隨機(jī)取樣,采用“十字交叉法”測(cè)量鮮蒜表面菌落的直徑,每次取各處理組10個(gè)鮮蒜進(jìn)行測(cè)定,每次測(cè)定重復(fù)3次。選擇25℃旨在模擬室溫貨架溫度,同時(shí)將不同溫度下不作其他處理的接種大蒜作為空白對(duì)照組(CK)[24-25]。
1.2.5 數(shù)據(jù)處理
使用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)與作圖,使用SPSS 20.0軟件用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。
在本試驗(yàn)的冷藏條件下貯藏半年后,鮮蒜表面出現(xiàn)病斑。分離出鮮蒜的病變組織,并用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察后,通過(guò)劃線法分離,經(jīng)過(guò)多次純化后,得出單菌落菌株,分別鏡檢,確定鮮蒜的病原菌。
如圖1A所示,分生孢子呈紡錘狀或倒棒狀,頂端延長(zhǎng)成喙?fàn)?,多?xì)胞,有壁磚狀分隔,分生孢子常數(shù)個(gè)成鏈。根據(jù)菌落細(xì)胞的形態(tài)特征,確定為交鏈孢綱中的交鏈孢屬(Alternaria),容易引起新鮮大蒜發(fā)生黑斑病[26-27]。
圖1 3種致病真菌形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of three pathogenic fungi
如圖1B所示,菌絲頂端分枝形如掃帚,有橫隔,其分生孢子梗經(jīng)多次分枝,產(chǎn)生幾輪對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)的小梗,分生孢子呈球形、橢圓形或短柱形,光滑或粗糙。根據(jù)菌落細(xì)胞的形態(tài)特征,確定為半知菌亞門(mén)絲孢中的產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum),易引起大蒜發(fā)生黃青霉病[13]。
如圖1C所示,分生孢子梗直立、透明、光滑,分生孢子透明、光滑,多數(shù)長(zhǎng)圓形,亦有擬橢圓形、卵圓形或不規(guī)則長(zhǎng)圓形孢子,或多或少呈平行的,或不同角度的傾斜排列。根據(jù)菌落細(xì)胞形態(tài)特征,確定為青霉屬中的斜鏈擬青霉(PaecilomycescateniobliquusLiang),易引起大蒜黑霉病[13,25]。
通過(guò)鮮蒜致病微生物分離鑒定出的致病菌,結(jié)合貯藏后期鮮蒜發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)得出其發(fā)病指數(shù),發(fā)現(xiàn)冷庫(kù)貯藏鮮蒜中交鏈孢霉的發(fā)病率最高,為69.3%,而觀測(cè)發(fā)現(xiàn)致病菌產(chǎn)黃青霉、斜鏈擬青霉在低溫冷藏條件下的發(fā)病率較低,分別為24.7%和17.9%,即控制交鏈孢霉的生長(zhǎng)能夠影響庫(kù)內(nèi)大部分鮮蒜霉變,且臭氧抑制交鏈孢屬效果已有研究表明有效[5]。為此本研究以分離純化的交鏈孢霉在不同臭氧處理?xiàng)l件下的生長(zhǎng)情況作比較分析,通過(guò)測(cè)量菌落在臭氧處理后的環(huán)境中生長(zhǎng)大小的直徑判定臭氧對(duì)其控制作用。
2.2.1 0℃下不同濃度臭氧處理12 h對(duì)鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長(zhǎng)的影響
由圖2可見(jiàn),在0℃下,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),鮮蒜表面的菌落直徑呈增大的變化趨勢(shì)。整個(gè)貯藏期內(nèi),空白對(duì)照組菌落直徑始終顯著高于臭氧處理組(P<0.05)。可見(jiàn)與同溫度下未經(jīng)處理的空白對(duì)照組相比,臭氧濃度為17.152 mg/m3和21.44 mg/m3下處理12 h的交鏈孢霉生長(zhǎng)速度得到了明顯的抑制,且21.44 mg/m3臭氧處理組比17.152 mg/m3臭氧處理組的菌落直徑更小。所以在相同溫度(0℃)和處理時(shí)間(12 h)下,臭氧處理的濃度越大,菌落生長(zhǎng)更為緩慢,抑菌效果更好,且證實(shí)了0℃下臭氧處理對(duì)交鏈孢霉的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。
圖2 0℃下不同濃度臭氧處理12 h對(duì)鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.2 Effects of ozone treatments with different concentrations at 0℃for 12 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic
2.2.2 0℃下不同濃度臭氧處理18 h對(duì)鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長(zhǎng)的影響
如圖3所示,在0℃下,空白對(duì)照組和臭氧處理組鮮蒜表面菌落直徑在整個(gè)貯藏過(guò)程中均呈上升趨勢(shì)。其中,對(duì)照組在整個(gè)貯藏過(guò)程中菌落直徑顯著高于臭氧處理組(P<0.05),可見(jiàn)與同溫度下未經(jīng)處理的空白對(duì)照組比較,在臭氧濃度為17.152 mg/m3和21.44 mg/m3下處理18 h的菌落生長(zhǎng)速度得到了明顯的抑制。且在相同溫度(0℃)和處理時(shí)間(18 h)下,21.44 mg/m3比17.152 mg/m3臭氧濃度處理菌落生長(zhǎng)更為緩慢,抑菌效果更好。證實(shí)了在0℃下臭氧處理對(duì)交鏈孢霉的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。
圖3 0℃下不同濃度臭氧處理18 h對(duì)鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.3 Effects of ozone treatments with different concentrations at 0℃for 18 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic
2.2.3 25℃下不同濃度臭氧處理12 h對(duì)鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長(zhǎng)的影響
由圖4可以看出,自接種第3天后,17.152 mg/m3組的菌落直徑與空白對(duì)照組出現(xiàn)差異,而21.44 mg/m3組于接種第2天后差異逐漸明顯。與同溫度下未經(jīng)處理的空白對(duì)照組相比,臭氧濃度為17.152 mg/m3和21.44 mg/m3處理12 h下交鏈孢霉的生長(zhǎng)速度得到了明顯的抑制。25℃貯藏溫度下,接種5 d后菌落迅速布滿果實(shí)表面,同時(shí)菌落創(chuàng)面軟化塌陷嚴(yán)重,已無(wú)法繼續(xù)觀測(cè),故不再進(jìn)行量取。貯藏3 d后在相同溫度(25℃)和處理時(shí)間(12 h)下,17.152 mg/m3臭氧處理組比21.44 mg/m3組菌落直徑小,可見(jiàn)17.152 mg/m3臭氧處理組比21.44 mg/m3處理組抑菌效果更為有效。
圖4 25℃下不同濃度臭氧處理12 h對(duì)鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.4 Effects of ozone treatments with different concentrations at 25℃for 12 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic
2.2.4 25℃下不同濃度臭氧處理18 h對(duì)鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長(zhǎng)的影響
由圖5可以看出,在25℃下,臭氧濃度為21.44 mg/m3處理18 h與同溫度下未經(jīng)處理的空白對(duì)照組菌落生長(zhǎng)情況基本一致,并未出現(xiàn)較明顯的抑制作用。同時(shí),21.44 mg/m3臭氧處理組菌落直徑與對(duì)照組之間差異較小。而17.152 mg/m3臭氧處理組貯藏第2、4、5天的菌落直徑顯著低于其他兩組(P<0.05)。證實(shí)臭氧熏蒸處理能抑制鮮蒜表面病斑直徑的擴(kuò)大,最終觀測(cè)菌落直徑發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在0℃下還是25℃下,17.152 mg/m3臭氧都對(duì)交鏈孢霉產(chǎn)生了抑制作用,而且這種抑制在0℃下更為明顯。
圖5 25℃下不同濃度臭氧處理18 h對(duì)鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.5 Effects of ozone treatments with different concentrations at 25℃for 18 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic
由于臭氧只作用在鮮蒜表面,因此貯藏室內(nèi)存放的鮮蒜之間必須留有一定的間隙,使臭氧充分發(fā)揮作用。臭氧處理作為一種殺菌保鮮方法[28],也有其局限性,表現(xiàn)在以下幾方面:一是當(dāng)果蔬處于密封包裝情況下,冷庫(kù)使用臭氧保鮮機(jī)保鮮時(shí)效果并不太理想;二是由于高濃度臭氧對(duì)人的眼睛、皮膚、呼吸道具有極強(qiáng)的刺激作用[29],所以貯藏室的消毒應(yīng)在無(wú)人的情況下進(jìn)行;三是臭氧濃度并不是越高越好,臭氧使用濃度太大,會(huì)引起果蔬表面質(zhì)膜損害,使其透性增大、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲,導(dǎo)致品質(zhì)下降,甚至加速果蔬的衰老和腐敗等[30]。
本試驗(yàn)從0℃下貯藏后期鮮蒜上分離鑒定出3種致病菌,分別為交鏈孢屬(Alternaria)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)和斜鏈擬青霉(Paccilomyces cateniobliquusLiang),且根據(jù)發(fā)病情況確定交鏈孢霉是貯藏期鮮蒜的主要致病菌。在0℃下,21.44 mg/m3臭氧處理抑制交鏈孢霉生長(zhǎng)比17.152 mg/m3臭氧處理更加明顯;而在25℃下,17.152 mg/m3臭氧處理組卻比21.44 mg/m3組抑制效果好。當(dāng)處理環(huán)境溫度相同,臭氧處理濃度也相同的情況下,處理12 h比處理18 h對(duì)霉菌的生長(zhǎng)速度抑制效果要好。且在臭氧濃度相同、處理時(shí)間也相同的情況下,0℃組比25℃組交鏈孢霉生長(zhǎng)情況得到更加明顯的抑制??梢?jiàn),溫度對(duì)鮮蒜上交鏈孢霉抑菌效果的影響很大。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,0℃下21.44 mg/m3臭氧處理12 h對(duì)鮮蒜中主要病原菌交鏈孢霉的抑菌效果最好。