DLEU2靶向miR-30d-5p影響舌鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制

付娟 李娜 袁清敏

(1河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，河南 安陽 455000；2安陽市口腔醫(yī)院修復(fù)科)

舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)屬于頭頸部惡性腫瘤之一，其具有惡性程度高、高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率等病理特征，由于其具有較強(qiáng)的侵襲性導(dǎo)致患者預(yù)后不良，嚴(yán)重時還可能出現(xiàn)局部擴(kuò)散及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等〔1，2〕。因而積極探尋TSCC發(fā)生機(jī)制對早期診斷及改善患者預(yù)后均具有重要臨床意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種長度超過200 nt的非編碼RNA分子，研究表明LncRNA表達(dá)異常與TSCC細(xì)胞增殖密切相關(guān)，并可能作為TSCC生物標(biāo)志物及靶向治療靶點〔3〕。相關(guān)研究用芯片分析法獲得TSCC細(xì)胞癌組織和正常舌組織中差異表達(dá)的LncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA DLEU2在TSCC細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)〔4〕。研究表明DLEU2在宮頸癌組織及細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)DLEU2可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移能力〔5〕。DLEU2還可通過調(diào)控miR-16-1信號通路而影響喉癌細(xì)胞遷移、侵襲能力〔6〕。但DLEU2對TSCC細(xì)胞生物行為的影響及其機(jī)制目前還不清楚。研究表明TSCC組織中微小RNA-30d-5p(miR-30d-5p)的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，且miR-30d-5p的表達(dá)量與患者TNM分期、分化程度和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，抑制miR-30d-5p表達(dá)可有效抑制TSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力〔7〕。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測到miR-30d-5p可能是DLEU2作用的靶基因，DLEU2是否可通過調(diào)控miR-30d-5p表達(dá)進(jìn)而參與TSCC發(fā)生及發(fā)展過程尚未可知。因此本研究對TSCC組織中DLEU2的表達(dá)進(jìn)行分析，構(gòu)建DLEU2過表達(dá)載體上調(diào)TSCC Tca8113細(xì)胞中DLEU2的表達(dá)，探討其對TSCC細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并分析其對miR-30d-5p的調(diào)控作用，以期為TSCC早期診斷及靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實驗對象 選取2015年3月至2016年4月安陽市口腔醫(yī)院修復(fù)科收治的TSCC患者26例為研究對象，所有患者經(jīng)手術(shù)病理證實為TSCC，男15例，女11例，年齡為60～70歲，平均為(65.32±3.26)歲，收集患者臨床病理資料，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期15例；分化程度：低分化10例，中分化6例，高分化10例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者術(shù)前未接受放療或化療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；既往手術(shù)史者；患有嚴(yán)重代謝性疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及家屬知情且簽署同意書。于術(shù)中切取TSCC組織及其癌旁組織(>5 cm)，迅速放于液氮中，術(shù)后將組織標(biāo)本存放于-80℃超低溫冰箱保存。

1.1.2材料與試劑 TSCC細(xì)胞Tca8113購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合溶液均購自美國Hyclone公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；miR-30d-5p mimics及其陰性對照序列均購自上海博亞生物技術(shù)有限公司；pcDNA3.1與si-DLEU2及其陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑購自美國Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自華阜康生物科技股份有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21抗體均購自美國CST公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自美國Progema公司；細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒與電化學(xué)(ECL)發(fā)光液均購自中國碧云天生物技術(shù)研究所；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 將TSCC Tca8113細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，放入含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時用胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同對Tca8113細(xì)胞進(jìn)行分組：pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1序列)；pcDNA3.1-DLEU2組(轉(zhuǎn)染DLEU2過表達(dá)載體)；si-DLEU2組(轉(zhuǎn)染DLEU小干擾RNA序列)；si-NC組(轉(zhuǎn)染DLEU陰性對照序列)；pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組(共轉(zhuǎn)染DLEU2過表達(dá)質(zhì)粒與miR-30d-5p陰性對照)；pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p組(共轉(zhuǎn)染DLEU2過表達(dá)質(zhì)粒與miR-30d-5p mimics)。轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，放入含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2qRT-PCR檢測DLEU2、miR-30d-5p的表達(dá) 取凍存TSCC組織及癌旁組織標(biāo)本，剪碎后研磨，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，使用RNA提取試劑盒提取組織總RNA。細(xì)胞RNA提取方法：收集各組轉(zhuǎn)染后TSCC Tca8113細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后提取細(xì)胞總RNA。核酸微量檢測儀檢測RNA濃度與純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃ 5min循環(huán)1次，95℃ 30 s循環(huán)38次，60℃ 30 s循環(huán)38次，72℃ 30 s循環(huán)38次。每個樣品均設(shè)置3個復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計算DLEU2、miR-30d-5p的相對表達(dá)量。

1.2.3MTT比色法檢測細(xì)胞增殖 取轉(zhuǎn)染后各組Tca8113細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105個/ml，以每孔1×105個細(xì)胞的密度接種于96孔板，分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時各孔分別加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，室溫孵育4 h，棄上清，分別加入150 μl DMSO溶液，振蕩10 min，放入酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值(OD)，檢測波長為490 nm，每組均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組對數(shù)生長期Tca8113細(xì)胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml，以每孔1×105個細(xì)胞的密度接種于6孔板，加入100 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μl濃度為250 ng/L的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)與濃度為250 ng/L的碘化丙啶(PI)5 μl，室溫避光孵育20 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western印跡檢測CyclinD1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 取轉(zhuǎn)染后各組Tca8113細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加入100 μl細(xì)胞裂解液，4℃條件下裂解30 min，4℃條件下12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min提取蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，以每泳道30 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應(yīng)，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入蛋白一抗(1∶1 000)，置于搖床孵育24 h(溫度為4℃)，TBST洗膜后再與二抗(1∶2 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影，用凝膠成像系統(tǒng)及Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.2.6雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?利用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測DLEU2的3′UTR存在miR-30d-5p的結(jié)合位點，用PCR將DLEU2與miR-30d-5p的結(jié)合位點序列進(jìn)行克隆，構(gòu)建重組熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-DLEU2-3′UTR(WT-DLEU2)；將DLEU2中預(yù)測結(jié)合片段改變，構(gòu)建pGL3-DLEU2-3′UTR-mut(MUT-DLEU2)突變體報告載體，用雙酶切電泳鑒定構(gòu)建載體。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將WT-DLEU2、MUT-DLEU2報告載體與miR-30d-5p mimics或陰性對照共轉(zhuǎn)染至TSCC Tca8113細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后根據(jù)熒光素酶檢測試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1DLEU2在TSCC組織和對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá) DLEU2在TSCC組織中的表達(dá)水平(0.27±0.02)較癌旁組織(0.82±0.08)明顯降低(P<0.05)。

2.2過表達(dá)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113增殖的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組Tca8113細(xì)胞中DLEU2表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染效率良好。過表達(dá)DLEU2可顯著降低細(xì)胞增殖活性(P<0.05)，表明DLEU2過表達(dá)可明顯抑制TSCC細(xì)胞增殖。與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組ca8113細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，p21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，表明DLEU2過表達(dá)可通過抑制CyclinD1蛋白表達(dá)及促進(jìn)p21蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制TSCC細(xì)胞增殖。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測過表達(dá)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113增殖蛋白表達(dá)的影響

表1 過表達(dá)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113增殖的影響

2.3過表達(dá)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113凋亡的影響 與pcDNA3.1組比較，過表達(dá)DLEU2后TSCC Tca8113細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，表明DLEU2過表達(dá)可促進(jìn)TSCC細(xì)胞凋亡。pcDNA3.1-DLEU2組TSCC Tca8113細(xì)胞中Bax表達(dá)水平較pcDNA3.1組顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。表明DLEU2過表達(dá)可通過促進(jìn)Bax表達(dá)及抑制Bcl-2表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)TSCC細(xì)胞凋亡。見圖2、圖3、表2。

圖2 過表達(dá)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113凋亡的影響

圖3 Western印跡檢測過表達(dá)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113凋亡蛋白表達(dá)的影響

表2 過表達(dá)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113凋亡的影響

2.4DLEU2靶向、調(diào)控miR-30d-5p 生物信息學(xué)方法檢測得出miR-30d-5p可能是DLEU2的直接作用靶點，見圖4。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治隹芍?，與miR-NC組比較，miR-30d-5p過表達(dá)可明顯降低WT-DLEU2野生型組細(xì)胞熒光素酶活性(P<0.05)；而MUT-DLEU2突變型組miR-30d-5p過表達(dá)后細(xì)胞熒光素酶活性與陰性對照相比無明顯變化(P>0.05)，見表3。表明DLEU2能夠結(jié)合miR-30d-5p而影響其活性。轉(zhuǎn)染si-DLEU2的Tca8113細(xì)胞中miR-30d-5p表達(dá)水平(1.17±0.10)顯著高于轉(zhuǎn)染si-NC(0.88±0.09，P<0.05)，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DLEU2后miR-30d-5p的表達(dá)(0.53±0.05)明顯降低(P<0.05)。表明DLEU2可通過吸附miR-30d-5p而負(fù)向調(diào)節(jié)其表達(dá)。

圖4 DLEU2靶向miR-30d-5p

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.5過表達(dá)miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113增殖的影響 共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DLEU2與miR-30d-5p mimics后Tca8113細(xì)胞增殖活性較pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組明顯升高(P<0.05)，促進(jìn)CyclinD1表達(dá)(P<0.05)，明顯抑制p21表達(dá)(P<0.05)。表明過表達(dá)miR-30d-5p可逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113增殖的抑制作用。見圖5，表4。

1～2：pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組、pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p組，下圖同圖5 過表達(dá)miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113增殖蛋白表達(dá)的影響

表4 過表達(dá)miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113增殖的影響

2.6過表達(dá)miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113凋亡的影響 相較于pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組，pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p組Tca8113細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)，見表5、圖6。表明過表達(dá)miR-30d-5p可逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113凋亡的促進(jìn)作用。

圖6 過表達(dá)miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113凋亡蛋白表達(dá)的影響

表5 過表達(dá)miR-30d-5p能逆轉(zhuǎn)DLEU2對TSCC細(xì)胞Tca8113凋亡的影響

3 討 論

晚期TSCC患者生存率極低，由于舌組織富含大量血管及淋巴管導(dǎo)致患者常伴有局部擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量〔8〕。研究表明miRNA與TSCC發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，但仍有部分miRNA對TSCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響尚未可知〔9〕。LncRNA可作為miRNA的海綿分子競爭性吸附其與靶基因的結(jié)合位點進(jìn)而間接調(diào)控靶基因表達(dá)從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)進(jìn)程〔10〕。

DLEU2在胰腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默DLEU2表達(dá)后可通過上調(diào)miR-455表達(dá)進(jìn)而抑制胰腺癌細(xì)胞增殖及遷移〔11〕。DLEU2屬于miR-15a/16-1簇的宿主基因，其可通過調(diào)控miR-15a/16-1表達(dá)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄核因子(NF)-κB信號通路進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔12〕。這可能由于腫瘤細(xì)胞惡性程度及組織部位不同導(dǎo)致DLEU2的表達(dá)及其作用效果不同。研究報道指出DLEU2缺失可導(dǎo)致慢性淋巴細(xì)胞性白血病及其他腫瘤發(fā)生〔13～15〕。本研究結(jié)果說明DLEU2在TSCC發(fā)生過程中可能發(fā)揮抑癌基因作用。研究報道指出細(xì)胞增殖周期中CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞增殖信號的主要蛋白，其可激活CDK4/CDK6進(jìn)而正向調(diào)控細(xì)胞周期，p21是CDK抑制因子并可抑制CDK4/CDK6激活進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖〔16〕。細(xì)胞凋亡過程中涉及多種基因調(diào)控，其中Bax、Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要基因，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax是促凋亡基因，Bax表達(dá)水平升高可抑制Bcl-2的作用進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡〔17〕。本研究結(jié)果提示DLEU2可能作為TSCC靶向治療的潛在靶點。miR-30d-5p在宮頸癌患者外泌體中呈高表達(dá)，并可作為臨床診斷宮頸癌的重要輔助標(biāo)志物〔18〕。miR-30d-5p在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞中均呈低表達(dá)，其可通過靶向抑制CCNE2基因表達(dá)進(jìn)而減弱非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖活力〔19〕。分析原因可能為不同腫瘤組織或細(xì)胞中miR-30d-5p的表達(dá)不同。研究表明前列腺癌組織及細(xì)胞中miR-30d-5p的表達(dá)水平均顯著降低，上調(diào)miR-30d-5p表達(dá)可通過靶向調(diào)控NT5E表達(dá)進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移〔20〕。本研究結(jié)果提示DLEU2可通過抑制miR-30d-5p表達(dá)而促進(jìn)TSCC細(xì)胞凋亡并抑制其增殖進(jìn)而參與TSCC發(fā)生及發(fā)展過程。