不同劑量咪達(dá)唑侖通過上調(diào)miR-33a-5p抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、凋亡

趙利芳 楊建功

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

1 材料與方法

1.1材料 膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG139和U87購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibico公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG139和U87用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，分別用終濃度為0、15、30、60 μg/ml的Mida處理，作為Mida組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作空白對照(NC)組，將miR-con、miR-33a-5p轉(zhuǎn)染至SHG139和U87細(xì)胞，記為miR-con組、miR-33a-5p組；將anti-miR-con和anti-miR-33a-5p分別轉(zhuǎn)染至60 μg/ml Mida處理的SHG139和U87細(xì)胞中，記為Mida+anti-miR-con組、Mida+anti-miR-33a-5p組。

1.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-33a-5p和同源盒蛋白(Six)1 mRNA表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-33a-5p和Six1分別以U6和β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴增，相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.4Western印跡檢測Six1、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3的表達(dá) 提取各組總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，曝光顯影，定影，分析蛋白條帶的吸光度，計算蛋白表達(dá)水平。

1.5MTT檢測細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞活性(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.6克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力 將轉(zhuǎn)染后的各組SHG139、U87細(xì)胞以每孔200個細(xì)胞接種于6孔板，每隔2 d換液1次，并觀察細(xì)胞形態(tài)，克隆形成以絕大多數(shù)單個細(xì)胞數(shù)大于50為止?？寺⌒纬珊笥昧姿猁}緩沖液(PBS)洗滌，再用4%的多聚甲醛室溫固定30 min，吸去固定液用吉姆薩染液染色10 min，水洗風(fēng)干后，顯微鏡觀察下拍照計數(shù)。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，依據(jù)試劑盒說明書操作，加入Annexin V-FITC和PI避光孵育，最后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.8熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-33a-5p對Six1的靶向調(diào)控 構(gòu)建Six1的3′UTR熒光素酶野生型和突變型載體(WT-Six1和MUT-Six1)，將其分別與miR-con和miR-33a-5p共轉(zhuǎn)染至SHG139和U87細(xì)胞中，依據(jù)說明書要求，檢測熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.00軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同劑量的Mida對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 隨Mida濃度升高，膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG139和U87的細(xì)胞活性降低，細(xì)胞克隆形成能力也降低，PCNA蛋白表達(dá)水平降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

1～4:Mida 0.0 μg/ml組、Mida 15.0 μg/ml組、Mida 30.0 μg/ml組、Mida 60.0 μg/ml組；圖3、圖4同圖1 Western印跡檢測PCNA表達(dá)

表1 不同劑量的Mida對膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性和克隆形成的影響

2.2不同劑量的Mida對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響 隨著Mida濃度升高，膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG139和U87的凋亡率升高，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表2，圖3。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率

表2 不同劑量的Mida對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Western印跡檢測Cleaved caspase-3表達(dá)

2.3不同劑量的Mida對膠質(zhì)瘤細(xì)胞對miR-33a-5p和Six1表達(dá)的影響 隨著Mida濃度升高，膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG139和U87中miR-33a-5p表達(dá)水平升高，Six1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 Western印跡檢測Six1蛋白表達(dá)

表3 不同劑量Mida對膠質(zhì)瘤細(xì)胞對miR-33a-5p 和Six1 表達(dá)的影響

2.4miR-33a-5p靶向調(diào)控Six1 TargetScan預(yù)測到Six1與miR-33a-5p存在結(jié)合位點(圖5)。WT-Six1與miR-33a-5p組共轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG139和U87的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表4。miR-33a-5p組Six1表達(dá)水平顯著低于miR-con組；anti-miR-33a-5p組Six1表達(dá)水平顯著高于anti-miR-con組(P<0.05)。見圖6、表5。

圖5 miR-33a-5p與Six1 3′UTR的靶向序列

表4 熒光素酶實驗驗證miR-33a-5p 靶向調(diào)控

1～4：miR-con組、miR-33a-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-33a-5p組圖6 miR-33a-5p靶向調(diào)控Six1表達(dá)

表5 miR-33a-5p 調(diào)控Six1表達(dá)

2.5轉(zhuǎn)染miR-33a-5p抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 與miR-con組相比，miR-33a-5p組細(xì)胞活性和克隆形成能力降低，細(xì)胞凋亡率升高，Six1、PCNA蛋白表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7、表6、表7。

1～3：NC組、miR-con組、miR-33a-5p組圖7 Western印跡檢測Six1、PCNA、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

表6 轉(zhuǎn)染miR-33a-5p 抑制膠質(zhì)瘤SHG139細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

表7 轉(zhuǎn)染miR-33a-5p 抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2.6干擾miR-33a-5p部分逆轉(zhuǎn)Mida對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用 與NC組相比，Mida組細(xì)胞活性和克隆形成能力降低，細(xì)胞凋亡率升高，Six1、PCNA表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高(P<0.05)；與Mida+anti-miR-con組相比，Mida+anti-miR-33a-5p組細(xì)胞活性和克隆形成能力升高，細(xì)胞凋亡率降低，Six1、PCNA表達(dá)水平升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表8、表9、圖8。

表8 轉(zhuǎn)染anti-miR-33a-5p部分逆轉(zhuǎn)Mida抑制膠質(zhì)瘤SHG139細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

表9 轉(zhuǎn)染anti-miR-33a-5p部分逆轉(zhuǎn)Mida抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

1～4：NC組、Mida組、Mida+anti-miR-con組、Mida+anti-miR-33a-5p組圖8 轉(zhuǎn)染anti-miR-33a-5p部分逆轉(zhuǎn)Mida抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

3 討 論

膠質(zhì)瘤是成人神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其高侵襲性、高復(fù)發(fā)性與不良預(yù)后相關(guān)，究報道m(xù)RNA可影響膠質(zhì)瘤的進(jìn)展〔10，11〕。研究報道上調(diào)miR-33a-5p表達(dá)通過調(diào)節(jié)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號傳導(dǎo)可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并增加細(xì)胞凋亡，還能增強對雷公藤紅素的敏感性〔12〕。miR-33a通過調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔13〕。本實驗結(jié)果說明高表達(dá)miR-33a-5p可抑制膠質(zhì)瘤的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PCNA是DNA合成所必需的的核蛋白，可作為細(xì)胞增殖指標(biāo)，有研究報道PCNA在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)增加〔14〕。Caspase-3是調(diào)控凋亡的核心蛋白酶，Cleaved caspase-3是Caspase-3活化過程中產(chǎn)生的，其表達(dá)可反映細(xì)胞凋亡〔15〕。本實驗說明miR-33a-5p可抑制膠質(zhì)瘤的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Six1定位于14α23染色體，是大腦發(fā)育中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤細(xì)胞的遷襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)〔16〕。有研究報道Six1在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，與患者預(yù)后不良相關(guān)〔17〕。本實驗提示miR-33a-5p可能通過Six1影響膠質(zhì)瘤的增殖、凋亡。

腫瘤治療除了手術(shù)切除，一些麻醉藥也可有效抑制腫瘤活性。Mida是一種常用的麻醉藥，研究發(fā)現(xiàn)Mida通過介導(dǎo)miRNA-520d調(diào)控STAT3通路，可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡〔4〕。Mida還可通過下調(diào)USP22抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖〔18〕。此外，Mida可有效調(diào)節(jié)急性顱腦損傷患者免疫平衡、改善應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)腦組織〔19〕。本實驗結(jié)果說明Mida可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能通過調(diào)控miR-33a-5p及Six1影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。

綜上所述，Mida可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機制可能是與miR-33a-5p、Six1表達(dá)水平相關(guān)，將為膠質(zhì)瘤的治療提供新思路和新靶點。