北沙參提取物(EEAR)通過miR-34a-5p/PEG10對肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響

金浩 余佳 王梓瑜 喬鷗 王軍 韓江 李兆連

(1云南省第一人民醫(yī)院，云南 昆明 650032；2昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科；3武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科)

肝癌是世界上常見的癌癥之一，90%的肝細(xì)胞癌發(fā)生于肝硬化〔1〕。肝細(xì)胞癌主要采用外科(切除、肝移植)、局部(消融和栓塞治療)等治療方法〔2〕，但是肝癌復(fù)發(fā)率高，導(dǎo)致患者生存期短、生存質(zhì)量較差，晚期肝癌患者通常采用中藥綜合治療，改善患者生存質(zhì)量，延長生存期〔3〕。研究中藥抑癌的機(jī)制，成為基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。

北沙參是傘形科珊瑚菜的干燥根，有養(yǎng)陰清肺、益胃生津之功效,主要用于肺熱，燥咳，勞嗽痰血，熱病津傷口渴〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)北沙參提取物對肝癌、肺癌細(xì)胞有一定的抑制作用〔5〕，其可抑制肺癌細(xì)胞增殖侵襲能力〔6〕，在腫瘤臨床治療上有一定的應(yīng)用價值。遺傳印記基因(PEG)10在大多數(shù)肝癌組織中特異性高表達(dá)，沉默PEG10表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞生長〔7〕。miR-34家族在細(xì)胞中參與調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移等生物行為，其與腫瘤關(guān)系密切，且發(fā)現(xiàn)miR-34在肝癌細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)〔8,9〕。miR34和PEG10在肝癌中都有很重要的作用，而北沙參提取物抑制肝癌的機(jī)制是否與前述兩者有關(guān)，尚未可知。

本研究以北沙參提取物(EEAR)處理肝癌細(xì)胞，研究EEAR對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及miR-34a-5p和PEG10在此機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H購自ATCC；杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)液(DMEM)高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，抗PEG10抗體和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自Abcam公司；胰蛋白酶Trypsin、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma-Aldrich公司；Total RNA提取試劑盒、Real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；流式法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，發(fā)光儀、全自動酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 細(xì)胞培養(yǎng)：將MHCC97-H細(xì)胞接種于含10% FBS、1% 青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于濕度95%、37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至融合為一層時，Trysin消化，傳代。

藥物處理：北沙參提取物EEAR根據(jù)文獻(xiàn)〔4〕的方法進(jìn)行提取，用水溶解后配成不同濃度。待細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，收集細(xì)胞，稀釋，以1×104個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入50 μl不同濃度(300.000、150.000、75.000、37.500、18.750、9.375 μg/ml)的北沙參提取物EEAR，對照用PBS代替EEAR，培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的MHCC97-H細(xì)胞，消化稀釋，以每孔2×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合為一層時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體Lipofectamine2000和各組載體，取等體積脂質(zhì)體和載體混合，室溫孵育20 min，加入到培養(yǎng)好的細(xì)胞孔板中，培養(yǎng)6 h，換成高糖DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行實驗。

1.4Real-time PCR檢測mRNA的表達(dá) 收集EEAR處理或轉(zhuǎn)染48 h的各組MHCC97-H細(xì)胞，按照Total RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板按照Real-time PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95℃ 4 min；95℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃ 35 s，40個循環(huán)；72℃ 10 min。miR-34a-5p 上游引物 5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3′，下游引物 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；PEG10 上游引物 5′-AACAACAACAACAACTCCAAGC-3′，下游引物 5 ′-TCTGCACCTGGCTCTGCAG-3′;GAPDH 上游引物5′-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3′，下游引物5′-GGTCCACCACTGACACGTTG-3′。運(yùn)用Bio-Rad PCR檢測系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，經(jīng)內(nèi)參照GAPDH進(jìn)行校正。

1.5MTT實驗測定細(xì)胞生存率 收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MHCC97-H細(xì)胞，接種于95-6微孔板，培養(yǎng)24 h，然后分別加入50 μl終濃度為75 μg/ml的EEAR后，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩5 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度(A)值，生存率(%)=實驗組A均值/control組A均值×100%。找出半數(shù)抑制濃度最佳條件。

1.6流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 各組MHCC97-H細(xì)胞經(jīng)EEAR處理或轉(zhuǎn)染后，接種于6孔板(2×104個細(xì)胞/孔)中，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)液，胰酶消化，收集細(xì)胞，按照膜聯(lián)歡蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入 200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.7Western印跡檢測蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后經(jīng)EEAR處理并培養(yǎng)48 h的各組MHCC97-H細(xì)胞，加入放射免疫沉淀裂解液(RIPA)，室溫裂解20 min，冰浴超聲破碎收集蛋白，測定蛋白濃度。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(抗PEG10 1∶500)，4℃孵育過夜，洗膜2次，加入1 000倍稀釋的二抗，室溫孵育2 h，以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1EEAR對肝癌細(xì)胞MHCC97-H中miR-34a-5p的表達(dá)及增殖、凋亡的影響 與Con組相比，EEAR組肝癌MHCC97-H細(xì)胞中miR-34a-5p表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，MHCC97-H細(xì)胞在48 h和72 h細(xì)胞增殖活性顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 EEAR對細(xì)胞 MHCC97-H、凋亡的影響

表1 EEAR對細(xì)胞MHCC97-H增殖、凋亡的影響

2.2miR-34a-5p過表達(dá)對肝癌細(xì)胞MHCC97-H增殖、凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-34a-5p組肝癌MHCC97-H細(xì)胞中miR-34a-5p表達(dá)量顯著上升，MHCC97-H細(xì)胞在48 h和72 h細(xì)胞增殖活性顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，見表2、圖2。

圖2 miR-34-5p過表達(dá)對肝癌細(xì)胞MHCC-97H凋亡的影響

表2 miR-34-5p過表達(dá)對肝癌細(xì)胞MHCC-97H增殖、凋亡的影響

2.3抑制miR-34a-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)EEAR對肝癌細(xì)胞MHCC97-H增殖、凋亡的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-34a-5p組miR-34a-5p表達(dá)量顯著下降(0.40±0.04 vs 0.13±0.02；t=18.112,P=0.000)。與Con組相比，EEAR組肝癌MHCC97-H細(xì)胞在48 h和72 h細(xì)胞增殖活性顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著上升(均P<0.05)；與anti-miR-NC+EEAR組相比，anti-miR-34a-5p+EEAR組肝癌MHCC97-H細(xì)胞在48 h和72 h細(xì)胞增殖活性顯著上升，細(xì)胞凋亡率顯著下降(均P<0.05)，見表3。

表3 抑制miR-34-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)EEAR對肝癌細(xì)胞MHCC-97H增殖、凋亡的影響

2.4miR-34a-5p靶向PEG10 通過Targetscan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PEG10的3′UTR序列中含有與miR-34a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖3。與miR-NC組相比，miR-34a-5p組野生型WT-PEG10的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)，而突變型MUT-PEG10的螢火蟲螢光素酶相對活性沒有明顯變化。見表4。Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組(1.02±0.06)相比，miR-34a-5p組PEG10表達(dá)量顯著下降(0.38±0.03，P<0.05)；與anti-miR-NC組(1.01±0.08)相比，anti-miR-34a-5p組PEG10表達(dá)量顯著上升(1.92±0.12，P<0.05)，見圖4。

圖3 PEG10的3′UTR中含有與miR-34-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-NC組，miR-34a-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-34a-5p組圖4 miR-34a-5p調(diào)控PEG10的表達(dá)

2.5EEAR對PEG10表達(dá)的影響 與Con組相比，EEAR組PEG10 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，見圖5、表5。

表5 EEAR對PEG10表達(dá)的影響

圖5 EEAR對PEG10表達(dá)的影響

2.6過表達(dá)PEG10可逆轉(zhuǎn)EEAR對肝癌細(xì)胞MHCC97-H增殖、凋亡的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PEG10組PEG10 mRNA表達(dá)量顯著上升(0.98±0.08 vs 2.13±0.22，t=14.738,P=0.000)。與Con組相比，EEAR組MHCC97-H細(xì)胞增殖活性在48 h和72 h均顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著上升(均P<0.05)；與pcDNA3.1+EEAR組相比，pcDNA3.1-PEG10+EEAR組MHCC97-H細(xì)胞增殖活性在48 h和72 h均顯著上升，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，見表6。

表6 過表達(dá)PEG10能逆轉(zhuǎn)EEAR對細(xì)胞MHCC-97H增殖、凋亡的影響

3 討 論

肝癌的主要病因是HBV、HCV感染、黃曲霉毒素、藍(lán)藻毒素、吸煙、飲酒、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高，5年相對生存率僅為12.1%〔10〕。2015年我國肝癌發(fā)病約46.6萬人，死亡42.2萬人〔11〕。中藥是肝癌治療中的重要組成部分，中藥抑制肝癌細(xì)胞增殖、抗肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等機(jī)制研究也取得很大進(jìn)展〔12〕。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，北沙參提取物具有抗腫瘤作用〔13,14〕。Cruz等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，北沙參根提取物通過增加p21和p27的誘導(dǎo)作用，抑制CDK4和細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，從而抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞在G1期的增殖。Wu等〔16〕研究表明，北沙參多糖通過下調(diào)增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞A549的遷移、增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。北沙參也可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化〔17〕。本研究發(fā)現(xiàn)，北沙參提取物EEAR能夠抑制肝癌MHCC-97H細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，證實了北沙參提取物EEAR的腫瘤抑制作用。

miR-34包括miR-34a、miR-34b、miR-34c等成員，是p53的直接靶基因，miR-34的異位表達(dá)通常誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯或衰老，并通過E2F3、SIRT1與p53形成正反饋環(huán)路，不斷增強(qiáng)與p53的作用〔18,19〕。Gao等〔20〕發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，在p53野生型結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中過表達(dá)miR-34a-5p顯著抑制了細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，而在敲除p53的細(xì)胞中則沒有這種作用，說明miR-34a-5p通過p53的誘導(dǎo)使癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯來抑制結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)。Pu等〔21〕發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p通過靶向酪氨酸激酶CD117促進(jìn)骨肉瘤(OS)對多種藥物的耐藥性。Li等〔22〕發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-34a-5p可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，降低對順鉑的耐藥性，miR-34a-5p通過靶向AXL增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對化療的敏感性。本研究結(jié)果表明，北沙參提取物EEAR能夠促進(jìn)肝癌MHCC-97H細(xì)胞中miR-34a-5p表達(dá)，過表達(dá)miR-34a-5p可抑制MHCC-97H細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；抑制miR-34a-5p表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)EEAR對MHCC-97H細(xì)胞增殖、凋亡的影響，說明EEAR通過促進(jìn)miR-34a-5p表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌。

PEG10位于人類染色體7q21.3上，是一種與腫瘤的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移有關(guān)的癌基因，在多種腫瘤中呈現(xiàn)陽性表達(dá)〔23〕。Okabe等〔24〕通過全基因組cDNA微陣列發(fā)現(xiàn)，PEG10在大多數(shù)肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)量顯著上調(diào)，抑制PEG10表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞生長，過表達(dá)PEG10則降低了細(xì)胞凋亡介質(zhì)SIAH1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，EEAR能夠抑制MHCC97-H細(xì)胞中PEG10 mRNA和蛋白表達(dá)，過表達(dá)PEG10可逆轉(zhuǎn)EEAR對MHCC-97H細(xì)胞增殖、凋亡的影響。說明EEAR通過抑制MHCC97-H細(xì)胞中PEG10的表達(dá)抑制肝癌。

另外，通過Targetscan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PEG10的3′UTR序列中含有與miR-34a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，說明兩者可能存在結(jié)合位點(diǎn)或調(diào)控關(guān)系。通過雙螢光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-34-5p靶向負(fù)調(diào)控PEG10的表達(dá)，說明EEAR通過上調(diào)miR-34a-5p靶向抑制PEG10表達(dá)，進(jìn)而抑制MHCC-97H細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究首次闡述了在肝癌MHCC97-H細(xì)胞中北沙參提取物EEAR通過miR-34a-5p抑制PEG10蛋白表達(dá)，從而抑制MHCC97-H細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。北沙參提取物對人肝癌具有潛在治療作用，本研究為人肝癌的中藥治療提供了新的思路，對中藥控制肝癌機(jī)制的基礎(chǔ)研究具有重要意義。